Какие вещества расщепляются в толстом кишечнике. Всасывание жиров в кишечнике. Всасывание в толстом кишечнике. Вопросы и задания для самоконтроля

Блоттинг (от англ. "blot " - пятно) - перенос НК, белков и липидов на твердую подложку, например, мембрану и их иммобилизация.

• электрофорез в полиакриламидном геле:
o в денатурирующих условиях с добавлением мочевины - разделение коротких одноцепочечных НК;
o в денатурирующих условиях с добавлением натрия додецилсульфата (электрофорез по Лэммли) - разделение белков по молекулярной массе;
o в нативных условиях - разделение белков по трехмерной структуре;
• изоэлектрофокусирование - для разделения белков по изоэлектрической точке (pI);
• двумерный (2D) электрофорез - для разделения белков в двух направлениях - по изоэлектрической точке и по молекулярной массе;
• электрофорез в агарозном геле - разделение НК:
o по длине линейных фрагментов;
o по "суперспирализации" кольцевых молекул;
• тонкослойная хроматография - разделение липидов из липидных комплексов.

• диффузия молекул - медленный перенос, часто применяется для липидов;
• капиллярный блоттинг - мембрана прижимается к гелю, поверх нее кладется стопка фильтровальной бумаги, буфер для переноса увлажняет гель и поднимается под действием капиллярных сил, смачивая фильтровальную бумагу и перенося макромолекулы из геля на мембрану; капиллярный блоттинг может осуществляться:
o в камерах с увлажнением геля буфером - "полусухим" переносом;
o в камерах с погружением геля в буфер;

• вакуумный блоттинг - аналогичен капиллярному блоттингу, но перенос ускоряется за счет использования вакуума вместо капиллярных сил, создаваемых при смачивании фильтровальной бумаги;
• электроблоттинг - перенос заряженных макромолекул на мембрану происходит под действием электрического тока;
• "пришивание" НК к мембране под действием УФ-облучения или нагрева - для окончательного закрепления на нейлоновых мембранах;
• дот-блоттинг (слот-блоттинг) - нанесение образца производится в виде точки или черточки непосредственно на мембрану без предшествующего разделения молекул в геле или на ТСХ-пластине.

• PVDF-мембраны (поливинилиденфторидные);
• NC-мембраны (нитроцеллюлозные);
• нейлоновые мембраны (применяются для НК).

• окрашивание - связывание красителя (ионов серебра, Кумасси, Понсо, этидия бромистого) непосредственно с детектируемыми макромолекулами;
• иммунохимическое мечение - мечение макромолекул происходит за счет специфически связывающихся с ними меченых антител, детекция осуществляется:
o иммуноокрашиванием - антитела метятся красителями, регистрируется поглощение света определенной длины волны;
o иммуноферментно - антитела метятся ферментом, регистрируется количество окрашенного продукта, наработанного в ходе ферментативной реакции (ИФА);
o хемилюминесцентно - антителя метятся репортерным ферментом, который в присутствии субстрата излучает свечение, регистрируется испускание света
определенной длины волны;
o флуоресцентно - антитела метятся флуоресцентной меткой, которая возбуждается светом определенной длины волны, регистрируется испускание света в
более длинноволновой области;
• радиационное мечение - в макромолекулы вводятся радиационные метки (радиоизотопы), детекция осуществляется с помощью:
o авторадиографии (наложением на мембрану фотопленки);
o радиоимаджинга (количественного определения радиационной эмиссии и построения картины взаимного расположения меток);
• гибридизация - связывание нуклеиновых кислот мечеными олигонуклеотидами с комплементарной структурой, детекция, как правило, осуществляется регистрацией испускания радиационного излучения или флуоресценции метки;
• масс-спектрометрия - используется для прямого структурного анализа липидов.

• Саузерн-блоттинг (блоттинг по Саузерну) - по фамилии Эдвина Саузерна, предложившего метод - определение последовательности ДНК в образце и определение числа копий генов в геномной ДНК. Переносу на мембрану предшествует расщепление образца эндонуклеазами рестрикции на фрагменты и их фракционирование электрофорезом в агарозном геле. Анализ на мембране осуществляется гибридизацией с мечеными олигонуклеотидами известной последовательности;
• нозерн-блоттинг - определение последовательности РНК в образце и изучение генной экспрессии (определение мРНК). Аналогичен блоттингу по Саузерну, но исследуются выделенные из образца молекулы РНК, без расщепления эндонуклеазами. Разделение молекул проводят в агарозном геле с добавлением формальдегида (для денатурации РНК) или в полиакриламидном геле с добавлением мочевины (применяется для анализа микроРНК). Иммобилизация молекул РНК на мембране происходит за счет нагревания под вакуумом или "пришиванием" с помощью УФ-облучения;
• вестерн-блоттинг - белковый иммуноблоттинг - аналитический метод, используемый для определения специфических белков в образце. Переносу на мембрану предшествует разделение белков в полиакриламидном геле. Анализ белков на мембране осуществляется иммунохимически;
• фар-вестерн блоттинг - белковый блоттинг, используется для определения белок-белковых взаимодействий, аналогичен вестерн-блоттингу, но вместо антител используются другие белки, специфически связывающиеся с исследуемым белком;
• соузвестерн-блоттинг - определение белков, связывающихся с ДНК, и сайтов в молекулах ДНК, с которыми связываются белки - аналогичен вестерн-блоттингу, но после денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле белки отмываются от натрия додецилсульфата в присутствии мочевины и за счет диффузии переносятся на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве пробы используют меченые фрагменты ДНК разной длины, полученные расщеплением более крупного исследуемого фрагмента геномной ДНК. Связавшиеся молекулы ДНК затем вымываются из каждого комплекса белок-ДНК и анализируются электрофорезом в полиакриламидном геле;
• истерн-блоттинг - определение посттрансляционных модификаций белков (связанных с ними липидов, гликополисахаридов, фосфатных остатков) - аналогичен вестерн-блоттингу, но используются антитела не к белкам, а к липидам, гликополисахаридам и т.д. Также в качестве проб используются помимо антител другие белковые молекулы связывающиеся с исследуемыми (например, лектин);
• фар-истерн-блоттинг - анализ липидов, разделенных высокоэффективной тонкослойной хроматографией. Перенос на мембрану, как правило, осуществляется за счет диффузии. Регистрация производится прямым масс-спектрометрическим структурным анализом.

Содержание

- Введение
- Растворы
- Лизис образца
- Подготовка образца
- Проведение электрофореза
- Перенос белка из ПААГ на мембрану
- Окраска мембраны

Введение

Вестерн-блоттинг - аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце, разделенных путем электрофореза в полиариламидном геле. Далее белки из геля переносят на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану, затем детектируют исследуемые белки с использованием антител, специфичных к конкретному белку и проявляют, используя вторичные антитела.

Растворы

Буфер для лизиса
Буфер NP-40
150 мМ NaCl
1,0% NP-40 (Tergitol® тип NP-40)
50 мМ Трис-HCl, pH 8,0
Ингибиторы протеаз

Sample буфер (x5)
10% SDS
5% 2-меркаптоэтанол
50% глицерин
0,01% бромфеноловый синий
0,4 М Имидазол

Проверить pH и довести до pH 6,8

Разделяющий буфер (буфер нижнего, разделяющего геля)
400 мМ Трис-HCl
0,1% SDS
0,01% TEMED
0,1% персульфат натрия



Буфер для переноса (полусухой)
16 мМ Трис-HCl
200 мМ Глицин
0,1% SDS
20% метанол

Проверить pH и довести до pH 8,3

Буфер для блокировки
150 мМ NaCl
10 мМ Na 2 HPO 4
3-5% обезжиренного сухого молока



Буфер для промывки (PBST)
150 мМ NaCl
10 мМ Na 2 HPO 4
0,2% Tween-20

Проверить pH и довести до pH 7,5

Лизис образца

Приготовление лизата из культуры клеток

1. Поместите емкость с клетками на лед и промойте клетки охлажденным раствором PBS.

2. Полностью удалите раствор PBS, затем добавьте охлажденный буфер для лизиса (1 мл на 10 7 клеток/150 см 2 ; 0,5 мл на 5x10 6 клеток/75 см 2 ).

3. Отделите клетки от пластика, затем аккуратно перенесите суспензию клеток в охлажденную пробирку для центрифугирования.

4. Инкубируйте пробирку с суспензией при постоянном перемешивании в течение 30 минут при +4℃.

5. Отцентрифугируйте суспензию при +4℃. Реккомедуемая стандартная скорость 12000 об/мин в течение 20 мин, однако эти параметры необходимо определять для конкретного эксперимента и типа клеток.

6. Отберите полученный супернатант

Приготовление лизата из тканей

1. Отделите часть исследуемой ткани, используя чистые инструменты.

2. Поместите ткань в пробирку для центрифугирования. Добавьте в пробирку охлажденный буфер для лизиса (0,3 мл/5 мг ткани). Измельчите образец, использую гомогенизатор. Промойте лезвия гомогенизатора 0,2 мл охлажденным буфером для лизиса. Смыв добавьте к образцу. Избегайте излишнего разбавления образца. Минимальная концентрация при нагрузке составляет 0,1 мг/мл. Оптимальный диапазон - 1-5 мг/мл

3. Инкубируйте пробирку с суспензией при постоянном перемешивании в течение 2 часов при +4℃

4. Отцентрифугируйте суспензию при 12000 об/мин в течение 20 минпри +4℃

5. Отберите полученный супернатант

Подготовка образца

1. Определите концентрацию белка в полученных лизатах.

2. Определите необходимое для нагрузки количество белка и добавьте к образцу 5X Sample буфер в 4 раза меньшем объеме.

Мы рекомендуем использовать восстановленные и денатурированные образцы

3. Для восстановления и денатурации образца его необходимо прокипятить в Sample буфере при +100℃ в течение 5 мин.

Проведение электрофореза

Поместите одинаковые количества образцов и маркера молекулярных весов в лунки полиакриламидного геля. Нагрузка для лизата должна составлять 20-30 мкг общего содержания белка, нагрузка для чистого белка - 10-100 нг.
Проведите электрофорез белков в полиакриламидном геле

Для переноса можно использовать нитроцеллюлозную или PVDF мембрану. Активируйте PVDF мембрану предварительно вымочив ее в течение 1 минуты в метаноле. Перед проведением переноса, промойте ее в буфере для переноса. Мы рекомендуем использовать полусухой способ переноса белков на мембрану. Степень переноса белков на мембрану можно проверить, используя краску Ponceau S, перед блокировкой мембраны.

Подготовьте мембрану для переноса в соответствии с рисунком

1. Ополосните мембрану раствором PBS.

2. Для блокировки мест неспецифического связывания проинкубируйте мембрану в буферном растворе для блокировки в течение ночи при +4℃ или в течение 40 минуту при +37℃ и постоянном перемешивании.

3. Для отмывки мембраны проинкубируйте ее 3 раза в растворе PBST в течение 5 минут при +37℃ и постотоянном перемешивании.

4. Проведите инкубацию с антителами к исследуемому белку в растворе PBS в течение 40 минут при +37℃ и постотоянном перемешивании.

5. Для отмывки мембраны проинкубируйте ее 3 раза в растворе PBST в течение 5 минут при +37℃ и постотоянном перемешивании

6. Проведите инкубацию мембраны с вторичными антивидовыми антителами (иммуноконъюгаты) в растворе PBS течение 40 минут при +37℃ и постотоянном перемешивании.

7. Промойте мембрану 5 раз в растворе PBST в течение 5 минут при +37℃ и постотоянном перемешивании.

8. Для детекции связавшихся антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, рекомендуем использовать субстратный раствор DAB.

В практике лабораторной диагностики ин­фекционных заболеваний существует иногда не­обходимость определять антитела не вообще к патогену, а к определенным его белкам (антиге­нам), то есть спектр специфических антител. Если с этой целью использовать метод твердо­фазного иммуноферментного анализа, то в таком случае приходится предварительно из культуры патогена выделять и очищать необходимые анти­гены. Полученные белки наносят отдельно на твердую фазу. В случае использования 96-лу-ночного планшета - в каждую лунку по одному виду антигена. Затем определяют специфичес­кие антитела непрямым методом.

По наличию положительной реакции в лунке с тем или иным антигеном, можно судить о на­личии соответствующих специфических антител. Такого рода иммуноферментные тест-системы предлагаются фирмами-производителями, одна­ко широкое распространение, благодаря боль­шей информативности и простоте исполнения самого исследования, получил метод иммунного блотинга (Western blot).

Иммунный блотинг позволяет определять в сыворотке крови антитела одномоментно и в то же время дифференцированно ко всем диагнос­тически значимым белкам патогена. Перевод с английского Western blot означает западный перенос (дословно - промакивание). История этого необычного термина следующая.

Ученый по фамилии Саузерн (Е. Southern) в 1975 году впервые предложил метод переноса электрофорети чески разделенных фрагментов ДНК из геля на мембрану. По автору метод и был назван Southern blot, что в переводе оз­начает «южный перенос». Метод переноса моле­кул РНК в свою очередь был специалистами прозван Northern blot - «северный перенос». Поначалу в шутку, а затем это название закре­пилось и в официальной научной литературе.

Г. Тоубин в 1979 году опубликовал результа­ты первых опытов по белковому блотингу. В продолжение традиций «географических» на­именований методов переноса биологических макромолекул данный метод стал именоваться «западным» переносом -Western blot.

На первом этапе этого метода осуществляют электрофоретическое разделение смеси белков патогена в полиакриламидном геле в присутст­вии додецилсульфата натрия (ДСН). ДСН, яв­ляясь поверхностно активным веществом, равно­мерно обволакивает молекулы белка и придает всем им отрицательный заряд приблизительно равной величины. Поэтому молекулы движутся в электрическом поле в одном направлении, а скорость продвижения зависит только от разме­ров молекулы (молекулярной массы) белка.

В результате электрофоретической процеду­ры получают гелевую пластину, в толщине ко­торой в виде отдельных тонких линейных зон располагаются белки. По направлению движе­ния они разделяются в следующем порядке: ближе к старту находятся белки большой моле­кулярной массы, порядка 120-150 кДа, а к фи­нишу далее всех продвинулись протеины массой 5-10 кДа. На втором этапе гелевую пластину накладывают на лист нитроцеллюлозы и поме­шают эту конструкцию между электродами ис­точника постоянного тока. Под дей­ствием электрического поля белки перетекают из пористого геля на более плотную мембрану, где достаточно прочно закрепляются.

Полученный блот обрабатывается блокирую­щим раствором, содержащим индифферентные в антигенном отношении белки и/или неионные детергенты (Твин 20), которые блокируют на мембране свободные от антигена места. Затем лист-мембрану разрезают на узкие полоски таким образом, чтобы каждая полоска содержа­ла все антигенные фракции. Описанные этапы выполняются фирмой-производителем.

В коммерческих тест-системах для определе­ния антител методом иммунного блотинга содер­жатся уже готовые к исследованию блоты (по­лоски, или стрипы). Пользователь проводит оп­ределение всего спектра специфических антител к белкам патогена по схеме непрямого метода. В качестве хромогена для проведения цветной (ферментативной) реакции используют раство­римое бесцветное вещество, продукт которого приобретает окраску, становится нераствори­мым и оседает (преципитирует) на нитроцеллю­лозе.

В результате последовательного проведения иммунных и ферментативной реакции при нали­чии в исследуемой пробе антител к белкам пато­гена на блоте появляются темные поперечные по­лоски, расположение которых находится в зоне оп­ределенных белков патогена. Каждая такая полоса свидетельствует о наличии специфических антител к соответствующему антигену. Результат исследования, проведенного методом иммунного блотинга, выдается в виде перечисления антител к конкретным белкам патогена. Например: «выяв­лены антитела к белкам р17 и р24».

Нитроцеллюлозные блоты после проявления могут долго храниться в высушенном виде. Од­нако интенсивность окраски при этом значитель­но ослабевает. Влажные блоты можно фотогра­фировать или с помощью сканеров вводить их графическое изображение в память персональ­ных компьютеров. Специальные компьютерные программы позволяют обрабатывать получен­ные результаты и оперативно отслеживать дина­мику спектра антител при динамическом наблю­дении