ИММУНОМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунологические методы применяют для решения многих задач:

1. Оценка состояния иммунной системы человека (иммунного статуса) по определению количественных и функциональных характеристик клеток иммунной системы и их продуктов.

2. Определение состава и характеристик тканей человека: групп крови, резус фактора, трансплантационных антигенов.

3. Диагностика инфекционных болезней и резистентности к ним по обнаружению и установлению титров антител (серодиагностика), выявлению антигенов возбудителей в организме, определению клеточных реакций на эти антигены.

4. Сероидентификация культур бактерий и вирусов, выделенных из организма человека и животных.

5. Выявление в организме человека и во внешней среде любых веществ, обладающих антигенными или гаптенными свойствами (гормоны, ферменты, яды, лекарства, наркотики и т.п.).

6. Выявление иммунопатологических состояний, аллергий, трансплантационных и противоопухолевых реакций.

Процесс взаимодействия антигена и антитела в серологических реакциях протекает в две фазы:

1) специфическая - фаза взаимодействия, в которой происходит комплементарное соединение активных центров антител (паратопов) и эпитопов антигена. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут;

2) неспецифическая - фаза проявления, характеризуется внешними признаками образования иммунных комплексов. Эта фаза может развиваться от нескольких минут до нескольких часов.

Оптимальное специфическое взаимодействие антител с антигеном происходит в изотоническом растворе с рН, близким к нейтральному. Реакция антиген-антитело в системе in vitro может сопровождаться возникновением нескольких феноменов

· агглютинации,

· преципитации,

· лизиса.

Внешние проявления реакции зависят от физико-химических свойств антигена (размер частиц, физическое состояние), класса и вида антител (полные и неполные), а также условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, рН, температура).

Поливалентность антигенов и антител обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это происходит в соответствии с теорией образования сетей, согласно которой к образовавшемуся комплексу антиген-антитело последовательно присоединяются другие молекулы антител и антигена. В результате формируются сетевые структуры, которые превращаются в агрегаты, выпадающие в осадок. Характер и выраженность реакции зависят от количественного соотношения антигенов и антител. Наиболее интенсивно реакции проявляются в том случае, если реагенты находятся в эквивалентном соотношении.

Необходимое условие образование решетки (сетей) - наличие более трех антигенных детерминант на каждую молекулу антигена и по два активных центра на каждую молекулу антитела. Молекулы антигена являются узлами решетки, а молекулы антител - связующими звеньями. Область оптимальных соотношений (зона эквивалентности) концентраций антигена и антител, когда в надосадочной жидкости после образования осадка не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела.

Агрегаты, способные выпадать в осадок, образуются при соединении антигенов с полными антителами. Неполные антитела (моновалентные) не вызывают образования сетевых структур и крупных агрегатов. Для выявления таких антител используют специальные методы, основанные на использовании антиглобулинов (реакцию Кумбса).

Серологические реакции, благодаря высокой специфичности и чувствительности, применяют для выявления и количественного определения антигенов и антител. Количество иммунореагентов в реакциях выражают титром - максимальным разведением сыворотки или антигена, при котором еще наблюдается реакция.

Серологические реакции в микробиологических и иммунологических лабораториях используют в двух целях:

1) для сероидентификации микроорганизмов, токсинов, антигена вообще с помощью известного антитела (иммунной диагностической сыворотки),

2) для серодиагностики - определения природы антитела в сыворотке крови больного при бактериальных, вирусных, реже других инфекционных заболеваниях с помощью известного антигена (диагностикума).

Для определения родовой, видовой и типовой принадлежности антигена необходимы заведомо известные иммунные диагностические сыворотки. Их получают путем многократного введения животным (чаще кроликам) в нарастающих дозах убитых или живых микроорганизмов, продуктов их распада, обезвреженных или нативных токсинов. После определенного цикла иммунизации животных делают массивное кровопускание или тотальное обескровливание животного. Кровь, собранную в стерильную посуду, сначала помещают в термостат при температуре 37°С на 4 - 6 ч для ускорения свертывания, затем - в ледник на сутки. Полученную прозрачную сыворотку отсасывают в стерильную посуду, добавляют консерванты, определяют титр антител, проверяют на стерильность и разливают в ампулы.

Используются неадсорбированные и адсорбированные диагностические сыворотки. Неадсорбированные сыворотки обладают высокими титрами антител, но способны давать групповые (перекрестные) реакции.

Адсорбированныесыворотки отличаются строгой специфичностью действия (реагируют только с гомологичным антигеном). Сыворотки, содержащие антитела только к одному определенному антигену называются монорецепторными.

Выпускают также сыворотки, меченные флюорохромами, ферментами, радиоизотопами, которые позволяют с высокой степенью точности обнаружить даже следы антигена.

В качестве антигенов (диагностикумы) в серологических реакциях применяют взвеси живых или убитых бактерий, продуктов их расщепления, токсины, вирусы. В ряде случаев используют экстракты или выделенные химическим путем антигены из микроорганизмов и тканей животных.

Все иммуномикробиологические методы можно разделить на 3 группы :

1) основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феномены агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.);

2) основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латекс-агглютинации, угольной аггломерации, бентонит-агглютинации, связывания комплемента и др.);

3) с использованием меченых антител или антигенов (метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализы и другие методы).

РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген);

2) антитело (агглютинин)

3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).

Ориентировочная реакция агглютинации (РА)

Ориентировочная, или пластинчатая, РА ставится на предметном стекле при комнатной температуре. Для этого пастеровской пипеткой на стекло наносят раздельно каплю сыворотки в разведении 1:10 - 1:20 и контрольную каплю изотонического раствора натрия хлорида. В ту и другую бактериологической петлей вносят колонии или суточную культуру бактерий (каплю диагностикума) и тщательно перемешивают их. Реакции учитывают через несколько минут визуально, иногда с помощью лупы (х5). При положительной РА в капле с сывороткой отмечают появление крупных и мелких хлопьев, при отрицательной - сыворотка остается равномерно мутной.

Развернутая реакция агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий.

В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: ++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; - - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).

За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)

Реакция агглютинации (от лат. agglutinatio - склеивание) - склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов.

Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул (например, бактерий), «склеенных» антителами (рис. 7.37). Реакцию агглютинации используют для: определения возбудителя , выделенного от больного; определения антител в сыворотке крови больного; определения групп крови.

Рис. 7.37 а,б . Реакция агглютинации с IgM -антителами (а) и IgG -антителами (б )

1. Определение возбудителя, выделенного от больного Ориентировочная реакция агглютинации на стекле (рис. 7.38). К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Образуется хлопьевидный осадок.

Рис. 7.38.

Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного (рис. 7.39). К разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного.

Рис. 52

2. Определение антител в сыворотке крови больного
Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови больного (рис. 7.39). К разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум.
- Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие 0-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.
- Агглютинация с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.
3. Реакция агглютинации для определения групп крови Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО (табл. б) с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки против антигенов групп крови А (И), В (III). Контролем служат: сыворотка, не содержащая антител, т.е. сыворотка АВ (IV) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эритроциты группы О (I).

Таблица 7.6. Определение групп крови АВО

Результаты реакции		Групповая
		принадлежность
		исследуемой крови
эритроцитов со	сыворотки (плазмы)
стандартными	со стандартными
сыворотками

по микробиологии

«Реакция агглютинации и ее виды (РА)»

План:

1. Введение……………………………………………………………………………………..3

2. РА на стекле………………………………………………………………………………….4

3. Пробирочная РА…………………………………………………………………………….5

4. Используемая литература…………………………………………………………………..7

1. Введение.

Взаимодействие микробного антигена и антител носит строго специфический характер и направлено в животном организме на нейтрализацию возбудителя и его токсинов. Взаимодействие антигена и антител in vitro при определенных условиях сопровождаеют видимые феномены (агглютинация, преципитация, иммунный лизис), что позволяет использовать АГ-АТ-реакции, получившие название серологических (от лат. serum-сыворотка), в практических целях. Биофабрики выпускают антигены и иммуные сыворотки (антитела) известной специфической направленности (диагностические). При помощи таких сывороток в серологических реакциях можно идентифицировать неизвестный микроорганизм или, применяя известный антиген, обнаружить в организме антитела, синтезированные в ответ на внедрение возбудителя, и таким образом поставить диагноз (серологическая диагностика). Кроме того, серологические реакции можно использовать для оценки интенсивности иммунного ответа после вакцинации или перенесенной инфекционной болезни.

Реакции агглютинации, например непрямой агглютинации и Кумбса основаны на взаимодействии in vitro корпускулярных антигеновс антителами и способности образовавшихся комплексов выпадать в осадок. В качестве корпускулярных антигенов используют бактериальные клетки или растворимые антигены, экстрагированные из микроорганизмов и сорбированные на корпускулах носителей: эритроцитах, частицах латекса и т.д.

Антигенные детерминанты корпускулярных антигенов специфически взаимодействуют с гомологичными антителами (специфическая, невидимая фаза реакции), а затем комплексы антиген-антитело образуют крупные, идимые невооруженным глазом конгломераты, которые выпадают в осадок - агглютинат (неспецифическая, видимая фаза реакции). У безжгутиковых форм микробов (бруцелл) образуются зернистые агглютинанты, у жгутиковых (эшерихии, салмонеллы) - крупнохлопчатые, которые оседают на дно пробирки в виде перевернутого зонтика и при встряхивании легко разбиваются. Антигены и антитела взаимодействуют лишь в присутствии электролита (в 0,8%-м растворе хлорида натрия). На течение реакции влияют концентрация соли в электролите, количество микробных клеток во взвеси, крнцентрация сыворотки, рН, температура и другие факторы.

Реакция агглютинации (ра).

Различают агглютинацию специфическую, в основе к-рой лежит взаимодействие антигена с гомологичным антителом, содержащимся в организме животного, к-рому был введен данный антиген (иммуноагглютинация); неспецифическую (химическую), возникающую от изменения рН среды, концентрации электролитов; спонтанную, к-рую наблюдают при суспендировании бактерий (находящихся в R-форме) в физиологическом растворе и при нагревании, что связано с изменением коллоидного состояния бактериальной клетки. Антиген, участвующий в РА, называется агглютиногеном, антитело - агглютинином, образующийся осадок - агглютинатом. При образовании агглютината имеет значение количественное соотношение антигена и антител (феномен оптимума). При избытке или недостатке антител происходит задержка А.

Реакция агглютинации (РА) одна из первых иммунологических реакций, которую применяют в микробиологической практике. Впервые (1895) РА для диагностики брюшного тифа применил Ф. Видаль. Позже (1897) эту же реакцию для диагностики бруцеллеза у людей использовал А. Райт. РА нашла применение также при диагностике пуллороза цыплят, лептоспироза, инфекционного аборта кобыл, а также для типизации неизвестных культур микробов по заведомоизвестной агглютинирующей сыворотке. РА высокочувствительна; с ее помощью можно выявить 0,01 мкг азота белка антител в 1 мл.

Разработано несколько вариантов реакции агглютинации, различающихся по методическому исполнению и цели исследования.

2. Ра на стекле.

При этом варианте РА испытуемыми могут быть как сыворотка, так и антиген, но чаще всего этот вариант используют для идентификации микроорганизмов.

1. Для идентификации микроорганзма (м/о) на обезжиренное предметное стекло наносят раздельно каплю известной агглютинирующей сыворотки, например сальмонелиозной, и каплю физиологического раствора (контроль). Затем бактериологической петлей берут бактериальную массу изучаемой культуры из колонии в чашке Петри или с поверхности скошенного МПА в пробирке и суспендируют раздельно в иммунной сыворотке и физиологическом растворе до получения гомогенной взвеси. Результат учитывают через 2…4 мин.

Учет результатов: в контрольной пробе изменения должны отсутствовать. При специфическом соответствии культуры бактерий иммунной сыворотке появляются хлопья агглютината (положительный результат), в случае отсутствия феномена агглютинации делают заключение о том, что исследуемая культура бактерий не соответствует иммунной сыворотке.

2. Обнаружение аниттел в исследуемой сыворотке крови рассмотрим на примере роз-бенгал пробы, применяемой при серодиагностике бруцеллеза. На предметное стекло наносят 0,3 мл исследуемой сыворотки крови животного и 0,03 мл бруцеллезного антигена (окрашенные розовым-бенгальским клетки бруцелл). Компоненты тщательно перемешивают покачиванием стекла и через 4 мин учитывают результат.

Учет результатов: при положительной реакции появляются розовые хлопья агглютината. Серологическую реакцию подобного типа относят к качественной, так как с ее помощью можно выявлять антитела к возбудителю в сыворотке крови животного, но невозможно оценить их количественное содержание.

Реакция агглютинации.

Реакция агглютинации – это склеивание и выпадение в осадок микробных или других клеток (эритроцитов) под действием антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен агглютинации) – образование осадка, который называется агглютинатом.

Эту реакцию используют для серодиагностики и сероидентификации . РА используют для серодиагностики (обнаружение антител в сыворотке крови больных) брюшного тифа и паратифа (реакция Видаля), бруцеллеза (реакция Райта), туляремии и лептоспироза . РА используют для сероидентификации (определения вида возбудителя, выделенного от больного) при кишечных инфекциях, коклюше, холере и др.

Компоненты реакции:

1. Антиген (агглютиноген) – это целые (не разрушенные) микробные или другие клетки (корпускулярный , нерастворимый антиген ). Агглютиногены – это взвесь живых или убитых микробных клеток или других каких-либо клеток. Антигены могут быть как неизвестными, так и известными. Неизвестный агглютиноген – это микробная культура, выделенная из организма больного, которую необходимо определить. Известный антиген – диагностикум – диагностический препарат - взвесь убитых микробов известного вида в физиологическом растворе. Эта взвесь мутная (непрозрачная ), т.к. микробные клетки не растворяются, а остаются целыми. Известный агглютиноген будет использоваться для обнаружения неизвестных антител в сыворотке крови больных.

2. Антитело (агглютинин) – находится в сыворотке крови. Антитела также могут быть как неизвестными, так и известными. Неизвестные антитела, которые нужно определить, находятся в сыворотке крови больного человека . Известные антитела находятся в иммунных диагностических сыворотках , которые называются агглютинирующими сыворотками . Они используются для сероидентификации, т.е. для определения неизвестного антигена – вида микробной культуры.

3. Электролит – 0,9% раствор хлорида натрия.

Способы постановки РА.

1. Ориентировочная (пластинчатая) РА – проводится на стекле. На предметное стекло наносят 2 капли сыворотки и 1 каплю изотонического раствора. В одну из капель сыворотки и в каплю изотонического раствора петлей вносят микробную культуру и перемешивают. Капля изотонического раствора с микробами – контроль антигена , капля сыворотки без микробов – контроль антитела , капля сыворотки с микробами – опыт. Если в сыворотке имеются антитела, соответствующие микробным антигенам, которые с ней смешиваются, то антитела и антигены будут специфически связываться друг с другом и через 1 – 3 мин в опытной капле появятся хлопья агглютината. Контроль антигена должен быть мутным, а контроль антитела – прозрачным. Учет результатов реакции проводится по появлению хлопьев агглютината . Если выпадают хлопья – реакция положительна, т.е. антиген соответствует антителу и по антигену можно определить антитело или наоборот. Если остается помутнение – реакция отрицательная.

2. Развернутая реакция агглютинации – проводится в пробирках. Вначале готовят 2-хкратные разведения сыворотки крови больного человека от 1:50 до 1:1600. В 6 пробирок наливают по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В первую пробирку вносят 1 мл сыворотки крови больного в разведении 1:50, перемешивают и получают разведение 1:100, затем 1 мл разведения 1:100 переносят во вторую пробирку и получают разведение 1:200 и т.д. Две пробирки оставляют для контроля антигена и сыворотки. В контроль сыворотки добавляют только сыворотку в разведении 1:50, в контроль антигена – только антиген. Во все остальные пробирки добавляют 0,1 мл антигена - диагностикума (О- или Н-) и ставят все пробирки в термостат при 37°С на 18-20 часов. Учет результатов реакции проводят по характеру, количеству образовавшегося осадка (агглютината) и степени мутности. Учет проводят только при следующих результатах в контролях: контроль сыворотки – прозрачный, контроль антигена – мутный. О-антитела дают мелкозернистый осадок. Н-антитела – крупнозернистый. По последней пробирке, в которой еще видна реакция агглютинации, устанавливают диагностический титр.

При серодиагностике заболеваний важно не просто обнаружить специфические антитела к определенному возбудителю, но и выявить их количество, т.е. установить такой титр антител, когда можно говорить о наличии заболевания, вызванного этим возбудителем. Этот титр и называется диагностическим титром. Например, для диагностики брюшного тифа нужно выявить титр антител – 1:400, но не меньше. Еще более точные результаты дает выявление нарастания антител в парных сыворотках.Сыворотку больного отбирают в начале заболевания и через 3 – 5 или более дней. Если титр антител возрастает не менее, чем в 4 раза, следовательно, можно говорить о текущем заболевании.