Звездчатые клетки печени развиваются из. Могут ли перисинусоидальные клетки быть региональными стволовыми клетками печени? Изучение влияния клеток Ито печени на стволовые клетки

Проведен ультраструктурный, иммуногистохимический и морфометрический анализ популяции звездчатых клеток печени в динамике развития фиброза и цирроза инфекционно-вирусного генеза. Выявлена фиброгенная активация звездчатых клеток печени, которая характеризуется редукцией липидных капель и синхронной экспрессией фибробластоподобных характеристик – позитивной иммуногистохимической реакцией на гладкомышечный α-актин, гиперплазией гранулярной цитоплазматической сети и перицеллюлярным формированием многочисленных коллагеновых фибрилл. Показано, что, несмотря на прогрессирующее уменьшение численной плотности липидосодержащих звездчатых клеток при развитии фиброза, сохраняется необходимость поддержания функции депонирования ретиноидов – при циррозе печени в фиброзных септах и внутри долек обнаружены липидосодержащие звездчатые клетки. Сделано заключение, что звездчатые клетки печени – полиморфная гетерогенная популяция с широким спектром функциональной активности.

фиброгенез

звездчатые клетки печени

ультраструктура

иммуногистохимия

1. Balabaud C., Bioulac-Sage P., Desmouliere A. The role of hepatic stellate cells in liver regeneration // J. Hepatol. – 2004. – Vol. 40. – P. 1023–1026.

2. Brandao D.F., Ramalho L.N.Z., Ramalho F.S. Liver cirrhosis and hepatic stellate cells // Acta Cirúrgica Brasileira. – 2006. – Vol. 21. – P. 54–57.

3. Desmet V.J., Gerber M., Hoofnagle J.H. Classification of chronic hepatitis: Diagnosis, grading and staging // Hepatology. – 1994. – Vol. 19. – P. 1523–1520.

4. Gabele E., Brenner D.A., Rippe R.A. Liver fibrosis: Signals leading to the amplification of the fibrogenic hepatic stellate cell // Front. Biosc. – 2003. – Vol. 8. – P. 69–77.

5. Geerts A. On the origin of stellate cells: mesodermal, endodermal or neuro-ectodermal? // J. Hepatol. – 2004. – Vol. 40. – P. 331–334.

6. Gutierrez-Ruiz M.C., Gomez-Quiroz L.E. Liver fibrosis: searching for cell model answers // Liver Intern. – 2007. – Vol. 10. – P. 434–439.

7. Kisseleva T., Brenner D.A. Role of hepatic stellate cells in fibrogenesis and the reversal of fibrosis // J. Gastroenterol. Hepatol. – 2007. – Vol. 22. – P. S73–S78.

8. Ryder S.D. Progression of hepatic fibrosis in patients with hepatitis C: a prospective repeat liver biopsy study // Gut. – 2004. – Vol. 53. – P. 451–455.

9. Schuppan D., Afdhal N.H. Liver cirrhosis // Lancet. – 2008. – Vol. 371. – P. 838–851.

10. Senoo H. Structure and function of hepatic stellate cells // Med. Electron. Microsc. – 2004. – Vol. 37. – P. 3–15.

Звездчатые клетки печени (липоциты, клетки Ито, жиронакапливающие клетки печени) локализуются в пространствах Диссе между гепатоцитами и эндотелиальной выстилкой синусоидов и играют ведущую роль в регуляции гомеостаза ретиноидов, депонируя до 80 % витамина А . Пространство Диссе является зоной наибольшей функциональной ответственности, обеспечивая транссинусоидальный обмен. С помощью экспериментальных моделей и в культуре клеток продемонстрировано, что звездчатые клетки печени дифференцируются по крупным цитоплазматическим липидным каплям, содержащим витамин А; этот фенотип интерпретирован как «покоящийся».

Все большее значение придается роли звездчатых клеток в развитии фиброза и цирроза печени. При получении фиброгенных стимулов «покоящиеся» звездчатые клетки «трансдифференцируются», приобретая миофибробластоподобный фенотип, и начинают продуцировать коллаген, протеогликаны и другие компоненты экстрацеллюлярного матрикса . Фиброз на уровне центральных вен, синусоидов или портальных сосудов лимитирует нормальную гемодинамику печени, что приводит к сокращению метаболически эффективной паренхимы, в дальнейшем - портальной гипертензии и порто-системному шунтированию. Накопление соединительной ткани в пространствах Диссе нарушает нормальный метаболический трафик между кровью и гепатоцитами, препятствуя клиренсу циркулирующих макромолекул, изменяя межклеточные взаимодействия и приводя к дисфункции клеток печени .

Существуют противоречивые мнения относительно того, способны ли активированные звездчатые клетки возвращаться к покоящемуся фенотипу. Получены данные о том, что фиброгенные звездчатые клетки печени могут частично нивелировать процесс активации, например, при воздействии ретиноидов или при взаимодействии с компонентами экстрацеллюлярного матрикса, в том числе с фибриллярным коллагеном I типа или компонентами базальной мембраны . Решение этого вопроса лежит в основе проблемы обратимости фиброза и разработки терапевтических подходов к лечению цирроза печени.

Цель исследования - провести комплексное изучение структурно-функциональных особенностей звездчатых клеток печени в динамике фиброзных изменений на модели хронической HCV-инфекции.

Материал и методы исследования

Проведено комплексное светооптическое, электронно-микроскопическое и морфометрическое исследование биоптатов печени при хронической HCV-инфекции на различных стадиях фиброзных изменений (100 образцов, разделенных на 4 равные группы по степени выраженности фиброза). Важно отметить, что липидосодержащие звездчатые клетки лучше всего визуализируются на полутонких срезах, фиброгенные звездчатые клетки - только на ультратонких срезах либо с помощью иммуногистохимической визуализации.

Образцы печени фиксировали в охлажденном до 4 °С 4 %-м растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,2-7,4); парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином в комбинации с реакцией Перлса, по ван Гизону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили ШИК-реакцию. Полутонкие срезы окрашивали реактивом Шиффа и азуром II. Исследование проводили в универсальном микроскопе Leica DM 4000B (Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры Leica DFC 320 и компьютерной программы Leica QWin. Ультратонкие срезы, контрастированные уранилацетатом и цитратом свинца, исследовали в электронном микроскопе «JEM 1010» при ускоряющем напряжении 80 кВт.

Стадию фиброза печени определяли по 4-балльной шкале, начиная от портального фиброза (I стадия) до цирроза с образованием порто-центральных васкуляризованных септ и нодулярной трансформацией паренхимы . Звездчатые клетки печени и другие матрикс-продуцирующие клеточные элементы выявляли в динамике развития фиброза по экспрессии гладкомышечного α-актина.

Экспрессию гладкомышечного α-актина в матрикс-продуцирующих клетках печени тестировали с помощью двухшагового непрямого иммунопероксидазного метода со стрептавидин-биотиновой системой визуализации продуктов реакции с негативным контролем. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к гладкомышечному α-актину (NovoCastra Lab. Ltd, Великобритания) в разведении 1:25; в качестве вторичных антител - универсальные биотинилированные антитела. Продукты иммуногистохимической реакции визуализировали с помощью диаминобензидина, затем срезы докрашивали гематоксилином Майера. Численную плотность липидосодержащих звездчатых клеток оценивали на полутонких срезах в единице поля зрения, равной 38000 мкм2. При статистической обработке данных применяли критерий Стьюдента; различия сравниваемых параметров считали значимыми, если вероятность ошибки P была меньше 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

При минимальных фиброзных изменениях печени пациентов с хроническим гепатитом С обнаруживается, как правило, достаточно большое количество звездчатых клеток, которые хорошо видны лишь на полутонких и ультратонких срезах и дифференцируются в пространствах Диссе по наличию в цитоплазме крупных липидных капель. Превращение звездчатых клеток из «покоящихся», содержащих ретиноиды, в фиброгенные сопровождается постепенным уменьшением числа липидных капель. В связи с этим истинное количество звездчатых клеток можно определить, используя комплексное электронно-микроскопическое и иммуногистохимическое исследование.

На начальных стадиях фиброза (0, I) при хроническом гепатите С при изучении полутонких срезов популяция звездчатых клеток печени отличалась выраженным полиморфизмом - резко варьировали размеры, форма, количество липидных капель и их тинкториальные свойства: обращали на себя внимание различия в осмиофильности липидосодержащего материала в разных клетках. Численная плотность звездчатых клеток печени, визуализируемых в препаратах по наличию цитоплазматических липидных капель, составляла 5,01 ± 0,18 на единицу поля зрения.

Особенности ультраструктуры звездчатых клеток связаны с гетерогенностью электронной плотности липидных капель не только в пределах одной клетки, но и между разными липоцитами: на фоне электронно-прозрачного липидного субстрата выделялся более осмиофильный маргинальный ободок; кроме того, резко полиморфны ядра, варьировалась длина цитоплазматических отростков. Среди ультраструктурных особенностей липидосодержащих звездчатых клеток, наряду с присутствием липидных капель, можно отметить очень малое количество цитоплазматического матрикса, бедного мембранными органеллами, в том числе митохондриями, в связи с чем, по-видимому, данный фенотип липоцитов называют «покоящимся» или «пассивным» .

На стадиях фиброза II и III ультраструктура большинства звездчатых клеток приобретала так называемый смешанный, или переходный, фенотип - одновременное присутствие морфологических признаков и липидосодержащей и фибробластоподобной клетки. В таких липоцитах ядра имели глубокие инвагинации нуклеолеммы, более крупное ядрышко, увеличенный объем цитоплазмы, сохраняющей липидные капли. Одновременно резко возрастало количество митохондрий, свободных рибосом, полисом и канальцев гранулярной цитоплазматической сети. Как правило, имелся мембранный контакт липидных капель и митохондрий, свидетельствующий об «утилизации» липидов. Во многих клетках деградация липидных капель осуществлялась путем формирования аутофагосом, затем элиминирующихся путем экзоцитоза. В некоторых случаях отмечалась пролиферация звездчатых клеток смешанного фенотипа.

Матрикс-продуцирующие звездчатые клетки, наиболее многочисленные на стадии цирроза печени, характеризовались полным отсутствием липидных гранул, отростчатой фибробластоподобной формой, развитым белоксинтезирующим компартментом и формированием в цитоплазме контрактильных фибриллярных структур; перицеллюлярно в пространствах Диссе локализовались многочисленные пучки коллагеновых фибрилл со специфичной поперечной исчерченностью.

В целом, при прогрессировании хронического гепатита С, сопровождающегося внутридольковым перисинусоидальным фиброгенезом, имели место морфологические признаки активации звездчатых клеток печени, превращение их из так называемых «пассивных», накапливающих витамин А, в клетки фиброгенные и пролиферирующие.

На стадии трансформации в цирроз печени происходило значительное уменьшение численной плотности липидосодержащих звездчатых клеток, свидетельствующее об их фиброгенной трансформации. Однако при сформированном циррозе печени в единичных случаях встречались участки паренхимы печени с перисинусоидальными липидосодержащими звездчатыми клетками. Кроме того, в одном образце в перипортальной фиброзной ткани обнаружены многочисленные липоциты, что, вероятно, свидетельствует о важной роли звездчатых клеток в метаболизме ретиноидов в организме даже на стадии цирроза органа. Кроме того, по-видимому, звездчатые клетки имеют ряд других функций, они обнаружены и во внепеченочных органах, таких как поджелудочная железа, легкие, почки и кишечник, и существует мнение о том, что печеночные и внепеченочные звездчатые клетки формируют диссеминированную систему звездчатых клеток организма, аналогично APUD-системе . Например, несмотря на ассоциацию фиброгенных звездчатых клеток с циррозом печени, их активация может играть благоприятную роль в случаях острого повреждения, потому что в результате формируется соответствующий стромальный контур для регенерации паренхиматозных клеток.

Степень выраженности перигепатоцеллюлярного фиброза при хронической HCV-инфекции, по данным морфометрического анализа, имела достоверную обратную корреляцию с численной плотностью липидосодержащих звездчатых клеток - на стадии фиброза III и при циррозе органа она составляла 0,20 ± 0,03 в единице поля зрения, что достоверно меньше (р < 0,05), чем на стадиях фиброза 0 - I (5,01 ± 0,18) и II (2,02 ± 0,04).

Фиброгенная активность матрикс-продуцирующих клеток печени тестирована нами с помощью иммуногистохимического исследования по экспрессии гладкомышечного альфа-актина. Продукты иммуногистохимической реакции различной интенсивности обнаруживались в цитоплазме активированных звездчатых клеток, локализующихся внутри печеночных долек. Особенно значительная экспрессия гладкомышечного α-актина отмечалась в цитоплазме фибробластов и миофибробластов портальных зон, гладкомышечных клетках сосудов и миофибробластах вокруг центральных вен.

Большинство данных о клеточных механизмах фиброгенеза получено в исследованиях, выполненных на звездчатых клетках печени, однако очевидно, что различные матрикс-продуцирующие клетки (каждая с определенной локализацией, иммуногистохимическим и ультраструктурным фенотипом) вносят свой вклад в развитие фиброза печени . Они включают в себя фибробласты и миофибробласты портальных трактов, гладкомышечные клетки сосудов и миофибробласты вокруг центральных вен, активизирующиеся в условиях хронического повреждения печени.

Заключение

Продемонстрирована роль звездчатых клеток печени в развитии фиброза органа при хроническом гепатите С. При прогрессировании фиброза значимо уменьшается численная плотность липидосодержащих звездчатых клеток, при этом часть популяции сохраняет так называемый «покоящийся» фенотип для осуществления метаболической функции. «Миофибробластоподобные» звездчатые клетки печени в состоянии фиброгенной активации характеризуются следующими структурно-функциональными особенностями: уменьшением числа и последующим исчезновением липидных капель, гиперплазией гранулярной цитоплазматической сети и митохондрий, очаговой пролиферацией, иммуногистохимической экспрессией фибробластоподобных характеристик, в том числе гладкомышечного α-актина, и формированием перицеллюлярных коллагеновых фибрилл в пространствах Диссе.

Таким образом, звездчатые клетки печени представляют собой не статичную, а динамичную популяцию, принимающую непосредственное участие в ремоделировании внутридолькового перигепатоцеллюлярного матрикса.

Рецензенты:

Вавилин В.А., д.м.н., профессор, зав. лабораторией метаболизма лекарств НИИ молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения РАМН, г. Новосибирск;

Кливер Е.Э., д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии Новосибирского НИИ патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина Минздравсоцразвития РФ, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 15.08.2011.

Библиографическая ссылка

Постникова О.А., Непомнящих Д.Л., Айдагулова С.В., Виноградова Е.В., Капустина В.И., Нохрина Ж.В. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЗВЕЗДЧАТЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ В ДИНАМИКЕ ФИБРОЗА // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 10-2. – С. 359-362;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=28817 (дата обращения: 30.01.2020). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»

Вверху - схематическое изображение клетки Ито (HSC) по соседству с ближайшими гепатоцитами (PC), ниже синусоидальных эпителиальных клеток печени (EC). S - синусоид печени; KC - клетка Купфера. Внизу слева - клетки Ито в культуре под световым микроскопом. Внизу справа - электронная микроскопия позволяет разглядеть многочисленные жировые вакуоли (L) клеток Ито (HSC), в которых хранятся ретиноиды.

Клетки Ито (синонимы: звёздчатая клетка печени , жирозапасающая клетка , липоцит , англ. Hepatic Stellate Cell, HSC, Cell of Ito, Ito cell ) - перициты , содержащиеся в , способные функционировать в двух различных состояниях - спокойном и активированном . Активированные клетки Ито играют главную роль в - формировании рубцовой ткани при повреждениях печени .

В неповрежденной печени, звёздчатые клетки находятся в спокойном состоянии . В таком состоянии клетки имеют несколько выростов, охватывающих синусоидный капилляр . Другой отличительной чертой клеток является присутствие в их цитоплазме запасов витамина А (ретиноида) в форме жировых капель. Спокойные клетки Ито составляют 5-8 % численности всех клеток печени.

Выросты клеток Ито подразделяются на два типа: перисинусоидальные (субэндотелиальные) и интергепатоцеллюлярные . Первые выходят из тела клетки и простираются вдоль поверхности синусоидного капилляра , охватывая его тонкими пальцеобразными ответвлениями. Перисинусоидальные выросты покрыты короткими ворсинками и имеют характерные длинные микровыбросы, простирающиеся ещё дальше по поверхности эндотелиальной трубки капилляра. Интергепатоцеллюлярные выросты, преодолев пластинку гепатоцитов и достигнув соседнего синусоида, делятся на несколько перисинусоидальных выростов. Таким образом, клетка Ито в среднем охватывает чуть больше двух соседних синусоидов.

При повреждении печени клетки Ито переходят в активированное состояние . Активированный фенотип характеризуется пролиферацией, хемотаксисом , сокращаемостью, потерей запасов ретиноида и образованием клеток, напоминающих миофибробластные . Активированные звёздчатые клетки печени также демонстрируют повышенное содержание новых генов , таких как, ICAM-1 , хемокины и цитокины . Активация свидетельствует о начале ранней стадии фиброгенеза и предшествует повышенному продуцированию ЕСМ -белков. Финальная стадия заживления печени характеризуется усиленным апоптозом активированных клеток Ито, вследствие чего их количество резко сокращается.

Для визуализации клеток Ито при микроскопии применяется окрашивание хлоридом золота . Установлено также, что надёжным маркером для дифференциации этих клеток от других миофибробластов является экспрессия ими белка рилин .

История [ | ]

В 1876 году Карл Фон Купфер описал клетки, названные им «Sternzellen» (звёздчатые клетки). При окрашивании оксидом золота, в цитоплазме клеток были заметны включения. Ошибочно сочтя их фрагментами эритроцитов, захваченных путём фагоцитоза, Купфер в 1898 году пересмотрел свои взгляды о «звёздчатой клетке» как об отдельном типе клеток и отнес их в разряд фагоцитов . Однако в последующие годы регулярно появлялись описания клеток, похожих на Купферовские «звёздчатые клетки». Им присваивались различные названия: интерстициальные клетки, парасинусоидные клетки, липоциты, перициты. Роль этих клеток оставалась загадкой на протяжении 75 лет, пока профессор (Toshio Ito) не обнаружил в перисинусоидальном пространстве печени человека некие клетки, содержащие вкрапления жира. Ито назвал их «shibo-sesshu saibo» - жиропоглощающие клетки. Поняв, что вкрапления были жиром, выработанным клетками из гликогена , он сменил название на «shibo-chozo saibo» - жирозапасающие клетки. В

Основным источником эндотоксина в организме является грамотрицательная флора кишечника. В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что печень является основным органом, осуществляющим клиренс эндотоксина . Эн дотоксин захватывается в первую очередь клет ками Купфера (КК), взаимодействуя с мембранным рецептором CD 14. С рецептором может связываться как сам липополисахарид (ЛПС), так и его комплекс с липид А-связывающим бел ком плазмы . Взаимодействие ЛПС с макрофагами печени запускает каскад реакций, в основе которых лежат выработка и высвобождение цитокинов и других биологически активных медиаторов .

Имеется много публикаций о роли макрофа гов печени (КК) в захвате и клиренсе бактериального ЛПС, однако взаимодействие эндотелия с другими мезенхимальными клетками, в частности, с перисинусоидальными клетками Ито, практически не изучено.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Белым крысам-самцам массой 200 г внутрибрюшинно в 1 мл стерильного физиологического раствора вводили высокоочищенный лиофилизированный ЛПС Е. coli штамм 0111 в дозах 0.5, 2.5, 10, 25 и 50 мг/кг. На сроках 0.5, 1, 3, 6, 12, 24, 72 ч и 1 нед под наркозом извлекали внутренние органы и помещали их в забуференный 10% формалин. Материал заливали в парафиновые блоки. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали иммуногистохимическим стрептавидин-биотиновым методом антителами к десмину , α - гладко-мышечному актину (А-ГМА) и ядерному антиге ну пролиферирующих клеток (PCNA , " Dako "). Десмин использовали в качестве маркера перисинусоидальных клеток Ито, А-ГМА - в качест ве маркера миофибробластов , PCNA - пролиферирующих клеток. Для выявления эндотоксина в клетках печени использовали очищенные анти- R е-гликолипидные антитела (Институт общей и клинической патологии КДО, Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При дозировке 25 мг/кг и выше через 6 ч после введения ЛПС наблюдали шок со смертельным исходом. Острое воздействие ЛПС на ткань печени вызывало активацию клеток Ито, которая проявлялась увеличением их количества. Число десминположительных клеток увеличивалось с 6 ч после инъекции ЛПС и достигало максимума к 48-72 ч (рис. 1, а, б).

Рис. 1. Срезы печени крысы, обработанные LSAB -ме-ченными антителами к десмину (а, б) и α - гладкомышечному актину (в), х400 (а, б), х200 (в).

а - до введения эндотокси на, единичные десминположительные клетки Ито в перипортальной зоне; б - 72 ч после введения эндотоксина: многочисленные десминположительные клетки Ито; в - 120 ч после введения эн дотоксина: α - гладкомышечный актин присутствует толь ко в гладкомышечных клет ках сосудов.

Через 1 нед число десминположительных клеток снижалось, но ос тавалось выше контрольных показателей. При этом ни в одном случае мы не наблюдали появления А-ГМА-положительных клеток в синусои дах печени. Внутренним положительным контролем при окрашивании антителами к А-ГМА служило выявление гладкомышечных клеток кро веносных сосудов портальных трактов, содержащих А-ГМА (рис. 1, в). Следовательно, несмотря на увеличение количества клеток Ито, однократ ное воздействие Л ПС не приводит к трансформации (трансдифференцировке ) их в миофибробласты .

Рис. 2. Срезы печени крысы, обработанные LSAB -меченными антителами к PCNA . а - до введения эндотоксина: единичные пролиферирующие гепатоциты , х200; б - 72 ч после введения эндотоксина: многочисленные пролиферирующие гепатоциты ,х400.

Увеличение количества десминположительных клеток начиналось в пределах портальной зоны. С 6 ч до 24 ч после введения ЛПС перисинусоидальные клетки обнаруживались только вокруг портальных трактов, т.е. в 1-й зоне ацинуса . На сроках 48-72 ч, когда наблюдалось мак симальное количество десминположительных кле ток, они появлялись и в других зонах ацинуса ; тем не менее большая часть клеток Ито располагалась все же перипортально .

Возможно, это связано с тем, что перипортально расположенные КК первыми захватывают эндотоксин, поступающий из кишечника по воротной вене либо из системного кровотока. Активированные КК вырабатывают широкий спектр цитокинов , которые, как предполагается, запускают активацию клеток Ито и трансдифференцировку их в миофибробласты . Очевидно, именно поэтому первыми на выброс цитокинов реагируют клетки Ито, расположенные вблизи активированных макрофагов печени (в 1-й зоне ацинуса ). Однако в нашем исследовании мы не наблюдали их трансдифференцировки в миофибробласты , и это позволяет предположить, что выделяемые КК и гепатоцитами цитокины могут служить фактором, поддерживающим уже начавшийся процесс трансдифференцировки , но они, вероятно, не способны запускать его при однократном воздействии ЛПС на печень.

Усиление пролиферативной активности клеток также наблюдалось преимущественно в 1-й зоне ацинуса . Вероятно, это говорит о том, что все (или практически все) процессы, направленные на ауто - и паракринную регуляцию межклеточных взаимодействий, протекают в перипортальных зонах. Увеличение количества пролиферирующих клеток наблюдали с 24 ч после введения ЛПС; число положительных клеток увеличивалось вплоть до 72 ч (максимум пролиферативной активности, рис. 2, а, б). Пролиферировали как гепатоциты , так и синусоидные клетки. Однако окрашивание на PCNA не дает возможности идентифицировать тип пролифери рующих синусоидных клеток. По данным литературы, действие эндотоксина приводит к увеличению количества КК . Полагают, что это про исходит как за счет пролиферации макрофагов печени, так и за счет миграции моноцитов издругих органов . Выбрасываемые КК цитокины могут повышать пролиферативную способность клеток Ито. Поэтому логично предположить, что пролиферирующие клетки представлены перисинусоидальными клетками Ито. Зарегистрированное нами увеличение их числа необходимо, по-видимому, для повышения синтеза ростовых факторов и восстановления межклеточного матрикса в условиях повреждения. Это может быть одним из звеньев компенсаторно-восстановительных реакций печени, поскольку клетки Ито являются основным источником компонентов межклеточного матрикса, фактора стволовых клеток и фактора роста гепатоцитов , которые участвуют в репарации и дифференцировке эпителиальных клеток печени . Отсутст вие же трансформации клеток Ито в миофибробласты свидетельствует о том, что одного эпизода эндотоксиновой агрессии недостаточно для развития фиброза печени.

Таким образом, острое воздействие эндотоксина вызывает увеличение числа десминположительных клеток Ито, что является косвенным признаком повреждения печени. Количество перисинусоидальных клеток возрастает, видимо, в результате их пролиферации. Однократный эпизод эндотоксиновой агрессии вызывает обратимую активацию перисинусоидальных клеток Ито и не приводит к их трансдифференцировке в миофибробласты . В связи с этим можно предположить, что в механизмах активации и трансдифференцировки клеток Ито задействованы не только эндотоксин и цитокины , но и какие-то иные факторы межклеточных взаимодействий.

ЛИТЕРАТУРА

1. Маянский Д.Н., Виссе Э., Декер К. // Новые рубежи гепатологии . Новосибирск, 1992.

2. Салахов И.М., Ипатов А.И., Конев Ю.В., Яковлев М.Ю. // Успехи соврем, биол. 1998. Т. 118, Вып . 1. С. 33-49.

3. Яковлев М.Ю. // Казан. м ед. журн. 1988. № 5. С. 353-358.

4. Freudenberg N ., Piotraschke J ., Galanos C . et al . // Virchows Arch . [ B ]. 1992. Vol . 61. P . 343-349.

5. Gressner A . M . // Hepatogastronterology . 1996. Vol. 43. P. 92-103.

6. Schmidt C, Bladt F., Goedecke S. et al. // Nature. 1995. Vol. 373, N 6516. P. 699-702.

7. Wisse E., Braet F., Luo D. et al. // Toxicol . Pathol . 1996. Vol. 24, N 1. P. 100-111.

Ключевые слова

ПЕЧЕНЬ / ЗВЕЗДЧАТЫЕ КЛЕТКИ ИТО / МОРФОЛОГИЯ / ХАРАКТЕРИСТИКА / ВИТАМИН А / ФИБРОЗ / LIVER / HEPATIC STELLATE CELLS / MORPHOLOGY / CHARACTERISTIC / VITAMIN A / FIBROSIS

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы - Цыркунов В.М., Андреев В.П., Кравчук Р.И., Кондратович И.А.

Введение. Роль звездчатых клеток Ито (ЗКИ) определена как одна из ведущих в развитии фиброза в печени , однако прижизненная визуализация структуры ЗКИ в клинической практике использована минимально. Цель работы: представить структурно-функциональную характеристику ЗКИ по результатам цитологической идентификации прижизненных биоптатов печени . Материалы и методы. Применены классические методы световой и электронной микроскопии биоптатов и оригинальные методики с использованием ультратонких срезов, фиксации и окраски. Результаты. На фотоиллюстрациях световой и электронной микроскопии биоптатов печени пациентов с хроническим гепатитом С представлены структурные характеристики ЗКИ, находящихся на разных стадиях (покоя, активации) и в процессе трансформации в миофибробласты. Выводы. Применение оригинальных методов клинической морфологической идентификации и оценки функционального состояния ЗКИ повысит качество диагностики и прогнозирования фиброза печени .

Текст научной работы на тему «Клиническая Цитология печени: звездчатые клетки Ито»

УДК 616.36-076.5

КЛИНИЧЕСКАЯ ЦИТОЛОГИЯ ПЕЧЕНИ: ЗВЕЗДЧАТЫЕ КЛЕТКИ ИТО

Цыркунов В. М. ([email protected]), Андреев В. П. ([email protected]), Кравчук Р. И. ([email protected]), Кондратович И. А. ([email protected]) УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь

Цель работы: представить структурно-функциональную характеристику ЗКИ по результатам цитологической идентификации прижизненных биоптатов печени.

Материалы и методы. Применены классические методы световой и электронной микроскопии биопта-тов и оригинальные методики с использованием ультратонких срезов, фиксации и окраски.

Результаты. На фотоиллюстрациях световой и электронной микроскопии биоптатов печени пациентов с хроническим гепатитом С представлены структурные характеристики ЗКИ, находящихся на разных стадиях (покоя, активации) и в процессе трансформации в миофибробласты.

Выводы. Применение оригинальных методов клинической морфологической идентификации и оценки функционального состояния ЗКИ повысит качество диагностики и прогнозирования фиброза печени.

Ключевые слова: печень, звездчатые клетки Ито, морфология, характеристика, витамин А, фиброз.

Введение

Неблагоприятным исходом большинства хронических диффузных поражений печени разной этиологии, включая хронический гепатит С (ХГС), является фиброз печени, в развитии которого главными участниками являются активированные фибробласты, основным источником которых являются активированные звездчатые клетки Ито (ЗКИ) .

ЗКИ, синоним - звёздчатые клетки печени, жирозапасающие клетки, перисинусоидальные липоциты, стеллатные клетки (англ. Hepatic Stellate Cell, HSC, Cell of Ito, Ito cell). ЗКИ впервые были описаны в 1876 г. К. Купффером и названы им звёздчатыми клетками («Stemzellen»). Т. Ито (T.Ito), обнаружив в них капли жира, обозначил их вначале жиропоглощающими («shibo-sesshusaibo»), а затем, установив, что жир вырабатывался самими клетками из гликогена, - жирозапасающими клетками («shibo-chozosaibo») . В 1971 г. К. Вакэ (K.Wake) доказал идентичность звездчатых клеток Купф-фера и жирозапасающих клеток Ито и то, что эти клетки «складируют» витамин А .

Около 80% витамина А, находящегося в организме, накапливается в печени, и до 80% всех ретиноидов печени депонировано в жировых каплях ЗКИ. Эфиры ретинола в составе хиломи-кронов попадают в гепатоциты, где конвертируются в ретинол, образуя комплекс витамина А с ретинолсвязывающим белком (РСБ), который секретируется в перисинусоидальное пространство, откуда депонируется клетками .

Установленная К. Поппером тесная связь ЗКИ с фиброзом печени продемонстрировала их не статичную, а динамичную функцию - способность непосредственно участвовать в ремо-делировании внутридолькового перигепатоцел-люлярного матрикса .

Основным методом морфологического исследования печени, проводимого по оценке изменений в прижизненных биоптатах, является световая микроскопия, которая в клинической практике позволяет установить активность вос-

паления и стадию хронизации . Недостатком метода является малое разрешение, не позволяющее оценить особенности строения клеток, внутриклеточных органелл, включений, функциональные характеристики. Прижизненное электронно-микроскопическое исследование ультраструктурных изменений в печени дает возможность дополнить данные световой микроскопии и повысить их диагностическую ценность.

В связи с этим идентификация ЗКИ печени, изучение их фенотипа в процессе трансдиффе-ренцировки, определение интенсивности их пролиферации являются важнейшим вкладом в прогнозирование исходов болезней печени, а также в патоморфологию и патофизиологию фиброгенеза.

Цель - представить структурно-функциональную характеристику ЗКИ по результатам цитологической идентификации прижизненных биоптатов печени.

Материалы и методы

Прижизненный биоптат печени получен проведением аспирационной биопсии печени у пациентов с ХГС (РНК HCV+), от которых получено письменное информированное согласие.

Для световой микроскопии полутонких срезов образцы биоптата печени пациентов размером 0,5^2 мм фиксировали методом двойной фиксации: вначале - по методике Sato Taizan , затем образцы ткани в течение 1 часа дополнительно фиксировали в 1% осмиевом фиксаторе, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере Зёренсена, рН 7,4. Для лучшего выявления внутриклеточных структур и межуточного вещества на полутонких срезах в 1% четырехокись осмия добавляли дихромат калия (К2Сг207) или кристаллы хромового ангидрида (1 мг/мл). После дегидратации образцов в серии спиртовых растворов возрастающей концентрации и ацетоне они помещались в преполимеризован-ную смесь бутилового метакрилата и стирола и полимеризовались при 550С. Полутонкие срезы (толщиной 1 мкм) последовательно окрашивали

азур II-основным фуксином. Микрофотографии получали с использованием цифровой видеокамеры (Leica FC 320, Германия).

Электронно-микроскопическое изучение проводили в образцах биоптатов печени размером 0,5x1,0 мм, фиксированных 1% раствором четырехокиси осмия на 0,1 М буфере Миллони-га, рН 7,4, при +40С в течение 2 часов . После дегидратации в спиртах восходящей концентрации и ацетоне образцы заливали в аралдит . Из полученных блоков на ультрамикротоме Leica EM VC7 (Германия) готовили полутонкие срезы (400 нм) и окрашивали метиленовым синим. Препараты просматривали в световом микроскопе и выбирали однотипный участок для дальнейшего изучения ультраструктурных изменений. Ультратонкие срезы (35 нм) контрастировали 2% раствором уранилацетата на 50% метаноле и цитратом свинца по E. S. Reynolds . Электронно-микроскопические препараты изучали в электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL, Япония) при увеличениях 10 000-60 000 при ускоряющем напряжении 80 кВт. Для получения снимков использовался комплекс из цифровой камеры Olympus MegaViewIII (Германия) и программы для обработки изображений iTEM (Olympus, Германия).

Результаты и обсуждение

ЗКИ располагаются в перисинусоидальном пространстве (Диссе) в карманах между гепа-тоцитами и эндотелиальными клетками, имеют длинные отростки, проникающие глубоко между гепатоцитами. В большинстве публикаций, посвященных данной популяции ЗКИ, приводится их схематическое изображение, позволяющее только обозначить «территориальную» принадлежность ЗКИ в печени и по отношению к окружающим их «соседям» (рисунок 1).

ЗКИ имеют тесный контакт с эндотелиоцита-ми через компоненты неполной базальной мембраны и интерстициальные коллагеновые волокна. Нервные окончания проникают между ЗКИ и паренхиматозными клетками, из-за чего пространство Диссе определяют как пространство между пластинками паренхиматозных клеток и

комплексом ЗКИ и эндотелиальных клеток .

Полагают, что ЗКИ происходят из слабо-дифференцированных мезенхимных клеток поперечной перегородки развивающейся печени . В эксперименте установлено, что в образовании ЗКИ участвуют гемопоэтические стволовые клетки и что этот процесс не обусловлен слиянием клеток .

Синусоидальные клетки (СК), прежде всего ЗКИ, при всех видах регенерации печени играют ведущую роль. Фиброзирующая регенерация печени происходит в результате ингибирова-ния стволовых функций ЗКИ и стволовых клеток костного мозга . В печени человека ЗКИ составляют 5-15%, являясь одной из 4-х разновидностей СК, имеющих мезенхимальное происхождение: клетки Купффера, эндотелиоциты, Рй-клетки. В составе пула СК обнаруживается также 20-25% лейкоцитов .

В цитоплазме ЗКИ находятся жировые включения с ретинолом, триглицериды, фосфолипи-ды, холестерин, свободные жирные кислоты, а-актин и десмин . Для визуализации ЗКИ применяется окрашивание хлоридом золота. В эксперименте установлено, что маркером дифференциации ЗКИ от других миофибробластов является экспрессия ими белка рилин .

ЗКИ существуют в спокойном («неактивные ЗКИ»), переходном и длительно активированном состоянии, каждое из которых характеризуется экспрессией генов и фенотипом (а^МА, 1САМ-1, хемокины и цитокины).

ЗКИ в неактивном состоянии имеют округлую, слегка вытянутую или неправильную форму, крупное ядро и яркий визуализационный признак - липидные включения (капли), содержащие ретинол (рисунок 2).

Количество липидных капель в неактивной ЗКИ достигает 30 и более, они близки по размеру, прилежат друг к другу, вдавливаясь в ядро и оттесняя его к периферии (рисунок 2). Между большими каплями могут располагаться мелкие включения. Цвет капель зависит от фиксатора и окраски материала. В одном случае они светлые (рисунок 2а), в другом - темно зеленые (рисунок 2б).

Рисунок 1. - Схема расположения ЗКИ (stellatecell, перисинусоидальный липоцит) в перисинусоидальном пространстве Диссе (space of Disse), Интернет-ресурс

Рисунок 2. - ЗКИ, находящиеся в неактивном состоянии

а - ЗКИ округлой формы с большим содержанием ли-пидных капель со светлой окраской (белые стрелки), гепатоциты (Гц) с опустошенной цитоплазмой (черная стрелка); б - ЗКИ с липидными каплями темной окраски, в тесном контакте с макрофагом (Мф); а-б - полутонкие срезы. Окраска азур II - основной фуксин. Микрофотографии. Увел. 1000; в - ЗКИ с обилием липидных капель (более 30), имеющая неправильную форму (ув. 6 000); г-ультраструктурныекомпонентыЗКИ:л-липидныекапли, митохондрии (оранжевые стрелки), ГрЭС (зеленые стрелки), комплекс Гольджи (красная стрелка), ув. 15 000; в-г - электронограммы

При электронной микроскопии на фоне светлого липидного субстрата формируется более осмиофильный маргинальный ободок (рисунок 5а) . У большинства «покоящихся» ЗКИ наряду с крупными липидными включениями заметно малое количество цитоплазматического матрикса, бедного митохондриями (Мх) и гранулярной эндоплазматической сетью (ГрЭС). При этом отчетливо видны компартменты умеренно развитого комплекса Гольджи в виде стопки из 3-4 уплощенных цистерн со слегка расширенными концами (рисунок 2г).

При определенных условиях активирующиеся ЗКИ приобретают смешанный, или переходный фенотип, сочетающий морфологические признаки и липидосодержащей, и фибробласто-подобной клетки (рисунок 3).

Переходный фенотип ЗКИ также имеет свои морфологические признаки. Клетка приобретает вытянутую форму, количество липидных включений уменьшается, происходит сокращение числа инвагинаций нуклеолеммы. Увеличивается объем цитоплазмы, содержащей многочисленные цистерны ГрЭС со связанными рибосомами и свободные рибосомы, Мх. Наблюдается гиперплазия компонентов пластинчатого комплекса Гольджи, представленного несколькими стопками из 3-8 уплощенных цистерн, возрастает численность лизосом, участвующих в деграда-

Рисунок 3. - ЗКИ, находящиеся в переходном состоянии

а - ЗКИ (белые стрелки). Полутонкий срез. Окраска азур II - основной фуксин. Микрофотография. Увел. 1000; б - ЗКИ удлиненной формы и с малым количеством липид-ных капель; ув. 8 000; в - ЗКИ в контакте с клетками Куп-ффера (КК) и лимфоцитом (Лц), ув. 6 000. (Гц - гепатоцит, л - липидные капли, Э - эритроцит); г - митохондрии (оранжевые стрелки), ГрЭС (зеленые стрелки), к. Гольд-жи (красная стрелка), лизосомы (синие стрелки), ув.20 000; б, в, г - электронограммы

ции липидных капель (рисунок 3г). Гиперплазия компонентов ГрЭС и комплекса Гольджи связана со способностью фибробластов синтезировать молекулы коллагена, а также моделировать их путем посттрансляционного гидроксилирова-ния и гликозилирования в эндоплазматическом ретикулуме и элементах комплекса Гольджи.

В неповрежденной печени ЗКИ, находясь в спокойном состоянии, охватывают своими отростками синусоидный капилляр. Отростки ЗКИ подразделяются на 2 типа: перисинусоидальные (субэндотелиальные) и интергепатоцеллюляр-ные (рисунок 4).

Первые выходят из тела клетки и простираются вдоль поверхности синусоидного капилляра, охватывая его тонкими пальцеобразными ответвлениями. Они покрыты короткими ворсинками, имеют характерные длинные микровыбросы, простирающиеся еще дальше по поверхности эндотелиальной трубки капилляра. Интергепа-тоцеллюлярные выросты, преодолев пластинку гепатоцитов и достигнув соседнего синусоида, делятся на несколько перисинусоидальных выростов. Таким образом, ЗКИ в среднем охватывает больше двух соседних синусоидов .

При поражениях печени происходит активация ЗКИ и процесса фиброгенеза, в котором выделяют 3 фазы. Они обозначаются как инициация, пролонгация и резолюция (разрешение фиброзной ткани) . Этот процесс трансформации «покоящихся» ЗКИ в фиброзирующие миофи-бробласты инициируется цитокинами (^-1, ^-6,

Рисунок 4. - Перисинусоидальные (субэндотелиальные) и интергепатоцеллюлярные отростки (выросты) ЗКИ

а - отросток ЗКИ (желтые стрелки), выходящий из тела клетки, ув. 30 000; б - отросток ЗКИ, расположенный вдоль поверхности синусоидного капилляра, содержащий липидную каплю, ув. 30 000; в - субэндотелиально расположенные отростки ЗКИ. Отростки эндотелиальных клеток (розовые стрелки); г - интергепатоцеллюлярный отросток ЗКИ; участок деструкции мембран ЗКИ и гепа-тоцита (черные стрелки), ув. 10 000. Электронограммы

ТОТ-а), недоокисленными продуктами метаболизма, активными формами кислорода, оксидом азота, эндотелином, тромбоцитактивирующим фактором (PDGF), активатором плазминогена, трансформирующим фактором роста (TGF-1), ацетальдегидом и многими другими. Непосредственными активаторами являются гепатоци-ты в состоянии окислительного стресса, клетки Купффера, эндотелиоциты, лейкоциты, тромбоциты, продуцирующие цитокины (паракринные сигналы) и сами ЗКИ (аутокринная стимуляция). Активация сопровождается экспрессией (включением в работу) новых генов, синтезом цито-кинов и белков экстрацеллюлярного матрикса (коллагенов I, Ш,У типаов) .

На данном этапе процесс активации ЗКИ может завершиться за счет стимуляции образования в ЗКИ противовоспалительных цитокинов, ингибирующих продукцию ТОТ-а макрофагами в зоне повреждения. В результате количество ЗКИ резко сокращается, они подвергаются апоп-тозу и процессы фиброза в печени не развиваются .

Во вторую фазу (пролонгированную) при продолжительном постоянном паракринном и аутокринном воздействии активирующих стимулов в ЗКИ «поддерживается» активированный фенотип, характеризующийся превращением ЗКИ в контрактильные миофибробластоподоб-ные клетки, осуществляющие синтез экстрацел-люлярного фибриллярного коллагена.

Активированный фенотип характеризуется пролиферацией, хемотаксисом, сокращаемостью, потерей запасов ретиноида и образованием клеток, напоминающих миофибробластные . Активированные ЗКИ также демонстрируют повышенное содержание новых генов, таких как a-SMA, ICAM-1, хемокины и цитокины. Активация клеток свидетельствует о начале ранней стадии фиброгенеза и предшествует повышенному продуцированию ECM-белков . Образовавшиеся фиброзные ткани подвергаются ремоделированию за счет расщепления матрик-са с помощью матриксных металлопротеиназ (matrixmetaloproteinases - MMPs). В свою очередь расщепление матрикса регулируется тканевыми ингибиторами MMPs (tissue inhibitors of matrixmetaloproteinases - TIMPs). MMPs и TIMPs входят в семейство цинкозависимых ферментов. MMPs синтезируются в ЗКИ в виде неактивных проферментов, которые активируются при отщеплении пропептида, но ингибируются при взаимодействии с эндогенными TIMPs - TIMPs-1 и TIMPs-2. ЗКИ продуцируют 4 типа MMPs мембранного типа, которые активируются под воздействием IL-1 р. Среди MMPs особое значение придается MMPs-9 - нейтральной матриксной металлопротеиназе, которая обладает активностью против коллагена 4-го типа, входящего в состав базальной мембраны, а также против частично денатурированных коллагенов 1-го и 5-го типов .

Об увеличении популяции ЗКИ при разного рода повреждениях печени судят по активности значительного числа митогенных факторов, родственных им тирозинкиназных рецепторов и других идентифицированных митогенов, которые вызывают наиболее выраженную пролиферацию ЗКИ: эндотелин-1, тромбин, FGF - фактор роста фибробластов, PDGF - фактор роста эндотелия сосудов, IGF - инсулиноподобный фактор роста. Накопление ЗКИ в зонах повреждения печени происходит не только за счет пролиферации этих клеток, но и за счет их направленной миграции в эти зоны путем хемотаксиса, при участии таких хемоаттрактантов, как PDGF и лейкоцитарный хемоаттрактант-MCP (моно-цитарный хемотаксический протеин-1) .

У активированных ЗКИ количество липид-ных капель сокращается до 1-3-х с расположением их на противоположных полюсах клетки (рисунок 5).

Активированные ЗКИ приобретают вытянутую форму, значительные участки цитоплазмы занимает комплекс Гольджи, выявляются довольно многочисленные цистерны ГрЭС (показатель синтеза белка на экспорт). Количество остальных органелл снижено: обнаруживаются малочисленные свободные рибосомы и полисомы, единичные митохондрии, нерегулярно - ли-зосомы (рисунок 6).

В 2007 г. ЗКИ были впервые названы стволовыми клетками печени, так как они экспресси-руют один из маркеров кроветворных мезенхи-мальных стволовых клеток - CD133 .

Рисунок 5. - ЗКИ, находящиеся в активированном состоянии

а, б - ЗКИ (синие стрелки) с единичными липидными включениями, локализованными у противоположных полюсов ядра. Перисинусоидальная соединительная ткань (на рис. 6а) и прослойка межклеточного матрикса вокруг гепатоцита (на рис. 6б) окрашены в красный цвет. Цитотоксические лимфоциты (фиолетовые стрелки). Эндотелиальная клетка (белая стрелка). Тесный контакт плазматической клетки (красная стрелка) и гепатоцита. Полутонкие срезы. Окраска азур II - основной фуксин. Микрофотографии. Увел. 1000 ; в, г - ультраструктурные компоненты ЗКИ: митохондрии (оранжевые стрелки), комплекс Гольджи (красная стрелка), цистерны его более осмиофильной цис-стороны обращены к расширенным элементам гранулярной эндоплазматической сети (зеленые стрелки), лизосома (голубая стрелка) (ув. 10 000 и 20 000, соответственно); в, г - электронограммы

Миофибробласты, которые отсутствуют в нормальной печени, имеют три потенциальных источника: первый - во время внутриутробного развития печени, в портальных трактах миофибробласты окружают сосуды и желчные протоки во время их созревания, а после полного развития печени они исчезают и заменяются в портальных трактах портальными фибробластами; второй - при поражении печени они образуются за счет портальных мезенхимальных клеток и покоящихся ЗКИ, реже за счет переходных эпителиально-мезенхимальных клеток. Они характеризуются наличием CD45-, CD34-, Desmin +, глиального фибриллярного белка, ассоциированного с (GFAP) + и Thy-1 +.

Недавние исследования показали, что гепа-тоциты, холангиоциты и эндотелиальные клетки могут стать миофибробластами через эпителиальные или через переход эндотелиальных клеток в мезенхимальные (EMT). Эти клетки включают такие маркеры, как CD45-, альбумин+ (т.е. гепатоцитов), CD45-, CK19+ (т.е. холанги-оцитов) или Tie-2 + (эндотелиальные клетки).

Рисунок 6. - Высокая фибротическая активность ЗКИ

а, б - миофибробласт (Мфб), клетка содержит крупное ядро, элементы ГрЭС (красные стрелки), многочисленные свободные рибосомы, полиморфные везикулы и гранулы, единичные митохондрии и яркий визуализационный признак - пучок актиновых нитей в цитоплазме (желтые стрелки); увел. 12 000 и 40 000; в, г, д, е - высокая фибротическая активность ЗКИ при сохранении в цитоплазме ретиноидсодержащих липидных капель. Многочисленные пучки коллагеновых фибрилл (белые стрелки), сохранивших (а) и потерявших (г, д, е) специфическую поперечную исчерченность; увел. 25 000, 15 000, 8 000, 15 000. Электронограммы

Кроме того, клетки костного мозга, состоящие из фиброцитов и циркулирующих мезенхим-ных клеток, могут трансформироваться в миофибробласты. Это клетки CD45+ (фиброциты), CD45+/- (циркулирующие мезенхимальные клетки), коллаген типа 1+, CD11d+ и МНС класса 11+ (рисунок 7) .

Литературные данные подтверждают не только тесную связь пролиферации овальных клеток с пролиферацией синусоидальных клеток , но и данные о возможной дифференцировке ЗКИ в печеночный эпителий , которая была названа мезенхимально-эпителиальной трансформацией перисинусоидальных клеток .

В состоянии фиброгенной активации миофи-бробластоподобные ЗКИ, наряду с уменьшением числа и последующим исчезновением липидных капель, характеризуются очаговой пролиферацией (рисунок 8), иммуногистохимической экспрессией фибробластоподобных маркеров, в том числе гладкомышечного а-актина, и формированием перицеллюлярных коллагеновых фибрилл в пространствах Диссе .

В фазу развития фиброза нарастающая гипоксия печеночной ткани становится фактором дополнительной избыточной экспрессии в стволовых клетках провоспалительных молекул адгезии - 1САМ-1, 1САМ-2, VEGF, провоспа-

Взаимодействие протоковых печеночных клеток-предшественников с миофибробластами печени

Миофибробластоподобные ЗКИ в состоянии фиброгенной активации .

Рисунок 7. - Участники миофибробластической активации ЗКИ

лительных хемоаттрактантов - M-CSF, МСР-1 (моноцитарный хемотаксический протеин-1) и СЖС (цитокин-обусловленный нейтрофильный хемоаттрактант) и других, которые стимулируют образование провоспалительных цитокинов (TGF-b, PDGF, FGF, PAF, SCF, ЕТ-1) и усиливают процессы фиброгенеза в печени, создавая условия для самоподдерживаемой индукции непрекращающейся активации ЗКИ и процессов фиброгенеза .

На микроскопических препаратах перикапил-лярный фиброз проявляется в виде интенсивной окраски перисинусоидальной соединительной ткани и прослойки межклеточного матрикса вокруг гепатоцитов (часто гибнущих) в красный цвет. На электронно-микроскопических препаратах фиброзные изменения визуализируются либо в виде сформированных крупных пучков фибрилл коллагеновых волокон, сохранивших поперечную исчерченность, либо в виде массив-

ных отложений в пространстве Диссе волокнистой массы, представляющей собой набухшие и потерявшие периодическую исчерченность кол-лагеновые волокна (рисунок 9).

По современным представлениям, фиброз -динамический процесс, который может прогрессировать и регрессировать (рисунок 10).

В последнее время были предложены несколько специфических маркеров ЗКИ: расцвет витамина А (ВА) в липидные капли, GFAP, рецептор р75 NGF и синаптофизин . Проводятся исследования по участию ЗКИ печени в пролиферации и дифференцировке стволовых клеток печени .

Нами исследовано содержание ретинолсвя-зывающего белка (РСБ-4), образующего комплекс с ВА, концентрация которого в плазме крови в норме коррелирует с обеспеченностью организма ВА, 80% которого находится в ЗКИ.

Установлена зависимость между содержани-

Рисунок 8. - Очаговая пролиферация ЗКИ в состоянии фиброгенной активации

а - гиперплазия ЗКИ (белые стрелки) в просвете расширенных синусоидов; б - пролиферация трансдифференцированных ЗКИ (белые стрелки), эндотелиальная клетка (розовая стрелка). Полутонкие срезы. Окраска азур II - основной фуксин. Микрофотографии. Увел. 1000

Рисунок 9. - Финальная стадия миофибробластиче-ской активации ЗКИ

а, б - перисинусоидальный фиброз (белые стрелки). Пери-синусоидальная соединительная ткань и прослойка межклеточного матрикса вокруг гепатоцитов (б) окрашены основным фуксином в красный цвет. ЗКИ, активированные и трансформированные в фибробласты (синие стрелки). Гц на рис. а - гепатоцит с опустошенной цитоплазмой. Полутонкие срезы. Окраска азур II - основной фуксин. Микрофотографии. Увел. 1000; в, г - перисинусоидальный и перигепатоцеллюлярный фиброз в дольке печени, повышенная электронная плотность фибрилл коллагеновых волокон; конденсация матрикса митохондрий в гепатоците (оранжевая стрелка). Ув.8 000 и 15 000, соответственно. Электронограммы

Таблица 1. - Показатели содержания РСБ-4 у пациентов с циррозом печени (ЦП) и хроническим гепатитом (ХГ) разной этиологии, нг/мл (М±т)

Группа n M±m р

Цирроз печени 17 23,6±2,29 <0,05

ХГ, АсАТ норма 16 36,9±2,05* >0,05

ХГ, АсАТ >2-х норм 13 33,0±3,04* >0,05

ХГ, АлАТ норма 13 37,5±3,02* >0,05

ХГ, АлАТ >2-х норм 21 35,9±2,25* >0,05

Контроль 15 31,2±2,82

Примечание: р - достоверные различия с контролем (р<0,05); * - достоверные различия между ЦП и ХГ (р<0,05)

Ложная долька, окруженная фи- Резолюция фиброзной септы во-брозной септой. Окраска по Массо- круг ложной дольки. Окраска по ну.Ув.х50 Массону. Ув.х200

Рисунок 10. - Динамика событий в ложной дольке пациента с вирусным циррозом печени через 6 месяцев после трансплантации в печень аутологичных мезенхимальных стволовых клеток

ем РСБ-4 и 4-й стадией фиброза (цирроз) в отличие от хронического гепатита, при котором такая зависимость не прослеживалась, независимо от биохимических маркеров активности воспаления в печени.

Данный факт необходимо учитывать при обосновании заместительной терапии для устранения дефицита ВА в организме, который может быть обусловлен истощением потенциала ЗКИ, обусловленного прогрессированием фиброза в печени.

1. Максимальная результативность оценки структурно-функционального состояния ЗКИ обеспечивается морфологическим исследованием прижизненного биоптата при одновременном использовании комплекса методик клеточной визуализации (световая, электронная микроскопия ультратонких срезов и оригинальных методов фиксации и окраски).

2. Результаты морфологического исследования ЗКИ позволяют повысить качество прижизненной диагностики фиброза, провести его мониторинг и прогнозирование исходов хронических диффузных поражений печени на более высоком современном уровне.

3. Результаты морфологических заключений позволят клиницисту дополнительно включить в формулировку окончательного диагноза уточненные данные по стадии хронизации (стабилизация, прогрессирование или резолюция фиброза) в процессе терапии.

Литература

1. Ивашкин, В. Т. Клиническая симптоматика дофибро-тических изменений: стенограмма лекции Всероссийского Интернет-Конгресса специалистов по внутренним болезням / В. Т. Ивашкин, А. О. Буеверов // ИНТЕРНИСТ: Национальное Интернет-Общество специалистов по внутренним болезням. - 2013. - Режим доступа: http://internist. ru/publications /detail/6569/. - Дата доступа: 21.11.2016.

2. Киясов, А. П. Овальные клетки - предполагаемые стволовые клетки печени или гепатобласты? / А. П. Киясов, А. А. Гумерова, М. А. Титова // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2006. - Т. 2, № 4. - С. 55-58.

1. Ivashkin, V. T. Klinicheskaya simptomatika dofibroticheskih izmenenij: stenogramma lekcii Vserossijskogo Internet-Kongressa specialistov po vnutrennim boleznyam / V. T. Ivashkin, A. O. Bueverov // INTERNIST: Nacional"noe Internet-Obshchestvo specialistov po vnutrennim boleznyam. - 2013. - Rezhim dostupa: http://internist.ru/publications / detail/6569/. - Data dostupa: 21.11.2016.

2. Kiyasov, A. P. Oval"nye kletki - predpolagaemye stvolovye kletki pecheni ili gepatoblasty? / A. P. Kiyasov, A. A. Gumerova, M. A. Titova // Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya inzheneriya. - 2006. - T. 2, № 4. - S. 55-58.

3. О роли синусоидальных клеток печени и клеток костного мозга в обеспечении регенераторной стратегии здоровой и поврежденной печени / А. В. Люндуп [и др.] // Вестник трансплантологии и искусственных органов. -2010. - Т. XII, № 1. - С. 78-85.

4. Серов, В. В. Морфологические критерии оценки этиологии, степени активности и стадии процесса при вирусных хронических гепатитах В и С / В. В. Серов, Л. О. Севергина // Архив патологии. - 1996. - № 4. - С. 61-64.

5. Структурно-функциональная характеристика звездчатых клеток печени в динамике фиброза / О. А. Постникова [и др.] // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 10.

6. Ультраструктурное и иммуногистохимическое исследование звездчатых клеток печени в динамике фиброза и цирроза печени инфекционно-вирусного генеза / Г. И. Непомнящих [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 142, № 12. - С. 681-686.

7. Щеглев, А. И. Структурно-метаболическая характеристика синусоидальных клеток печени / А. И. Щеглев, О. Д. Мишнев // Успехи современной биологии. - 1991. - Т. 3, № 1. - С. 73-82.

10. Effects of dietary retinoid and triglyceride on the lipid composition of rat liver stellate cells and stellate cell lipid droplets / H. Moriwaki // J. Lipid. Res. - 1988. - Vol. 29. - Р. 1523-1534.

13. Friedman, S. Hepatic fibrosis 2006: Report of the Third AASLD Single Topic Conference / S. Friedman, D. Rockey, B. Montgomery // Hepatology. - 2006. - Vol. 45 (1). - Р. 242-249.

18. Iredale, J. P. Hepatic Stellate Cell Behavior During Resolution of Liver Injury / J. P. Iredale // Semin. Liver Dis. -2001. - Vol. 21 (3). - Р. 427-436.

19. Kobold, D. Expression of reelin in hepatic stellate cells and during hepatic tissue repair: a novel marker for the differentiation of HSC from other liver myofibroblasts / D. Kobold // J. Hepatol. - 2002. - Vol. 36 (5). - Р. 607-613.

20. Lepreux, S. Human liver myofibroblasts during development and diseases with a focus on portal (myo)

3. O roli sinusoidal"nyh kletok pecheni i kletok kostnogo mozga v obespechenii regeneratornoj strategii zdorovoj i povrezhdennoj pecheni / A. V. Lyundup // Vestnik transplantologii i iskusstvennyh organov. - 2010. - T. HII, № 1. - S. 78-85.

4. Serov, V. V. Morfologicheskie kriterii ocenki ehtiologii, stepeni aktivnosti i stadii processa pri virusnyh hronicheskih gepatitah V i S / V. V. Serov, L. O. Severgina // Arhiv patologii.

1996. - № 4. - S. 61-64.

5. Strukturno-funkcional"naya harakteristika zvezdchatyh kletok pecheni v dinamike fibroza / O. A. Postnikova // Fundamental"nye issledovaniya. - 2011. - № 10. - C. 359-362.

6. Ul"trastrukturnoe i immunogistohimicheskoe issledovanie zvezdchatyh kletok pecheni v dinamike fibroza i cirroza pecheni infekcionno-virusnogo geneza / G. I. Nepomnyashchih // Byulleten" ehksperimental"noj biologii i mediciny. - 2006. - T. 142, № 12. - S. 681-686.

7. SHCHeglev, A. I. Strukturno-metabolicheskaya harakteristika sinusoidal"nyh kletok pecheni / A. I. SHCHeglev, O. D. Mishnev // Uspekhi sovremennoj biologii. - 1991. - T. 3, № 1. - S. 73-82.

8. CD34 hepatic stellate cells are progenitor cells / C. Kordes // Biochem., Biophys. Res. Common. - 2007. -Vol. 352 (2). - P. 410-417.

9. Degradation of matrix proteins in liver fibrosis / M. J. Arthur // Pathol. Res. Pract. - 1994. - Vol. 190 (9-10).

11. Fetal liver consists of cells in epithelial-to-mesenchymal transition / J. Chagraoni // Blood. - 2003. - Vol. 101. - P. 2973-2982.

12. Fixation, degydratation and embedding of biological specimens / A. M. Glauert // Practical Methods in Electron Microscopy. - New York: Am. Elsevier, 1975. - Vol. 3, part 1.

13. Friedman, S. Hepatic fibrosis 2006: Report of the Third AASLD Single Topic Conference / S. Friedman, D. Rockey, B. Montgomery // Hepatology. - 2006. - Vol. 45 (1). - R. 242-249.

14. Gaga, M. D. Human and rathepatic stellate cells produce stem cell factor: a possible mechanism for mast cell recruitment in liver fibrosis / M. D. Gaga // J. Hepatol. - 1999. - Vol. 30, № 5. - P. 850-858.

15. Glauert, A. M. Araldite as embedding medium for electron microscopy / A. M. Glauert, R. H. Glauert // J. Biophys. Biochem. Cytol. - 1958. - Vol. 4. - P. 409-414.

16. Hepatic stellate cells and portal fibroblasts are the major cellular sources of collagens and lysyl oxidases in normal liver and early after injury / M. Perepelyuk // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. - 2013. - Vol. 304 (6). - P. 605614.

17. Hepatitis C virus core and nonstructural proteins induce fibrogenic effects in hepatic stellate cells / R. Bataller // Gastroenterology. - 2004. - Vol. 126, iss. 2. - P. 529-540.

18. Iredale, J. P. Hepatic Stellate Cell Behavior During Resolution of Liver Injury / J. P. Iredale // Semin. Liver Dis. -2001. - Vol. 21 (3). - R. 427-436.

20. Lepreux, S. Human liver myofibroblasts during development and diseases with a focus on portal (myo) fibroblasts / S. Lepreux, A. Desmouliére

fibroblasts / S. Lepreux, A. Desmouliere // Front. Physiol. - 2015. - Mode of access: http://dx.doi. org/10.3389/fphys.2015.00173. - Date of access: 31.10.2016.

22. Mesenchymal Bone Marrow-derived Stem Cells Transplantation in Patients with HCV Related Liver Cirrhosis / S. Lukashyk // J. Clin. Transl. Hepatol. - 2014. - Vol. 2, iss. 4. - P. 217-221.

23. Millonig, G. A. Advantages of a phosphate buffer for osmium tetroxide solutions in fixation / G. A. Millonig // J. Appl. Physics. - 1961. - Vol. 32. - P. 1637-1643.

Vol. 158. - P. 1313-1323.

Vol. 24. - P. 205-224.

29. Querner, F. Der mikroskopische Nachweis von Vitamin Aimanimalen Gewebe. Zur Kenntnis der paraplasmatischen Leberzellen-einschlüsse. Dritte Mitteilung / F. Querner // Klin. Wschr. - 1935. - Vol. 14. - P. 1213-1217.

30. Recent developments in myofibroblast biology: paradigms for connective tissue remodeling / B. Hinz // Am. J. Pathol. - 2012. - Vol. 180. - P. 1340-1355.

35. Septum transversum-derived mesothelium gives rise to hepatic stellate cells and perivascular mesenchymal cells in developing mouse liver / K. Asahina // Hepatology. -2011. - Vol. 53. - P. 983-995.

Vol. 50. - P. 66-71.

38. Thabut, D. Intrahepatic angiogenesis and sinusoidal remodeling in chronic liver disease: new targets for the treatment of portal hypertension? / D. Thabut, V. Shah // J. Hepatol. - 2010. - Vol. 53. - P. 976-980.

39. Wake, K. Hepatic stellate cells: Three-dimensional structure, localization, heterogeneity and development / K.

// Front. Physiol. - 2015. - Mode of access: http://dx.doi. org/10.3389/fphys.2015.00173. - Date of access: 31.10.2016.

21. Ligands of peroxisome proliferator-activated receptor gamma mod-ulateprofibrogenic and proinflammatory actions in hepatic stellate cells / F. Marra // Gastroenterology. -2000. - Vol. 119. - P. 466-478.

22. Mesenchymal Bone Marrow-derived Stem Cells Transplantation in Patients with HCV Related Liver Cirrhosis / S. Lukashyk // J. Clin. Transl. Hepatol. - 2014. - Vol. 2, iss. 4. - R. 217-221.

23. Millonig, G. A. Advantages of a phosphate buffer for osmium tetroxide solutions in fixation / G. A. Millonig // J. Appl. Rhysics. - 1961. - Vol. 32. - P. 1637-1643.

24. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver / S. Paku // Am. J. Hepatol. - 2001.

Vol. 158. - P. 1313-1323.

25. Origin of myofibroblasts in liver fibrosis / D. A. Brenner // Fibrogenesis Tissue Repair. - 2012. - Vol. 5, suppl. 1. - S. 17.

26. Origins and functions of liver myofibroblasts / S. Lemoinne // Biochim. Biophys. Acta. - 2013. - Vol. 1832 (7). - P. 948-954.

27. Pinzani, M. PDGF and signal transduction in hepatic stellate cells / M. Pinzani // Front. Biosci. - 2002. - Vol. 7. - P. 1720-1726.

28. Popper, H. Distribution of vitamin A in tissue as revealed by fluorescence microscopy / H. Popper // Physiol. Rev. - 1944.

Vol. 24. - R. 205-224.

30. Recent developments in myofibroblast biology: paradigms for connective tissue remodeling / B. Hinz // Am. J. Pathol. - 2012. - Vol. 180. - R. 1340-1355.

31. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy / E. S. Reynolds // J. Cell. Biol. - 1963. - Vol. 17. - P. 208-212.

32. Safadi, R. Immune stimulation of hepatic fibrogenesis by CD8 cells and attenuation by transgenic interleukin-10 from hepatocytes / R. Safadi // Gastroenterology. - 2004. - Vol. 127 (3). - P. 870-882.

33. Sato, T. An electron microscopic study of specimen-fixed for longer periods in phosphate buffered formalin / T. Sato, I. Takagi // J. Electron Microsc. - 1982. - Vol. 31, № 4. - P. 423-428.

34. Senoo, H. Vitamin A-Storing Cells (Stellate Cells) / H. Senoo, N. Kojima, M. Sato // Vitam. Horm. - 2007. - Vol. 75.

36. Stanciu, A. New data about ITO cells / A. Stanciu, C. Cotutiu, C. Amalinei // Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iasi. -2002. - Vol. 107, № 2. - P. 235-239.

37. Suematsu, M. Professor Toshio Ito: a clairvoyant in pericyte biology / M. Suematsu, S. Aiso // Keio J. Med. - 2000.

Vol. 50. - R. 66-71.

39. Wake, K. Hepatic stellate cells: Three-dimensional structure, localization, heterogeneity and development / K. Wake // Proc. Jpn. Acad. Ser. B, Phys. Biol. Sci. - 2006. - Vol.

Wake // Proc. Jpn. Acad. Ser. B, Phys. Biol. Sci. - 2006. - Vol. 82 (4). - P. 155-164.

82 (4). - P. 155-164.

40. Wake, K. In Cells of the Hepatic Sinusoid / K. Wake, H. Senoo // Kupffer Cell Foundation (Rijswijk, The Netherlands). - 1986. - Vol. 1. - P. 215-220.

41. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals / M. L. Watson // J. Biophys. Biochem. Cyt. - 1958. - Vol. 4. - P. 475-478.

CLINICAL CYTOLOGY OF THE LIVER: ITO STELLATE CELLS (HEPATIC STELLATE CELLS)

Tsyrkunov V. M, Andreev V. P., Kravchuk R. I., Kandratovich I. A. Educational Establishment "Grodno State Medical University", Grodno, Belarus

The aim of the work is to present the structural and functional characteristic of HSC based on the findings of cytological identification of intravital liver biopsy samples.

Materials and methods. Classical methods of light and electron microscopy of biopsy samples within the original technique of using ultrathin sections, fixation and staining were applied.

Results. The structural characteristics of the HSC of the liver biopsy samples from patients with chronic hepatitis C are presented on photo illustrations of light and electron microscopy. HSC are depicted at different stages (rest, activation) and during the process of transformation into myofibroblasts.

Conclusions. The use of original methods of clinical and morphological identification and evaluation of the functional status of HSC allows to improve the quality of diagnosis and prognosis of liver fibrosis.

Библиографическая ссылка

История [ | ]

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы - Цыркунов В.М., Андреев В.П., Кравчук Р.И., Кондратович И.А.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине, автор научной работы - Цыркунов В.М., Андреев В.П., Кравчук Р.И., Кондратович И.А.

Текст научной работы на тему «Клиническая Цитология печени: звездчатые клетки Ито»