Методы исследования в гистологии, цитологии и эмбриологии. Как проводится гистологическое исследование: виды, методы, особенности Гистологический метод изучения клетки

2. Объекты исследования гистологии

3. Приготовление гистологических препаратов

4. Методы исследования

5. Исторические этапы развития гистологии

1. Гистология наука о микроскопическом и субмикроскопическом строении, развитии и жизнедеятельности тканей животных организмов. Следовательно, гистология изучает один из уровней организации живой материи тканевой. Различают следующие иерархические уровни организации живой материи:

клеточный;

тканевой;

структурно-функциональные единицы органов;

органный уровень;

системный уровень;

организменный уровень

Гистология, как учебная дисциплина , включает в себя следующие разделы: цитологию, эмбриологию, общую гистологию (изучает строение и функции тканей), частную гистологию (изучает микроскопическое строение органов).

Основным объектом изучения гистологии является организм здорового человека и потому данная учебная дисциплина именуется как гистология человека.

Основная задача гистологии состоит в изучении строения клеток, тканей, органов, установления связей между различными явлениями, установление общих закономерностей.

Гистология, как и анатомия, относится к морфологическим наукам, главной задачей которых является изучение структур живых систем. В отличие от анатомии, гистология изучает строение живой материи на микроскопическом и электронно-микроскопическом уровне. При этом, изучение строения различных структурных элементов проводится в настоящее время с учетом выполняемых ими функций. Такой подход к изучению структур живой материи называется гистофизиологическим, а гистология нередко именуется как гистофизиология. Кроме того, при изучении живой материи на клеточном, тканевом и органном уровнях рассматривается не только форма, размеры и расположение интересующих структур, но методом цито- и гистохимии нередко определяется и состав веществ, образующих эти структуры. Наконец, изучаемые структуры обычно рассматриваются с учетом их развития, как во внутриутробном (эмбриональном) периоде, так и на протяжении постэмбрионального онтогенеза. Именно с этим связана необходимость включения эмбриологии в курс гистологии.

Гистология, как любая наука, имеет свои объекты и методы их изучения. Непосредственными объектами изучения являются клетки, фрагменты тканей и органов, особым способом приготовленные для изучения их под микроскопом.

2. Объекты исследования подразделяются на:

живые (клетки в капле крови, клетки в культуре и другие);

мертвые или фиксированные, которые могут быть взяты как от живого организма (биопсия), так и от трупов.

В любом случае после взятия кусочков они подвергаются действию фиксирующих растворов или замораживанию. И в научных, и в учебных целях используются фиксированные объекты. Приготовленные определенным способом препараты, используемые для изучения под микроскопом, называются гистологическими препаратами.

Гистологический препарат может быть в виде:

тонкого окрашенного среза органа или ткани;

мазка на стекле;

отпечатка на стекле с разлома органа;

тонкого пленочного препарата.

Гистологический препарат любой формы должен отвечать следующим требованиям:

сохранять прижизненное состояние структур;

быть достаточно тонким и прозрачным для изучения его под микроскопом в проходящем свете;

быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под микроскопом четко определяться;

препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и использоваться для повторного изучения.

Эти требования достигаются при приготовлении препарата.

3. Выделяют следующие этапы приготовления гистологического препарата

Взятие материала (кусочка ткани или органа) для приготовления препарата. При этом учитываются следующие моменты: забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, а при возможности от живого объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или органа; забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани; толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор мог проникнуть в толщу кусочка; обязательно производится маркировка кусочка (указывается наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора и так далее).

Фиксация материала необходима для остановки обменных процессов и сохранения структур от распада. Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие жидкости, которые могут быть простыми спирты и формалин и сложными раствор Карнуа, фиксатор Цинкера и другие. Фиксатор вызывает денатурацию белка и тем самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их прижизненном состоянии. Фиксация может достигаться также замораживанием (охлаждением в струе СО2, жидким азотом и другие). Продолжительность фиксации подбирается опытным путем для каждой ткани или органа.

Заливка кусочков в уплотняющие среды (парафин, целлоидин, смолы) или замораживание для последующего изготовления тонких срезов.

Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме или ультрамикротоме) с помощью специальных ножей. Срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной микроскопии - монтируются на специальные сеточки.

Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии). Перед окраской срезов удаляется уплотняющая среда (депарафинизация). Окраской достигается контрастность изучаемых структур. Красители подразделяются на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко используются основные красители (обычно гематоксилин) и кислые (эозин). Нередко используют сложные красители.

Просветление срезов (в ксилоле, толуоле), заключение в смолы (бальзам, полистерол), закрытие покровным стеклом.

После этих последовательно проведенных процедур препарат может изучаться под световым микроскопом.

Для целей электронной микроскопии в этапах приготовления препаратов имеются некоторые особенности, но общие принципы те же. Главное отличие заключается в том, что гистологический препарат для световой микроскопии может длительно храниться и многократно использоваться. Срезы для электронной микроскопии используются однократно. При этом вначале интересующие объекты препарата фотографируются, а изучение структур производится уже на электронограммах.

Из тканей жидкой консистенции (кровь, костный мозг и другие) изготавливаются препараты в виде мазка на предметном стекле, которые также фиксируются, окрашиваются, а затем изучаются.

Из ломких паренхиматозных органов (печень, почка и другие) изготавливаются препараты в виде отпечатка органа: после разлома или разрыва органа, к месту разлома органа прикладывается предметное стекло, на которое приклеиваются некоторые свободные клетки. Затем препарат фиксируется, окрашивается и изучается.

Наконец, из некоторых органов (брыжейка, мягкая мозговая оболочка) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливаются пленочные препараты путем растягивания или раздавливания между двумя стеклами, также с последующей фиксацией, окраской и заливкой в смолы.

4. Основным методом исследования биологических объектов, используемым в гистологии является микроскопирование , т. е. изучение гистологических препаратов по микроскопом. Микроскопия может быть самостоятельным методом изучения, но в последнее время она обычно сочетается с другими методами (гистохимии, гисторадиографии и другие). Следует помнить, что для микроскопии используются разные конструкции микроскопов, позволяющие изучить разные параметры изучаемых объектов. Различают следующие виды микроскопии:

световая микроскопия (разрешающая способность 0,2 мкм) наиболее распространенный вид микроскопии;

ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность 0,1 мкм);

люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия для определения химических веществ в рассматриваемых структурах;

фазово-контрастная микроскопия для изучения структур в неокрашенных гистологических препаратов;

поляризационная микроскопия для изучения, главным образом, волокнистых структур;

микроскопия в темном поле для изучения живых объектов;

микроскопия в падающем свете для изучения толстых объектов;

электронная микроскопия (разрешающая способность до 0,1-0,7 нм), две ее разновидности просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия и сканирующая или растровая микроскопии дает отображение поверхности ультраструктур.

Гистохимические и цитохимические методы позволяет определять состав химических веществ и даже их количество в изучаемых структурах. Метод основан на проведении химических реакций с используемым реактивом и химическими веществами, находящимися в субстрате, с образованием продукта реакции (контрастного или флюоресцентного), который затем определяется при световой или люминесцентной микроскопии.

Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов в изучаемые структуры. Метод используется чаще всего в экспериментах на животных.

Метод дифференциального центрифугирования позволяет изучать отдельные органеллы или даже фрагменты, выделенные из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2-х до 150 тыс.) и получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.

Метод интерферометрии позволяет определить сухую массу веществ в живых или фиксированных объектах.

Иммуноморфологические методы позволяет с помощью предварительно проведенных иммунных реакций, на основании взаимодействия антиген-антитело, определять субпопуляции лимфоцитов, определять степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов (определять гистосовместимость) для трансплантации органов.

Метод культуры клеток (in vitro, in vivo) выращивание клеток в пробирке или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.

Единицы измерения, используемые в гистологии

Для измерения структур в световой микроскопии используются в основном микрометры: 1 мкм составляет 0,001 мм; в электронной микроскопии используются нанометры: 1 нм составляет 0,001 мкм.

5. В истории развития гистологии условно выделяют три периода:

Домикроскопический период (с IV в. до н. э. по 1665 г.) связан с именами Аристотеля, Галена, Авиценны, Везалия, Фаллопия и характеризуется попытками выделения в организме животных и человека неоднородных тканей (твердых, мягких, жидких и так далее) и использованием методов анатомической препаровки.

Микроскопический период (с 1665 г. по 1950 г.). Начало периода связывают с именем английского физика Роберта Гука, который, во-первых, усовершенствовал микроскоп (полагают, что первые микроскопы были изобретены в самом начале XVII в.), во-вторых, использовал его для систематического исследования различных, в том числе биологических объектов и опубликовал результаты этих наблюдений в 1665 г. в книге "Микрография", в-третьих, впервые ввел термин "клетка" ("целлюля"). В дальнейшем осуществлялось непрерывное усовершенствование микроскопов и все более широкое использование их для изучения биологических тканей и органов.

Особое внимание уделялось изучению строения клетки. Ян Пуркинье описал наличие в животных клетках "протоплазмы" (цитоплазмы) и ядра, а несколько позже Р. Броун подтвердил наличие ядра и в большинстве животных клеток. Ботаник М. Шлейден заинтересовался происхождением клетокцитокенезисом. Результаты этих исследований позволили Т. Швану, на основании их сообщений, сформулировать клеточную теорию (1838-1839 гг.) в виде трех постулатов:

все растительные и животные организмы состоят из клеток;

все клетки развиваются по общему принципу из цитобластемы;

каждая клетка обладает самостоятельной жизнедеятельностью, а жизнедеятельность организма является суммой деятельности клеток.

Однако вскоре Р. Вирхов (1858 г.) уточнил, что развитие клеток осуществляется путем деления исходной клетки (любая клетка из клетки). Разработанные Т. Шваном положения, клеточной теории актуальны до настоящего времени, хотя формулируется по-иному.

Современные положения клеточной теории:

клетка является наименьшей единицей живого;

клетки животных организмов сходны по своему строению;

размножение клеток происходит путем деления исходной клетки;

многоклеточные организмы представляют собой сложные ансамбли клеток и их производных, объединенные в системы тканей и органов, связанные между собой клеточными, гуморальными и нервными формами регуляции.

Дальнейшее совершенствование микроскопов, особенно создание ахроматических объективов, позволило выявить в клетках более мелкие структуры:

клеточный центр Гертвиг, 1875 г.;

сетчатый аппарат или пластинчатый комплекс Гольджи, 1898 г.;

митохондрии Бенда, 1898 г.

Современный этап развития гистологии начинается с 1950 г. с момента начала использования электронного микроскопа для изучения биологических объектов, хотя электронный микроскоп был изобретен раньше (Е. Руска, М. Кноль, 1931 г.). Однако для современного этапа развития гистологии характерно внедрение не только электронного микроскопа, но и других методов: цито- и гистохимии, гисторадиографии и других вышеперечисленных современных методов. При этом обычно используется комплекс разнообразных методик, позволяющий составить не только качественное представление об изучаемых структурах, но и получить точные количественные характеристики. Особенно широко в настоящее время используются различные морфометрические методики, в том числе автоматизированные системы обработки полученной информации с использованием компьютеров.

ЛЕКЦИЯ 2. Цитология. Цитоплазма

Гистология – («гистос» греч. – ткань, логис - учение) Это наука о строении, развитии и жизнедеятельности тканей многоклеточных организмов и человека. Невооруженному глазу недоступны объекты, являющиеся предметом этой науки. Поэтому и история гистологии тесно связана с истроией создания таких приборов, которые позволяют изучить мельчайшие предметы, невооруженным глазом. 2

Курс гистологии условно разделен на следующие разделы: n 1. Цитология - наука о клетке. n 2. Эмбриология - наука о развитии, от зарождения до полного формирования организма. n 3. Общая гистология - наука об общих закономерностях, присущих тканям. n 4. Частная гистология - изучает строение, развитие органов и систем.

ЦИТОЛОГИЯ – (греч. κύτος «клетка» и λόγος - «учение» , «наука») n Раздел биологии, изучающий живые клетки, их органоиды, их строение, функционирование, процессы клеточного размножения, старения и смерти. 4

ЭМБРИОЛОГИЯ n (от др. -греч. ἔμβρυον - эмбрион, зародыш + -λογία от λόγος - учение) - это наука, изучающая развитие зародыша. 5

История создания клеточной теории 1590 год. Янсен изобрел микроскоп, в котором увеличение обеспечивалось соединением двух линз. 1665 год. Роберт Гук впервые употребил термин клетка. 1650 -1700 годы. Антони ван Левенгук впервые описал бактерии и другие микроорганизмы. 1700 -1800 годы. Опубликовано много новых описаний и рисунков различных тканей, преимущественно растительных. 1827 году Карл Бэр обнаружил яйцеклетку у млекопитающих. 1831 -1833 годы. Роберт Броун описал ядро в растительных клетках. 1838 -1839 годы. Ботаник Матиас Шлейден и зоолог Теодор Шванн объединили идеи разных ученых и сформулировали клеточную теорию, которая постулировала, что основной единицей структуры и функции в живых организмах является клетка. 1855 год. Рудольф Вирхов показал, что все клетки образуются в результате клеточных делений.

История создания клеточной теории 1665 год. Рассматривая под микроскопом срез пробки, английский ученый, физик Роберт Гук обнаружил, что она состоит из ячеек, разделенных перегородками. Эти ячейки он назвал "клетками"

История создания клеточной теории В XVII столетии Левенгук сконструировал микроскоп и открыл людям дверь в микромир. Перед глазами изумленных исследователей замелькали разнообразнейшие инфузории, коловратки и прочая мельчайшая живность. Оказалось, что они повсюду – эти мельчайшие организмы: в воде, навозе, в воздухе и пыли, в земле и водосточных желобах, в гниющих отходах животного и растительного происхождения.

История создания клеточной теории 1831 -1833 годы. Роберт Броун описал ядро в растительных клетках. В 1838 г. немецкий ботаник М. Шлейден привлек внимание к ядру, считал его образователем клетки. По Шлейдену, из зернистой субстанции конденсируется ядрышко, вокруг которого формируется ядро, а вокруг ядра - клетка, причём ядро в процессе образования клетки может исчезать.

История создания клеточной теории Немецкий зоолог Т. Шванн показал, что из клеток состоят и ткани животных. Он создал теорию, утверждающую, что клетки, содержащие ядра, представляют собой структурную и функциональную основу всех живых существ. Клеточная теория строения была сформулирована и опубликована Т. Шванном в 1839 г. Суть её можно выразить в следующих положениях: 1. Клетка – элементарная структурная единица строения всех живых существ; 2. Клетки растений и животных самостоятельны, гомологичны другу по происхождению и структуре. Каждая клетка функционирует независимо от других, но вместе со всеми. 3. Все клетки возникают из бесструктурного межклеточного вещества. (Ошибка!) 4. Жизнедеятельность клетки определяется оболочкой. (Ошибка!)

История создания клеточной теории В 1855 г. немецкий врач Р. Вирхов сделал обобщение: клетка может возникнуть только из предшествующей клетки. Это привело к осознанию того факта, что рост и развитие организмов связаны с делением клеток и их дальнейшей дифференцировкой, приводящей к образованию тканей и органов.

История создания клеточной теории Карл Бэр Еще в 1827 году Карл Бэр обнаружил яйцеклетку у млекопитающих, доказал, что развитие млекопитающих начинается с оплодотворенной яйцеклетки. Значит развитие любого организма начинается с одной оплодотворенной яйцеклетки, клетка является единицей развития.

История создания клеточной теории 1865 г. Опубликованы законы наследственности (Г. Мендель). 1868 г. Открыты нуклеиновые кислоты (Ф. Мишер) 1873 г. Открыты хромосомы (Ф. Шнейдер) 1874 г. Открыт митоз у растительных клеток (И. Д. Чистяков) 1878 г. Открыто митотическое деление животных клеток (В. Флеминг, П. И. Перемежко) 1879 г. Флеминг – поведение хромосом во время деления. 1882 г. Открыт мейоз у животных клеток (В. Флеминг) 1883 г. Показано, что в половых клетках число хромосом в два раза меньше, чем в соматических (Э. Ван Бенеден) 1887 г. Открыт мейоз у растительных клеток (Э. Страсбургер) 1898 г. Гольджи открыл сетчатый аппарат клетки, аппарат Гольджи. 1914 г. Сформулирована хромосомная теория наследственности (Т. Морган). 1924 г. Опубликована естественно-научная теория происхождения жизни на Земле (А. И. Опарин). 1953 г. Сформулированы представления о структуре ДНК и создана ее модель (Д. Уотсон и Ф. Крик). 1961 г. Определены природа и свойства генетического кода (Ф. Крик, Л. Барнет, С. Беннер).

Основные положения современной клеточной теории 1. Клетка - элементарная живая система, единица строения, жизнедеятельности, размножения и индивидуального развития организмов. 2. Клетки всех живых организмов гомологичны, едины по строению и происхождению. 3. Образование клеток. Новые клетки возникают только путем деления ранее существовавших клеток. 4. Клетка и организм. Клетка может быть самостоятельным организмом (прокариоты и одноклеточные эукариоты). Все многоклеточные организмы состоят из клеток. 5. Функции клеток. В клетках осуществляются: обмен веществ, раздражимость и возбудимость, движение, размножение и дифференцировка. 6. Эволюция клетки. Клеточная организация возникла на заре жизни и прошла длительный путь эволюционного развития от безъядерных форм (прокариот) к ядерным (эукариотам).

МЕТОДЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ 1. Световая микроскопия. 2. Ультрафиолетовая микроскопия. 3. Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. 4. Фазово-контрастная микроскопия. 5. Микроскопия в темном поле. 6. Интерференционная микроскопия 7. Поляризационная микроскопия. 8. Электронная микроскопия. 17

Микроскоп n Этот оптический прибор позволяет наблюдать мелкие объекты. Увеличение изображения достигается системой линз объектива и окуляра. Зеркало, конденсор и диафрагма направляют световой поток и регулируют освещение объекта. Механическая часть микроскопа включает: штатив, предметный столик, макро- и микрометрический винты, тубусодержатель. 18

Специальые методы микроскопирования: - фазовоконтрастный микроскоп - (для изуч. живых неокраш-х обьектов)- микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты. При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные – фаза световой волны, что и используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии. - темнопольный микроскоп (для изуч. живых неокраш-х обьектов). Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые объекты. Наблюдаемый объект выглядит как освещённый на тёмном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи. 19

Специальые методы микроскопирования люминесцентный мик-п (для изуч. живых неокраш-х обьектов) микроскопия применяется для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от мощного источника проходит через два фильтра. Один фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Другой фильтр пропускает свет длины волны, излучаемой флюоресцирующим объектом. Таким образом, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра. -ультрафиолетовый способность м-па) мик-п (повышает разрешающую -поляризационный мик-п (для иссл. обьектов с упорядочонным располажением молекул - скелет. муск-ра, коллагеновые волокна и т. д.) микроскопия – формирование изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновые волокна и миофибриллы). 20

Специальые методы микроскопирования -интерфекренционная микроскопия (для опред-я сухового остатка в клетках, определение толщины обьектов) - микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии и применяется для получения контрастного изображения неокрашенных объектов. Специальная интерференционная оптика (оптика Номарского) нашла применение в микроскопах с дифференциальным интерференционным контрастом. В. Электронная микроскопия: -трансмиционная (изучение обьектов на просвет) -сканирующий (изучение поверхности обьектов) Теоретически разрешение просвечивающего ЭМ составляет 0, 002 нм. Реальное разрешение современных микроскопов приближается к 0, 1 нм. Для биологических объектов разрешение ЭМ на практике составляет 2 нм. 21

Специальые методы микроскопирования Просвечивающий электронный микроскоп состоит из колонны, через которую в вакууме проходят электроны, излучаемые катодной нитью. Пучок электронов, фокусируемый кольцевыми магнитами, проходит через подготовленный образец. Характер рассеивания электронов зависит от плотности образца. Проходящие через образец электроны фокусируют, наблюдают на флюоресцирующем экране и регистрируют при помощи фотопластинки. Сканирующий электронный микроскоп применяют для получения трёхмерного изображения поверхности исследуемого объекта. Метод сколов (замораживание-скалывание) применяют для изучения внутреннего строения клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнажённую внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем ЭМ. 22

Специальные (немикроскопические) методы: 1. Цито- или гистохимия - суть заключается использовании строгоспецифических химических реакций с светлым конечным продуктом в клетках и тканях для определения количества различных веществ(белков, ферментов, жиров, углеводов и т. д.). Можно применить на уровне светового или электронного микроскопа. 2. Цитофотометрия - метод применяется в комплексе с 1 и дает возможность количественно оценить выявленные цитогистохимическим методом белки, ферменты и т. д. 3. Авторадиография - вводят в организм вещества, содержащие радиоактивные изотопы химических элементов. Эти вещества включаются в обменные процессы в клетках. Локализацию, дальнейшие перемещения этих веществ в органах определяются на гистопрепаратах по излучению, которое улавливается фотоэмульсией, нанесенной на препарат. 4. Рентгентоструктурный анализ - позволяет определить количество химических элементов в клетках, изучить молекулярную структуру биологических микрообьектов. 24 5. Морфометрия - измерение размеров биол. структур на клеточном и субклеточном уровне.

Специальные (немикроскопические) методы 6. Микроургия - проведение очень тонких операций микроманипулятором под микроскопом (пересадка ядер, введение в клетки различных веществ, измерение биопотенциалов и т. д.) 6. Метод культивирования клеток и тканей - в питательных средах или в диффузионных камерах, имплантированных в различные ткани организма. 7. Ультрацентрофугирование - фракционирование клеток или субклеточных структур путем центрофугирования в растворах различной плотности. 8. Экспериментальный метод. 9. Метод трансплантации тканей и органов. 25

Фиксация сохраняет структуру клеток, тканей и органов, предотвращает их бактериальное загрязнение и ферментное переваривание, стабилизирует макромолекулы путём их химического сшивания. 32

Фиксирующая жидкость формалин, спирты, глутаральдегид - Наиболее распространённые фиксаторы; Криофиксация - Лучшую сохранность структур обеспечивает мгновенное замораживание образцов в жидком азоте (– 196 °С); Лиофилизация – небольшие кусочки ткани подвергаются быстрому замораживанию, прекращающему метаболические процессы. Обезвоживание- стандартная процедура удаления воды-обезвоживание в спиртах, возрастающей крепости (от 70 до 60%). Заливка – делает ткань прочной, предотвращает её раздаваливание и сминание при резании, дает возможность получать срезы стандартной толщины. Наиболее распространенная среда для заливки – парафин. Используют также – целлоидин, пластически среды и смолы. 33

Обезвоживание готовит фиксированную ткань к проникновению в неё сред для заливки. Вода живой ткани, а также вода фиксирующих смесей (большинство фиксаторов – водные растворы) после фиксации должна быть полностью удалена. Стандартная процедура удаления воды – обезвоживание в спиртах возрастающей от 60° до 100° крепости. 34

Заливка – необходимая процедура, предваряющая приготовление срезов. Заливка делает ткань прочной, предотвращает её раздавливание и сминание при резании, даёт возможность получить тонкие срезы стандартной толщины. Наиболее распространённая среда для заливки – парафин. Используют также целлоидин, пластические среды и смолы. 35

Ротационный микротом. 40 n Блоки, содержащие кусочек органа, закрепляют в подвижном объектодержателе. При его опускании на ноже остаются серийные срезы, их снимают с ножа и монтируют на предметное стекло для последующей обработки и микроскопирования.

Методы окраски гистосрезов: n Ядерные (основные): n гематоксилин – окрашивает n n n n ядра в синий цвет; железный гематоксилин; азур II (в фиолетовый); кармин (в красный); сафранин (в красный); метиловый синий (в синий); толуидиновый (в синий); тиониновый (в синий). n Цитоплазматические- (кислые): n эозин – в розовый; n эритрозин; n оранжевый «G» ; n кислый фуксин –в красный; n пикриновая кислота - в желтый; n конго –красный – в красный 44

СПЕЦИАЛЬНЫЕ Методы окраски гистосрезов n Судан III –окраска липидов и жиров в оранжевый цвет; n осмиевая кислота – окраска липидов и жиров в черный цвет; n орсеин -окраска эластических волокон в коричневый цвет; n азотнокислое серебро – импрегнация нервных элементов в темнокоричневый цвет. 45

Структуры клеток: n ОКСИФИЛИЯn способность окрашиваться кислыми красителями в розовый цвет n Базофилияn способность окрашиваться основными красителями в синий цвет n Нейтрофилия – n способность окрашиваться кислыми и основными красителями в фиолетовый цвет. 47

Клетка n - это элементарная живая система, состоящая из цитоплазмы, ядра, оболочки и являющаяся основой развития, строения и жизнедеятельности животных и растительных организмов.

Гликокаликс- надмембранный комплекс, состоит из сахаридов, связанных с белками и сахаридов, связанных с липидами. Функции n Рецепция (гормоны, цитокины, медиаторы и антигены) n Межклеточные взаимодействия(раздражимость и узнавание) n Пристеночное пищеварение (микроворсинки каемчатых клеток кишечника)

Функции цитолеммы: - разграничительная; - активный и пассивный транспорт веществ в обе стороны; - рецепторные функции; -контакт с соседними клетками.

Гистология наука о микроскопическом и субмикроскопическом строении, развитии и жизнедеятельности тканей животных организмов.

Различают следующие иерархические уровни организации живой материи:

клеточный;
тканевой;
структурно-функциональные единицы органов;
органный уровень;
системный уровень;
организменный уровень

Объекты исследования гистологии

Объекты исследования подразделяются на:

живые (клетки в капле крови, клетки в культуре и другие);
мертвые или фиксированные, которые могут быть взяты как от живого организма (биопсия), так и от трупов.

Гистологический препарат

Гистологический препарат может быть в виде:

тонкого окрашенного среза органа или ткани;
мазка на стекле;
отпечатка на стекле с разлома органа;
тонкого пленочного препарата.

Гистологический препарат любой формы должен отвечать следующим требованиям:

сохранять прижизненное состояние структур;
быть достаточно тонким и прозрачным для изучения его под микроскопом в проходящем свете;
быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под микроскопом четко определяться;
препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и использоваться для повторного изучения.

Эти требования достигаются при приготовлении препарата.

Этапы приготовления гистологического препарата

Взятие материала (кусочка ткани или органа) для приготовления препарата.

Фиксация материала необходима для остановки обменных процессов и сохранения структур от распада.

Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме или ультрамикротоме) с помощью специальных ножей.

Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии).

Для целей электронной микроскопии в этапах приготовления препаратов имеются некоторые особенности, но общие принципы те же.

Методы исследования в гистологии

Основным методом исследования биологических объектов, используемым в гистологии является микроскопирование , т. е. изучение гистологических препаратов по микроскопом. Микроскопия может быть самостоятельным методом изучения, но в последнее время она обычно сочетается с другими методами (гистохимии, гисторадиографии и другие). Следует помнить, что для микроскопии используются разные конструкции микроскопов, позволяющие изучить разные параметры изучаемых объектов. Различают следующие виды микроскопии:

световая микроскопия (разрешающая способность 0,2 мкм) наиболее распространенный вид микроскопии;
ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность 0,1 мкм);
люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия для определения химических веществ в рассматриваемых структурах;
фазово-контрастная микроскопия для изучения структур в неокрашенных гистологических препаратов;
поляризационная микроскопия для изучения, главным образом, волокнистых структур;
микроскопия в темном поле для изучения живых объектов;
микроскопия в падающем свете для изучения толстых объектов;
электронная микроскопия (разрешающая способность до 0,1-0,7 нм), две ее разновидности просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия и сканирующая или растровая микроскопии дает отображение поверхности ультраструктур.

Метод интерферометрии позволяет определить сухую массу веществ в живых или фиксированных объектах.

Единицы измерения, используемые в гистологии

Исторические этапы развития гистологии

В истории развития гистологии условно выделяют три периода:

Микроскопический период (с 1665 г. по 1950 г.). Начало периода связывают с именем английского физика Роберта Гука, который, во-первых, усовершенствовал микроскоп (полагают, что первые микроскопы были изобретены в самом начале XVII в.), во-вторых, использовал его для систематического исследования различных, в том числе биологических объектов и опубликовал результаты этих наблюдений в 1665 г. в книге «Микрография», в-третьих, впервые ввел термин «клетка» («целлюля»). В дальнейшем осуществлялось непрерывное усовершенствование микроскопов и все более широкое использование их для изучения биологических тканей и органов.

Особое внимание уделялось изучению строения клетки. Ян Пуркинье описал наличие в животных клетках «протоплазмы» (цитоплазмы) и ядра, а несколько позже Р. Броун подтвердил наличие ядра и в большинстве животных клеток. Ботаник М. Шлейден заинтересовался происхождением клетокцитокенезисом. Результаты этих исследований позволили Т. Швану, на основании их сообщений, сформулировать клеточную теорию (1838-1839 гг.) в виде трех постулатов:

все растительные и животные организмы состоят из клеток;
все клетки развиваются по общему принципу из цитобластемы;
каждая клетка обладает самостоятельной жизнедеятельностью, а жизнедеятельность организма является суммой деятельности клеток.

Современные положения клеточной теории:

клетка является наименьшей единицей живого;
клетки животных организмов сходны по своему строению;
размножение клеток происходит путем деления исходной клетки;
многоклеточные организмы представляют собой сложные ансамбли клеток и их производных, объединенные в системы тканей и органов, связанные между собой клеточными, гуморальными и нервными формами регуляции.
Дальнейшее совершенствование микроскопов, особенно создание ахроматических объективов, позволило выявить в клетках более мелкие структуры:
клеточный центр Гертвиг, 1875 г.;
сетчатый аппарат или пластинчатый комплекс Гольджи, 1898 г.;
митохондрии Бенда, 1898 г.

Современный этап развития гистологии

начинается с 1950 г. с момента начала использования электронного микроскопа для изучения биологических объектов, хотя электронный микроскоп был изобретен раньше (Е. Руска, М. Кноль, 1931 г.). Однако для современного этапа развития гистологии характерно внедрение не только электронного микроскопа, но и других методов: цито- и гистохимии, гисторадиографии и других вышеперечисленных современных методов. При этом обычно используется комплекс разнообразных методик, позволяющий составить не только качественное представление об изучаемых структурах, но и получить точные количественные характеристики. Особенно широко в настоящее время используются различные морфометрические методики, в том числе автоматизированные системы обработки полученной информации с использованием компьютеров.

Объекты исследования подразделяются на:

· живые (клетки в капле крови, клетки в культуре и другие);

· мертвые или фиксированные, которые могут быть взяты как от живого организма (биопсия), так и от трупов.

Гистологический препарат может быть в виде: (тонкого окрашенного среза органа или ткани; мазка на стекле;отпечатка на стекле с разлома органа;тонкого пленочного препарата).

Гистологический препарат любой формы должен отвечать следующим требованиям: (сохранять прижизненное состояние структур;быть достаточно тонким и прозрачным для изучения его под микроскопом в проходящем свете;быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под микроскопом четко определяться; препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и использоваться для повторного изучения.)

Эти требования достигаются при приготовлении препарата.

Методы исследования:

Световая микроскопия -Микроскопирование - основной метод изучения препаратов - используется в биологии уже более 300 лет. Ультрафиолетовая микроскопия - Это разновидность световой микроскопии. В ультрафиолетовом микроскопе используют более короткие ультрафиолетовые лучи с длиной волны около 0,2 мкм. Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия - Явления флюоресценции заключаются в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Фазово-контрастная микроскопия - Этот метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Электронная микроскопия -В электронном микроскопе используется поток электронов с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн.

Главными этапами цитологического и гистологического анализа являются выбор объекта исследования, подготовка его для изучения в микроскопе, применение методов микроскопирования, а также качественный и количественный анализ изображений.

Наиболее часто для изучения используется срез ткани или органа. Гистологические препараты могут изучаться без специальной обработки. Например, приготовленный мазок крови, отпечаток, пленка или срез органа могут сразу рассматриваться под микроскопом. Но вследствие того, что структуры имеют слабый контраст, они плохо выявляются в обычном световом микроскопе и требуется использование специальных микроскопов (фазово-контрастные и др.). Поэтому чаще применяют специально обработанные препараты: фиксированные, заключенные в твердую среду и окрашенные.

Процесс изготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы:

1. взятие материала и его фиксация,

2. уплотнение материала,

3. приготовление срезов,

4. окрашивание или контрастирование срезов.

Для световой микроскопии необходим еще один этап - заключение срезов в бальзам или другие прозрачные среды.

Фиксация обеспечивает предотвращение процессов разложения, что способствует сохранению целостности структур органа.Маленький образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых металлов, осмиевая кислота, специальные фиксирующие смеси), либо подвергают термической обработке

Уплотнение материала, необходимое для приготовления срезов, производится путем пропитывания предварительно обезвоженного материала парафином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например, в жидкой углекислоте.

Приготовление срезов происходит на специальных приборах - микротомах (для световой микроскопии) и ультрамикротомах (для электронной микроскопии).

Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или напыление их солями металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе. Методы окраски гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследования.

Гистологические красители (по химической природе) подразделяют на кислые, основные и нейтральные.Употребительный краситель гематоксилин , который окрашивает ядра клеток в фиолетовый цвет, и кислый краситель - эозин , окрашивающий цитоплазму в розово-желтый цвет. Избирательное сродство структур к определенным красителям обусловлено их химическим составом и физическими свойствами. Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными, а окрашивающиеся основными -базофильными. Например, цитоплазма клеток чаще всего окрашивается оксифильно, а ядра клеток – окрашиваются базофильно.

Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, являются нейтрофильными (гетерофильными). Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для изучения под микроскопом в течение многих лет.

4) . Клетка как структурно-функциональная единица ткани. Определение. Общий план строения эукариотических клеток. Биологические мембраны клетки, их строение, химический состав и основные функции.

Клетка – элементарная структурная, функциональная и генетичес4кая единица в составе всех растительных и животных организмов. Строение эукариотической клетки:

Клетки, образующие ткани животных и растений, значительно различаются по форме, размерам и внутреннему строению.. Клетки всех типов содержат два основных компонента, тесно связанных между собой, -- цитоплазму и ядро. Ядро отделено от цитоплазмы пористой мембраной и содержит ядерный сок, хроматин и ядрышко. Полужидкая цитоплазма заполняет всю клетку и пронизана многочисленными канальцами. Снаружи она покрыта цитоплазматической мембраной.

Собственно тело клетки и ее содержимое отделены от внешней среды или от соседних элементов у многоклеточных организмов плазматической мембраной. Кнаружи от плазматической мембраны расположена клеточная оболочка или стенка, особенно хорошо выраженная у растений. Все внутреннее содержимое клетки, за исключением ядра, носит название цитоплазмы. Цитоплазма эукариотических клеток не однородна по своему строению и составу и включает в себя: гиалоплазму, мембранные и немембранные компоненты. Мембранные органеллы представлены двумя вариантами: одномембранные и двумембранные. К первым относятся органеллы вакуолярной системы – эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы, пероксисомы и другие специальзированные вакуоли, а также плазматическая мембрана. К двумембранным органеллам относятся митохондрии и пластиды, а также клеточное ядро. К немембранным органеллам принадлежат рибосомы, клеточный центр животных клеток, а также элементы цитоскелета (микротрубочки и микрофиламенты).
Термин гиалоплазма основная плазма или матрикс цитоплазмы, обозначает очень важную часть клетки, ее истинную внутреннюю среду. Гиалоплазма является сложной коллоидной системой, включающей в себя различные биополимеры: белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и т.д. В ней локализованы ферменты, участвующие в синтезе аминокислот, нуклеотидов, жирных кислот, в метаболизме сахаров.. Важнейшая роль гиалоплазмы заключается в том, что эта среда объединяет все клеточные структуры и обеспечивает химическое взаимодействие их друг с другом. Через гиалоплазму осуществляется большая часть внутриклеточных транспортных процессов: перенос аминокислот, жирных кислот, нуклеотидов, сахаров. В гиалоплазме идет постоянный поток ионов к плазматической мембране и от нее, к митохондриям, ядру и вакуолям. гиалоплазме происходит отложение запасных продуктов: гликогена, жира. В цитозоле на расположенных там рибосомах синтезируются белки, транспортируемые в разные участки клетки, а также все белки клеточного ядра, большая часть белков митохондрий и пластид, основные белки пероксисом. Структура клеточных мембран.
Общей чертой всех мембран клетки (плазматической, внутриклеточных и мембранных органоидов) является то, что они представляют собой тонкие (6-10 нм) пласты липопротеидной природы (липиды в комплексе с белками), замкнутые сами на себя

Сущесвуют три важных принципа строения мембраны:
Мембраны не однородны. Мембраны, окружающие внутриклеточные органеллы, и плазматическая мембрана отличаются по составу.Многие компоненты мембран находятся в состоянии непрерывного движения. Мембрана напоминает постоянно меняющуюся мозаикю Компоненты мембран чрезвычайно асимметричны. Между наружным и внутренним слоями мембран имеется различие по относительному количеству и качественному составу липидов. Белки располагаются среди липидов асимметрично и имеют хорошо различимые вне- и внутриклеточные участки.

Важнейшими функциями мембран являются следующие:

Мембраны контролируют состав внутриклеточной среды.

Мембраны обеспечивают и облегчают межклеточную и внутриклеточную передачу информации.

Мембраны обеспечивают образование тканей с помощью межклеточных контактов

Химический состав клетки.
Клетки живых организмов сходны не только по своему строению, но и по химическому составу. Сходство в строении и химическом составе клеток свидетельствует о единстве их происхождения.

По составу входящие в клетку вещества делятся на органические и неорганические.
1.Неорганические вещества.
Вода имеет огромное значение в жизнедеятельности клетки. Многие элементы в клетках содержатся в виде ионов. Чаще всего встречаются катионы: K+, Na+, Ca2+ Mg2+, и анионы: H2PO4-, Cl-, HCO3-.
Минеральные соли (например фосфат кальция) могут входить в состав межклеточного вещества, раковин моллюсков и обеспечивать прочность этих образований.
2. Органические вещества.
Характерны только для живого. Органические соединения представлены в клетке простыми малыми молекулами (аминокислоты, моно- и олигосахариды, жирные кислоты, азотистые основания), и макромолекулами биополимеров (белки, липиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты). Молекулы биополимеров состоят из повторяющихся низкомолекулярных соединений (мономеров

Функции клеток. Клетка обладает различными функциями: деление клетки, обмен веществ и

Основными Объектами исследования являются гистологические препараты, а главным методом исследования - микроскопирование.

Гистологический препарат должен быть достаточно прозрачным (тонким) и контрастным. Он изготавливается как из живых, так и из мёртвых (фиксированных) структур. Препарат может представлять собой взвесь клеток, мазок, отпечаток, плёнку, тотальный препарат и тонкий срез.

Процесс изготовления гистологических препаратов для микроскопических исследований включает в себя следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация; 2) уплотнение материала; 3) приготовление срезов; 4)окрашивание, или контрастирование срезов; 5) заключение срезов.

Для окрашивания применяются специальные гистологические красители с различным значением рН: кислые, нейтральные и основные. Структуры, окрашивающиеся ими, соответственно, называются оксифильными, нейтрофильными (гетерофильными) и базофильными.

Какими же методами пользуется гистологическая наука? Они довольно многочисленны и разнообразны:

Микроскопирование.

Световая микроскопия. Современные микроскопы обладают высокоразрешающей способностью. Разрешающая способность определяется наименьшим расстоянием (d) между двумя рядом расположенными точками, которые можно видеть раздельно. Это расстояние зависит от длины световой волны (λ) и выражается формулой: d = 1/2 λ.

Минимальная длина волны видимой части спектра 0,4 мкм. Следовательно, разрешающая способность светового микроскопа составляет 0,2 мкм, а общее увеличение достигает 2500 раз.

Ультрафиолетовая микроскопия . Длина волны ультрафиолетового света – 0,2 мкм, следовательно, разрешающая способность ультрафиолетового микроскопа 0,1 мкм, но так как ультрафиолетовое излучение является невидимым, то для наблюдения исследуемого объекта необходим люминесцентный экран.

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Коротковолновое (невидимое) излучение, поглощаясь рядом веществ, возбуждает их электроны, которые излучают свет с большей длиной волны, становясь видимой частью спектра. Таким образом, добиваются повышения разрешающей способности микроскопа.

Фазовоконтрастная микроскопия позволяет излучать неокрашенные объекты.

Поляризационная микроскопия применяется для изучения архитектоники гистологических структур, например, коллагенового волокна.

Электронная микроскопия даёт возможности изучать объекты, увеличенные в десятки тысяч раз.

Микрофотосъёмка и микрокиносъёмка . Эти методы позволяют изучать фиксированные объекты на фотографиях и живые микроскопические объекты в движении.

Методы качественных и количественных исследований.

Гисто – и цитохимия , в том числе количественная, позволяет проводить качественный анализ исследуемых объектов на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях.

Цитоспектрофотометрия Даёт возможность изучать количественное содержание тех или иных биологических веществ в клетках и тканях на основе поглощения света определённой длины волны связанным ими красителем.

Дифференциальное центрифугирование позволяет разделять содержимое клеток, отличающихся между собой своей массой.

Радиография Основана на включении радиоактивной метки (например, радиоактивного йода, Н³-тимидина и др.) в обменный процесс.

Морфометрия позволяет производить измерение площадей и объёмов клеток, их ядер и органелл с помощью окуляр - и объект-микрометров и специальных сеток.

Применение ЭВМ для автоматической обработки цифрового материала.

Метод культуры тканей представляет собой поддержание жизнеспособности и деления клеток и тканей вне организма. Для этого используют специальные контейнеры с питательной средой, в которых создаются все необходимые условия для жизнедеятельности клеток. С помощью этого метода можно изучать дифференцировку и функциональное становление клеток, закономерности их злокачественного перерождения и развития опухолевого процесса, межклеточное взаимодействие, поражение клеток и тканей вирусами и микроорганизмами, влияние лекарственных препаратов на обменные процессы в клетках и тканях и т. д.

Прижизненное (витальное) окрашивание используется для изучения явлений фагоцитоза и активности макрофагов, фильтрационной способности почечных канальцев и др.

Метод трансплантации тканей . Этот метод применяют с целью изучения поведения клеток и их морфофункционального состояния при их пересадке в другой организм. К примеру, этот метод используется для поддержания жизни животных, подверженных облучению смертельной дозой.

Микроманипуляции. Данный метод получил применение в молекулярной биологии, генной инженерии, а также при клонировании, когда с помощью микроманипулятора удаляют ядро из яйцеклетки с гаплоидным набором хромосом и пересаживают в неё ядро соматической клетки с диплоидным набором хромосом.