Extended agglutination reaction (RA). Tinatayang agglutination reaction (RA). Direktang reaksyon ng hematglutination. Ang reaksyon ng hemagglutination ay ang reaksyon ng hindi direktang hemagglutination

Ang reaksyon ng hindi direktang hemagglutination (RIHA)

Ang paggamit ng mga adsorbed diagnostic na paghahanda ay batay sa prinsipyo ng immunological na pagkilala ng mga istruktura sa ibabaw na patuloy na ipinatupad sa kalikasan. Mula sa puntong ito, walang mga pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng paggamit ng, halimbawa, isang microbial cell o isang artipisyal na carrier na puno ng antigen (antibodies). Ang iba't ibang mga carrier ay ginagamit bilang batayan ng mga sorbed na paghahanda - microbial cells, erythrocytes, latex, bentonin, cholesterol, Sephadex, dermatol, activated carbon, fungal spores, atbp.

Matapos ang gawain ng A.T. Kravchenko (1945), ang mga erythrocyte na nawalan ng kakayahang mabuhay at naayos na may iba't ibang mga kemikal na reagents ay naging pinaka-malawak na ginagamit bilang isang carrier ng antigen o antibodies. Sa prinsipyo ng paggamit ng mga erythrocytes (parehong katutubong at naayos) bilang isang carrier ng antigen, ang reaksyon ng hindi direktang (passive) hemagglutination ay naging laganap.

Ang mungkahi na gamitin ang hindi direktang reaksyon ng hemagglutination (IHA) para sa mga layunin ng diagnostic ay lumitaw sa batayan ng dating binuo na kaalaman tungkol sa mataas na aktibidad ng sorption ng mga erythrocytes. Sa paghahambing sa maraming iba pang mga carrier ng antigens at antibodies, ang mga erythrocytes ay may ilang mga pakinabang sa reaksyon ng hindi direktang hemagglutination. Una, sa isotonic saline solution, bumubuo sila ng isang medyo matatag na pagkakaisa at hindi tumira sa maikling panahon. Pangalawa, ang mga pulang selula ng dugo ng parehong species ng hayop ay magkapareho sa laki. At, sa wakas, ang mga erythrocytes ay medyo madali nang direkta o bilang isang resulta ng espesyal na pagproseso ay nakakabit ng iba't ibang mga aktibong sangkap na serologically.

Ang paglikha ng mga erythrocyte diagnosticums mula sa mga nagpapatatag na erythrocytes ay ginagawang posible na malampasan ang mga paghihirap na lumitaw kapag gumagamit ng mga katutubong erythrocytes.

Sa pag-aaral ng mga erythrocytes na ginagamot sa iba't ibang mga fixative, ang ilan sa kanilang mga karaniwang katangian ay itinatag:

Sa morpolohiya, halos hindi sila naiiba sa mga sariwa;

Hindi hemolyzed sa hypotonic solutions, sa tubig at pagkatapos ng freezing-thawing;

Maaaring i-freeze tuyo;

Ang kanilang mga istruktura sa ibabaw ay nagpapanatili ng kakayahang mabago ng kemikal (hal., tannin, diazo compound) at tumutugon sa mga antigen at antibodies.

Ang pangunahing criterion para sa kalidad ng mga nakapirming erythrocytes ay ang posibilidad ng kanilang paggamit para sa pagkuha ng mga sensitized na paghahanda sa kawalan ng nonspecific agglutination sa pag-stabilize ng mga likido.

Ang paghahanda ng ibabaw ng erythrocytes upang madagdagan ang kapasidad ng sorption para sa mga antigens ay mahalaga sa disenyo ng mga diagnostic na paghahanda. Lalo na laganap ang paggamot ng mga erythrocytes na may tannin.

Sa ilalim ng impluwensya nito, nagbabago ang mga antigenic na katangian ng erythrocytes (permeability, sedimentation rate), ang kanilang paglaban sa mga hemolytic effect ng ilang mga fatty acid ay tumataas. Gayunpaman, ang pangunahing bagay ay nakamit - ang mga tanized erythrocytes ay may mas mataas na kapasidad ng sorption ng mga protina, na kasalukuyang malawakang ginagamit sa paggawa ng mataas na kalidad na antigenic at antibody diagnosticums.

Kasabay ng tanization ng mga erythrocytes, para sa paggawa ng mga erythrocyte diagnosticum at paghahanda ng isang antigen carrier, ginagamit ang mga kemikal na reagents tulad ng bromelain, triopsin, at potassium periodate, na nagbabago rin sa mga lamad ng erythrocyte.

Matapos ihanda ang ibabaw ng mga erythrocytes, ang pinakamahalagang proseso ay nagaganap - ang proseso ng hemosensitization - ang huling yugto sa paggawa ng erythrocyte diagnosticums.

Upang palakasin ang koneksyon sa pagitan ng carrier at antigen, ginagamit ang iba't ibang mga conjugating substance - bisdiazobenzidine, difluorodinitrobenzine, cyanide chloride, cadmium chloride at acetic acid, bromine chloride, formaldehyde, glutaraldehyde, cyanogen bromide, rivanol, amidol, atbp.

Ang paggamit ng mga conjugating substance ay nakakatulong upang maalis ang mga pagkukulang ng tanized erythrocytes na ginagamit para sa sensitization nang walang conjugating substance.

Ang pinakamalawak na ginagamit na conjugating substance ay chromium chloride, glutaraldehyde, diazole black C, at amidol. Ang proseso ng sensitization na may chromium chloride ay nangyayari nang napakabilis - mula 4 hanggang 10 minuto, na umaakit sa atensyon ng mga mananaliksik. Sa kasong ito, ang mga konsentrasyon ng chromium chloride mula 0.05 hanggang 2% ay ginagamit, ang pH ay hindi mas mababa sa 5.0 sa temperatura ng halo ng reaksyon na 20-250 C. Sa proseso ng sensitization na may chromium chloride, mga carboxyl group ng erythrocyte membrane proteins ay isinaaktibo. Bilang resulta, nabuo ang isang covalent bond sa pagitan ng erythrocyte membrane at sensitin.

Ang reaksyon ng hindi direktang hemagglutination ay may mataas na pagtitiyak, dahil ang agglutination ng mga erythrocytes ay nangyayari bilang isang resulta ng pakikipag-ugnayan ng antigen na may mga antibodies na adsorbed sa mga erythrocytes. Ang natatanging tampok nito ay mataas na sensitivity: 0.02-0.05 μg ng antibody protein ay nakita sa loob nito. Sa mga tuntunin ng sensitivity, ito ay makabuluhang lumampas sa mga reaksyon ng immunodiffusion, immunofluorescence, radial immunodiffusion, complement fixation, at neutralization. Ang RNGA ay hindi gaanong sensitibo kaysa sa mga pamamaraan ng radioimmunoelectrophoresis, pagpapasiya ng dami ng protina ng radioactive antibodies sa immunosorbent, enzyme immunoassay.

Ang mga bentahe ng RNGA ay kinabibilangan ng sapat na mataas na reproducibility, kadalian ng pagpapatupad, at ang pangangailangan para sa kaunting halaga ng mga sangkap, lalo na kapag gumagamit ng micromethod.

Sa mga nakalipas na taon, ang RNHA ay nakakita ng malawak na aplikasyon sa pagsusuri ng nakakahawang rhinotracheitis, pagtatae, impeksyon sa adenovirus, impeksyon sa rota- at coronavirus, parainfluenza-3 at impeksyon sa respiratory syncytial.

Nagbibigay kami ng isang halimbawa ng paggawa at paggamit ng isang erythrocyte diagnosticum para sa pagtuklas ng mga antibodies sa mga impeksyon sa rota- at coronavirus.

Ang paraan ng paghahanda ng antibody diagnosticums para sa pagtuklas ng rota- at coronavirus antigens sa RNGA ay ang mga sumusunod: pagkuha ng suspensyon ng mga erythrocytes; pag-aayos ng kanilang mga acroleins; tanization, na nagbibigay-daan sa pagkuha ng matatag na pagsipsip ng kinakailangang protina sa mga erythrocytes; sensitization ng tanized erythrocytes na may immunoglobulins; pagpapasiya ng pagtitiyak ng inihandang diagnosticum. Ang paghahanda ng isang suspensyon ng mga erythrocytes ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagkuha ng dugo ng isang clinically healthy na ram sa isang flask na may glass beads. Pagkatapos ng defibrination ng dugo, ang mga erythrocyte ay dapat hugasan ng 3-5 beses na may isotonic (0.9%) na solusyon ng sodium chloride sa pamamagitan ng centrifugation para sa 15-20 minuto sa 400g.

Upang patatagin ang mga pulang selula ng dugo, ginagamot sila ng acrolein. Tulad ng alam mo, ang pagkilos nito ay medyo banayad kaysa sa formaldehyde, at nagbibigay ng katatagan at mas mataas na aktibidad ng mga erythrocytes. Para dito, ang pantay na dami ng 10% suspension ng erythrocytes ay hinahalo sa isang 0.2% na solusyon ng acrolein na inihanda sa phosphate buffer solution (PBS) na may pH na 7.2. Ang resultang suspensyon ay pinananatili ng 30 min sa 37°C, lubusang paghahalo, na sinusundan ng paglabas ng acrolein sa pamamagitan ng paulit-ulit na sentripugasyon ng 5 min sa 600-800g hanggang sa ganap na mawala ang tiyak na amoy. Ang bentahe ng mga erythrocytes na inihanda sa ganitong paraan ay ang mga ito ay ani para sa hinaharap, maaari silang maimbak ng mahabang panahon nang hindi sumasailalim sa hemolysis.

Kasunod nito, ang mga nagpapatatag na erythrocytes sa isang 10% na konsentrasyon ay pinananatili sa 2-4 °C sa PBS na may pH na 7.2 sa loob ng dalawang buwan.

Upang madagdagan ang kapasidad ng sorption at sedimentation ng mga erythrocytes, kinakailangan na i-tanize ang mga ito sa pamamagitan ng paghahalo ng pantay na bahagi ng isang 10% na suspensyon ng mga hugasan na erythrocytes at isang solusyon ng tannin sa PBS at pH 7.2 sa isang dilution na 1:30,000. Ang timpla ay lubusan na pinaghalo at pinananatili sa 370 C sa loob ng 15 min, pagkatapos nito ang mga erythrocytes ay lubusang hinuhugasan mula sa tannin dalawang beses sa PBS na may pH 7.2 at tatlong beses na may isotonic sodium chloride solution na may pH 7.2-7.4.

Ang pinakamainam na oras upang magarantiya ang pagtanggap ng mataas na kalidad na erythrocyte diagnosticum ay ang kanilang sensitization sa loob ng 24-48 na oras pagkatapos ng kanilang paggamot na may tannin.

Sa proseso ng paggawa ng diagnosticums, 0.3% phenolized isotonic sodium chloride solution na may 0.1% normal na rabbit o horse serum, na dating inactivated sa 56°C sa loob ng 30 minuto at na-adsorb ng normal na sheep erythrocytes, ay ginagamit bilang solvent at preservative. 37°C. para sa 30 min.

Ang sensitization ng tanized erythrocytes ay dapat isagawa gamit ang hyperimmune serum, ayon sa pagkakabanggit, laban sa bovine rota- at coronaviruses (na ginawa sa Ya.R. Kovalenko All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine). Kasabay nito, ang sensitizing dose (konsentrasyon ng protina) ng anti-rotavirus immune serum ay 280 μg/ml, at ang sa immune serum sa coronavirus ay 260 μg/ml.

Ang sensitization ay isinasagawa sa pamamagitan ng paghahalo ng pantay na dami ng tanized erythrocytes at immune serum na pinainit nang 30 minuto sa 560C sa pinakamainam na konsentrasyon. Bilang karagdagan, 3 bahagi ng isotonic sodium chloride solution na may pH na 7.2 at 5 bahagi ng 0.1% chromium chloride solution ay idinagdag. Ang pinaghalong, paminsan-minsan na pagpapakilos, ay pinananatili sa temperatura ng silid sa loob ng 5 minuto. Pagkatapos ng tinukoy na oras, ang halo ay lubusan na hugasan gamit ang PBS na may pH na 7.2, at pagkatapos ay ang inihandang erythrocyte diagnosticum ay muling sinuspinde sa isang preservative sa isang 1% na konsentrasyon. Ang inihandang diagnosticum ay nagpapanatili ng mga pangunahing katangian nito sa loob ng 8 buwan, kung nakaimbak sa 4°C.

Sa lahat ng mga yugto ng paggawa ng diagnosticums, sinusubaybayan ang self-agglutination. Ang pagiging tiyak ng mga inihandang diagnosticum ay natutukoy sa pamamagitan ng pagtatanghal ng RNGA, kung saan ang mga karaniwang diagnosticum ng mga RTI virus, PG-3, adenovirus, viral diarrhea, pati na rin ang rota- at coronavirus antigens ay ginamit bilang antigens.

Kapag nagse-set up ng RNHA, inihahanda ang mga serial double dilution ng pinag-aralan na materyal na naglalaman ng virus (20-50% suspension ng fecal samples), at pagkatapos ay idinagdag ang pantay na dami ng erythrocyte diagnosticum sa bawat balon. Ang mga plato ay dapat na lubusan na inalog nang maraming beses, iniwan sa temperatura ng silid hanggang ang mga erythrocyte ay ganap na naayos sa kontrol. Ang isang tagapagpahiwatig ng isang positibong reaksyon ay ang agglutination ng erythrocyte diagnosticum na may intensity ng agglutination na 2+ sa titer na 1:4 at mas mataas.

Gumagamit ito ng mga erythrocytes o neutral na synthetic na materyales (halimbawa, mga latex particle), sa ibabaw kung saan ang mga antigens (bacterial, viral, tissue) o antibodies ay na-adsorbed. Ang kanilang aglutinasyon ay nangyayari kapag ang naaangkop na sera o antigens ay idinagdag. Ang mga RBC na sensitized na may mga antigen ay tinatawag na antigenic erythrocyte diagnosticum at ginagamit upang makita at mag-titrate ng mga antibodies. Ang mga erythrocyte ay na-sensitize ng mga antibodies. ay tinatawag na immunoglobulin erythrocyte diagnosticums at ginagamit upang makita ang mga antigen.

Ang passive hemagglutination reaction ay ginagamit upang masuri ang mga sakit na dulot ng bacteria (typhoid at paratyphoid, dysentery, brucellosis, plague, cholera, atbp.), protozoa (malaria) at mga virus (influenza, adenovirus infections, viral hepatitis B, tigdas, tick-borne encephalitis, Crimean hemorrhagic fever, atbp.), pati na rin upang matukoy ang ilang mga hormone, upang matukoy ang hypersensitivity ng pasyente sa mga gamot at hormone, tulad ng penicillin at insulin.

Ang reaksyon ng passive hemagglutination (RPHA). Ang passive hemagglutination test ay isang sensitibong paraan ng serological diagnosis at ginagamit para sa parehong maaga at retrospective na diagnosis, pati na rin para sa pagtukoy ng immunological na estado ng mga nabakunahan. Sa mga pasyente na may tularemia, ang mga antibodies ay karaniwang nakikita sa pagtatapos ng ika-1 o ika-2 linggo ng sakit, pagkatapos ng 1-1.5 na buwan ang mga titer ng TPHA ay umabot sa kanilang pinakamataas na halaga (1:100,000-1:20,000, mas madalas na mas mataas). pagkatapos ay bumababa sila sa antas na 1:100-1:200 ay nagpapatuloy sa mahabang panahon.

Sa nabakunahan, ang mga antibodies ay patuloy na nakikita, gayunpaman, sa mas mababang titer, hindi hihigit sa 1:2000-1:5000 1-1.5 na buwan pagkatapos ng pagbabakuna, nananatili sila ng ilang taon sa mababang antas ng 1:20-1:80.

Ang tularemia erythrocyte diagnosticum (antigenic) ay nagsisilbing antigen para sa pagtatakda ng RPHA. Ang gamot ay pormalinized ram erythrocytes sensitized na may tularemia antigen, magagamit sa likido at tuyo na anyo. Paghahanda ng likido - 10% na suspensyon ng mga erythrocytes sa isang formalin solution na 10% na konsentrasyon. Dry lyophilized na paghahanda - vacuum-dry 10% suspension ng erythrocytes nang walang preservative. Bago gamitin, ito ay diluted ayon sa mga direksyon sa label. Para sa pag-set up ng reaksyon sa mga polystyrene plate, ang parehong mga gamot ay ginagamit sa isang 2.5% na konsentrasyon, at kapag nagse-set up ng reaksyon sa microvolumes, sa isang 0.5% na konsentrasyon.

diskarte sa setting ng RPGA. Ang test sera ay diluted na may saline 1:5 (1:10) at pinainit sa 56 degrees C sa loob ng 30 minuto. Pagkatapos nito, upang maalis ang mga heterogenous na antibodies sa ram erythrocytes, ang sera ay ginagamot ng 50% na suspensyon ng pormal na ram erythrocytes. Upang gawin ito, ang mga erythrocyte ay idinagdag sa rate na 2 patak (0.05 ml) bawat 1 ml ng suwero at lubusan na halo-halong sa pamamagitan ng pag-alog. Ang serum ay naiwan hanggang sa kumpletong sedimentation ng mga erythrocytes, o centrifuged pagkatapos ng isang oras sa temperatura ng silid, pagkatapos nito ay handa na para sa pananaliksik.

Ang dilution na likido ay ibinuhos sa dami ng 0.5 ml sa isang bilang ng mga balon ng isang polystyrene plate. Sa isang paunang pag-aaral ng sera, ipinapayong subukan ang mga ito sa pamamagitan ng pag-set up ng reaksyon sa isang maikling hilera ng plato (6-butas). Sa kaso ng pagtuklas ng mga antibodies sa isang maikling serye ng sera, ang sera ay muling susuriin sa isang mahabang serye ng mga dilution (12 balon). Pagkatapos matapon ang diluting liquid, 0.5 ml ng test sera sa isang 1:5 dilution ay idinagdag sa unang balon ng bawat hilera (maikli o mahaba). Pagkatapos, sa parehong mga volume, ang suwero ay titrated na may dalawang-tiklop na dilutions. Kaya, ang mga serum dilution ay nakuha sa isang maikling serye mula 1:10 hanggang 1:320, at sa isang mahaba - mula 1:10 hanggang 1:20480. Pagkatapos ng titration ng sera, isang patak (0.05 ml) ng gumaganang 2.5% na suspensyon ng sensitized erythrocytes ay idinagdag sa bawat balon. Ang mga nilalaman ng mga plato ay lubusang inalog hanggang sa makuha ang isang homogenous na suspensyon. Ang mga plato ay iniiwan sa temperatura ng silid sa isang nakatigil na ibabaw ng mesa. Ang paunang pagpaparehistro ng reaksyon ay isinasagawa pagkatapos ng 2-3 oras, ang pangwakas na pagpapasiya ng titer ay isinasagawa pagkatapos ng kumpletong sedimentation ng mga erythrocytes sa mga balon. Ang mga sumusunod na kontrol ay ibinigay para sa reaksyon: 1) pagsubok ng serum sa isang pagbabanto ng 1:10 sa isang dami ng 0.5 ml + 1 patak ng isang 2.5% na suspensyon ng mga hindi sensitibong erythrocytes; 2) isang diluting liquid sa dami ng 0.5 ml + 1 drop ng 2.5% suspension ng non-sensitized erythrocytes; 3) diluting liquid sa dami ng 0.5 ml + 1 drop ng 2.5% suspension ng sensitized erythrocytes. Ang lahat ng mga kontrol ay dapat magbigay ng malinaw na negatibong reaksyon.

Accounting at pagsusuri ng RPGA. Ang reaksyon ay sinusuri ayon sa sumusunod na pamamaraan:

1) isang matalim na positibong reaksyon (++++) - ang mga erythrocyte ay nahuhulog sa ilalim ng balon sa isang pare-parehong layer sa anyo ng isang "payong", kung saan ang mga scalloped na gilid ay madalas na sinusunod;

2) positibong reaksyon (+++) - ang mga erythrocytes ay sumasakop ng hindi bababa sa 2/3 ng ilalim ng butas;

3) mahinang positibong reaksyon (++) - ang agglutinate ay maliit at matatagpuan sa pinakagitna ng butas;

4) nagdududa na reaksyon (+) - may mga hiwalay na butil ng agglutinate sa paligid ng erythrocyte sediment sa pinakasentro ng butas;

5) negatibo (-) - sa ilalim ng butas, ang mga erythrocyte ay tumira sa anyo ng isang "button" o isang maliit na singsing na may makinis, malinaw na tinukoy na mga gilid.

Ang serum titer ay isinasaalang-alang ayon sa huling serum dilution, na nagbigay ng napakalinaw na reaksyon (hindi bababa sa tatlong plus). Ang pagbabanto ng 1:100 at pataas ay itinuturing na isang diagnostic titer, gayunpaman, tulad ng sa kaso ng RA, kinakailangan na subaybayan ang pagtaas nito.

Ang TPHA sa tularemia ay medyo tiyak at nakakakita ng ilang mga cross-reaksyon lamang sa brucellosis sera. Posible ang differential diagnosis sa pamamagitan ng taas ng mga titer sa TPHA, na mas mataas sa isang homologous antigen.

Pamamaraan ng pagtatakda ng RPHA sa mga microvolume. Maaaring isagawa ang RPHA sa mga microvolumes gamit ang isang Takachi-type microtiter (o round bottom microtiter plates na may micropipettes), na nagpapahintulot sa materyal na ma-titrate sa mga volume na 25 µl at 50 µl. Ang pamamaraan ng pag-set up ng mga reaksyon, ang pagkakasunud-sunod ng lahat ng mga operasyon ay kapareho ng sa pag-aaral sa mga polystyrene plate. Gayunpaman, dapat tandaan na ang sensitivity ng micromethod ay karaniwang isang dilution (ibig sabihin, 2 beses) na mas mababa kaysa sa macromethod.

Upang i-set up ang reaksyon sa isang microtiter gamit ang isang dropper pipette, isang dilution na likido sa dami ng 50 μl ay ipinakilala sa bawat balon. Pagkatapos, gamit ang mga titrator na may 50 μl na ulo, ang test serum ay kinukuha sa pamamagitan ng paglubog ng ulo dito. Tiyaking napuno ng likido ang ulo ng titrator. Ang titrator na may suwero ay inililipat sa unang balon at, hawak ito sa isang patayong posisyon, gumawa ng ilang mga paikot na paggalaw sa magkabilang direksyon. Pagkatapos ang titrator ay inilipat sa susunod na balon at ang pagmamanipula ay paulit-ulit. Maaaring isagawa ang titration nang sabay-sabay sa ilang mga hilera. Pagkatapos ng titration ng buong hilera, ang titrator ay hugasan ng distilled water (na may pagbabago ng 2 bahagi) sa pamamagitan ng mga rotational na paggalaw, ang tubig ay inalis mula sa ulo gamit ang isang pamunas at sinunog sa apoy ng burner.

Pagkatapos ng titration, 25 μl ng erythrocyte diagnosticum ay idinagdag sa mga balon. Ang konsentrasyon ng diagnosticum para sa RPHA sa mga microvolum ay dapat na 0.5% (i.e., isang 2.5% na suspensyon ng mga erythrocytes ay karagdagang natunaw ng 5 beses). Pagkatapos ng pagdaragdag ng mga erythrocytes, ang mga plato ay dapat na malumanay na inalog hanggang sa makuha ang isang homogenous na suspensyon. Ang mga resulta ay maaaring maitala na pagkatapos ng 1-1.5 na oras, na isang makabuluhang bentahe ng RPHA sa isang microtiter. Bilang karagdagan, ang pamamaraang ito ay nangangailangan ng isang maliit na halaga ng lahat ng mga sangkap ng reaksyon at ang pagsubok na sera.

Ang reaksyon ay isinasaalang-alang tulad ng sumusunod:

1) "+" - kumpletong hemagglutination, kung saan ang mga erythrocytes ay nahulog sa ilalim ng balon sa isang pare-parehong layer sa anyo ng isang "payong", na sumasakop ng hindi bababa sa 2/3 ng ilalim;

2) "+ -" - bahagyang hemagglutination, kung saan ang mga erythrocytes ay nahuhulog sa ilalim sa anyo ng isang maluwag na singsing ng isang maliit na sukat;

3) "-" - ang kawalan ng hemagglutination, kapag ang mga erythrocytes ay bumagsak sa ibaba sa anyo ng isang maliit na pindutan o singsing na may makinis na gilid.

Ang pagtitiyak ng isang positibong resulta na nakuha sa TPHA ay maaaring masuri gamit ang isang tatlong bahagi na reaksyon - ang reaksyon ng pagsugpo ng passive hemagglutination (RPHA).

diskarte sa setting ng RTPGA. Ang reaksyong ito ay nakatakda upang kumpirmahin ang pagiging tiyak ng isang positibong resulta ng RPHA kapag ito ay may pagdududa o partikular na interes sa epidemiological. Ang mekanismo ng reaksyon ay binubuo sa tiyak na pagsugpo ng hemagglutination kapag ang isang suspensyon ng pinatay na tularemia bacteria ay idinagdag sa test serum. Tatlong sangkap ang nakikipag-ugnayan sa reaksyon: ang test serum, ang partikular na tularemia antigen at ang antigenic erythrocyte diagnosticum RTPGA ay karaniwang inilalagay sa isang hilera ng 7-8 na balon. Maipapayo na mag-install ng pangalawang RPGA na kahanay sa RTPGA. Ang 0.25 ml ng diluting liquid ay ibinuhos sa dalawang hanay ng mga balon, pagkatapos ay ang test serum sa dami ng 0.25 ml ay idinagdag sa mga unang balon ng parehong mga hilera at titrated. Dalawang magkaparehong hanay ng serum dilutions ang nakuha. Magdagdag ng 0.25 ml ng dilution liquid sa lahat ng mga balon ng pangalawang hilera, at 0.25 ml ng suspensyon ng tularemia bacteria sa mga balon ng unang hilera. Ginagamit ang Tularemia diagnosticum (naglalaman ng 25 bilyong tularemia bacteria bawat 1 ml), na dati nang natunaw ng 50 beses. Ang nasabing suspensyon ay naglalaman ng 500 milyong bakterya sa 1 ml o 125 milyon sa dami ng 0.25 ml. Matapos idagdag ang antigen, ang plato ay naiwan sa loob ng 1 oras sa temperatura ng silid, pagkatapos kung saan ang isang patak (0.05 ml) ng erythrocyte diagnosticum ay idinagdag sa lahat ng mga balon ng parehong mga hilera, ang plato ay inalog at iniwan sa isang patag na ibabaw ng mesa. Ang accounting ay tapos na sa loob ng 2-3 oras.

Accounting at pagsusuri ng RTPGA. Kung ang test serum ay naglalaman ng mga partikular na tularemia antibodies, ang mga ito ay neutralisado ng idinagdag na antigen at ang hemagglutination ay hindi magaganap sa unang hanay ng mga balon, o, na may mataas na serum titer, ang hemagglutination ay makikita sa mas kaunting (2-4) na mga balon kaysa sa ang hilera na may TPHA. Sa kasong ito, ang pagtitiyak ng mga resulta ay nakumpirma. Kung ang hemagglutination ay nabanggit sa parehong mga hilera, i.e. ang mga resulta ng RTHA at RPHA ay nag-tutugma, ito ay nagpapahiwatig ng kawalan ng tularemia antibodies sa test serum. Sa kasong ito, ang pangunahing resulta ng RPHA ay itinuturing na hindi partikular.

Pamamaraan para sa pagtatakda ng RTPGA sa mga microvolume. Ang RTHA, pati na rin ang RPHA, ay maaaring gawin sa mga microvolum gamit ang isang Takachi-type microtiter. Upang gawin ito, 0.25 μl ng diluting liquid ay idinagdag sa mga balon ng microplates sa dalawang hanay ng 7-8 na balon bawat isa. Pagkatapos, sa tulong ng isang titrator, ang 0.25 μl ng test serum ay namarkahan at na-titrate sa parehong mga hanay. Pagkatapos nito, 25 µl ng tularemia antigen (ang konsentrasyon nito ay 500 milyong tularemia bacteria sa 1 ml) ay idinagdag sa bawat balon sa unang hanay, at 25 µl ng diluting liquid sa pangalawang hilera. Ang mga plato ay naiwan sa loob ng 1 oras sa temperatura ng silid, pagkatapos kung saan 25 μl ng antigenic erythrocyte diagnosticum (0.5% na konsentrasyon) ay idinagdag sa lahat ng mga balon ng parehong mga hilera. Ang accounting at pagsusuri ng mga resulta ay isinasagawa katulad ng reaksyon sa macrovolumes.

Nakatakda ang reaksyon:

1) upang makita ang polysaccharides, protina, extract ng bakterya at iba pang mga highly dispersed substance, rickettsiae at virus, na ang mga complex na may agglutinins ay hindi makikita sa conventional RA,

2) upang makita ang mga antibodies sa sera ng mga pasyente sa mga highly dispersed substance na ito at ang pinakamaliit na microorganism.

Sa ilalim ng hindi direkta, o passive, ang agglutination ay nauunawaan ang isang reaksyon kung saan ang mga antibodies ay nakikipag-ugnayan sa mga antigen na dating na-adsorbed sa mga inert na particle (latex, cellulose, polystyrene, barium oxide, atbp. o ram erythrocytes, I (0) -mga pangkat ng dugo ng tao)

Sa reaksyon ng passive hemagglutination (RPHA) bilang isang carrier ay ginagamit erythrocytes. Ang mga erythrocyte na puno ng antigen ay magkakadikit sa pagkakaroon ng mga tiyak na antibodies sa antigen na ito at namuo. Ang antigen-sensitized erythrocytes ay ginagamit sa RPHA bilang isang erythrocyte diagnosticum para sa pagtuklas ng mga antibodies (serodiagnosis). Kung ang mga erythrocyte ay puno ng mga antibodies (erythrocyte antibody diagnosticum), maaari itong magamit upang makita ang mga antigen.

kanin. 3. Scheme ng RPGA: ang mga erythrocytes (1), na puno ng antigen (3), ay nakagapos ng mga tiyak na antibodies (4).

pagtatanghal ng dula. Sa mga balon ng polystyrene tablet ay maghanda ng isang serye ng mga serial dilutions ng suwero. Sa penultimate well nag-ambag - 0.5 ml ng kilalang positibong suwero at sa huling 0.5 ml ng asin (mga kontrol). Pagkatapos, 0.1 ml ng diluted erythrocyte diagnosticum ay idinagdag sa lahat ng mga balon, inalog at inilagay sa isang termostat sa loob ng 2 oras.

Accounting. Sa isang positibong kaso, ang mga erythrocyte ay tumira sa ilalim ng butas sa anyo ng isang pantay na layer ng mga cell na may nakatiklop o tulis-tulis na gilid (isang baligtad na payong), sa isang negatibong kaso, sila ay tumira sa anyo ng isang pindutan o singsing. .

Fig.4. Accounting RNGA (RPGA).

Accounting para sa mga resulta ng rnga set upang makita ang botulinum toxin.

Ang causative agent ng botulism - Clostridium botulinum ay gumagawa ng mga lason ng pitong serovar (A, B, C, D, E, F, G), ngunit ang mga serovar A, B, E ay mas karaniwan kaysa sa iba. Ang lahat ng mga lason ay naiiba sa mga katangian ng antigenic at maaari maiiba sa mga reaksyon sa pamamagitan ng sera na partikular sa uri . Para sa layuning ito, ang isang passive (hindi direktang) hemagglutination reaksyon ay maaaring isagawa sa suwero ng pasyente, kung saan ang pagkakaroon ng lason ay inaasahan, at may mga erythrocytes na puno ng mga antibodies ng antitoxic anti-botulinum sera ng mga uri A, B, E. Normal. ang serum ay nagsisilbing kontrol.

kanin. 3. Pahayag at resulta ng RNGA.

Accounting. Sa isang positibong kaso, ang mga erythrocyte ay tumira sa ilalim ng butas sa anyo ng isang pantay na layer ng mga cell na may nakatiklop o tulis-tulis na gilid (isang baligtad na payong), sa isang negatibong kaso, sila ay tumira sa anyo ng isang pindutan o singsing. .

Konklusyon: Ang botulinum toxin type E ay natagpuan sa suwero ng pasyente.

Hemagglutination inhibition reaction (hrga).

kanin. 8. Hemagglutination inhibition reaction (RTGA) (scheme).

Ang prinsipyo ng reaksyon ay batay sa kakayahan ng AT na magbigkis ng iba't ibang mga virus at neutralisahin ang mga ito, na ginagawang imposible para sa mga erythrocytes na mag-aglutinate. Biswal, ang epekto na ito ay ipinahayag sa "pagpigil" ng hemagglutination. Ginagamit ang RTHA sa pagsusuri ng mga impeksyon sa viral upang matukoy ang mga partikular na antihemagglutinin at tukuyin ang iba't ibang mga virus sa pamamagitan ng kanilang mga hemagglutinin, na nagpapakita ng mga katangian ng Ag.

Ang pag-type ng virus ay isinasagawa sa reaksyon ng RTGA na may isang set ng sera na partikular sa uri. Ang mga resulta ng reaksyon ay isinasaalang-alang sa pamamagitan ng kawalan ng hemagglutination. Ang mga subtype ng Type A na virus na may mga antigen na H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 at iba pa ay maaaring maiiba sa RTGA na may isang hanay ng homologous type-specific na sera

kanin. 9. Mga resulta ng RTGA habang nagta-type ng influenza virus

Mga simbolo: - pagsugpo ng hemagglutination (button); - hemagglutination (payong).

Mga konklusyon: Ang materyal ng pagsubok ay naglalaman ng influenza type A virus na may H3N2 antigen.

Ang reaksyon ay isinasagawa upang makita ang mga antigens ng mga pathogen sa materyal na pagsubok sa pamamagitan ng pagdaragdag ng immune serum dito. Sa pagkakaroon ng isang homologous antigen, ang antibody binding ay nangyayari, samakatuwid, pagkatapos ng pagdaragdag ng antigen-sensitized erythrocytes, ang kanilang agglutination ay hindi nangyayari, na kung saan ay tinasa bilang isang positibong resulta. Para sa higit na sensitivity ng reaksyon, ang tiyak na immune serum ay idinagdag sa materyal ng pagsubok sa isang minimum na halaga (2 hemagglutinating unit). Ang titer ng immune serum ay natukoy dati gamit ang RNGA. Para sa isang hemagglutinating unit, kunin ang nililimitahan na pagbabanto ng serum, na nagiging sanhi ng agglutination ng mga erythrocytes.

Pamamaraan. Ang 0.025 ml ng isang 1% na solusyon ng normal na rabbit serum ay idinagdag sa mga balon ng polystyrene plates o agglutination tubes at ang mga serial 2-fold dilution ng test material ay ginawa. Pagkatapos, 0.025 ml ng immune serum ay idinagdag sa lahat ng mga balon, ang plato ay inalog at iniwan ng 30 minuto sa temperatura na 37ºС o para sa 1 oras sa temperatura ng silid. Dagdag pa, ang 0.025 ml ng antigenic diagnosticum ay idinagdag sa lahat ng mga balon, inalog at iniwan sa loob ng 2 oras, pagkatapos ay isinasaalang-alang ang mga resulta.

Kapag isinasagawa ang reaksyong ito, ang isang immune serum specificity control ay idinaragdag sa control para sa RNGA, na binubuo ng isang partikular na antigen, immune serum (2, 1, 0.5 hemagglutinating unit) at isang suspensyon ng sensitized erythrocytes.

Ginagamit din ang RTNGA upang makita ang mga partikular na antibodies (kumpleto at humaharang), kung saan ang isang dosed na halaga ng antigen ay idinagdag sa test serum. Kung naglalaman ito ng mga antibodies, kung gayon ang mga ito ay nakagapos ng isang antigen, samakatuwid, pagkatapos ng pagdaragdag ng mga erythrocytes na na-sensitized sa mga antibodies (ika-2 yugto ng RTNHA), ang mga erythrocyte ay hindi magkakadikit.

Dahil sa paggamit ng isang minimum na halaga ng antigen (2 neutralizing doses), ang reaksyon ay lubhang sensitibo. Ang bilang ng mga neutralizing doses sa antigenic na paghahanda ay tinutukoy gamit ang RNGA, habang ang mga serial 2-fold dilution ng antigen ay ginagawa sa isang 1% na solusyon ng normal na rabbit serum at isang antibody erythrocyte diagnosticum ay idinagdag sa mga balon. Ang neutralizing dose ng antigen ay ang pinakamataas na pagbabanto nito, na nagbibigay ng kumpletong pagdirikit ng sensitized erythrocytes.

Bago ang reaksyon, ang test sera ay diluted 1:5-1:10 at inactivated sa temperatura na 56°C sa loob ng 30 minuto. Para sa adsorption ng hemagglutinins, isang 50% na suspensyon ng pormal o sariwang hugasan na mga erythrocytes ng tupa ay idinagdag sa sera sa rate na 0.1 ml ng suspensyon bawat 1 ml ng diluted serum. Ang pinaghalong ay inalog at incubated para sa 30 minuto sa 37°C o 1 oras sa room temperatura, pagkatapos kung saan ang mga erythrocytes ay precipitated sa pamamagitan ng centrifugation. Maaari mong iwanan ang serum sa refrigerator hanggang sa susunod na araw para sa pag-ulan ng mga erythrocytes.

Sa panahon ng eksperimento, ang materyal ng pagsubok ay natunaw sa 1% na solusyon ng normal na serum ng kuneho sa dami ng 0.025 ml sa mga balon ng panel ng microtiter. Pagkatapos, 2 neutralizing doses ng antigen sa dami ng 0.025 ml ay idinagdag sa bawat balon. Ang mga plato ay inalog at iniwan sa loob ng 30 minuto sa 37°C o 1 oras sa temperatura ng silid. Pagkatapos, 0.025 ml ng antibody erythrocyte diagnosticum ay idinagdag sa lahat ng mga balon. Ang mga plato ay inalog at incubated para sa 1.5-2 na oras sa temperatura ng kuwarto, pagkatapos kung saan ang mga resulta ng reaksyon ay isinasaalang-alang. Maaari ring gawin ang accounting sa susunod na araw. Ang titer ng pinag-aralan na suwero ay itinuturing na pinakamataas na pagbabanto nito, kung saan ang mga erythrocyte ay hindi magkakadikit.

Ang karanasan ay sinamahan ng mga sumusunod na uri ng kontrol:

1) katatagan ng sensitized erythrocytes (erythrocytes + 1% solusyon ng normal na serum ng kuneho);

2) pagkakumpleto ng pag-ubos ng hemagglutinins sa bawat test serum (test serum sa pinakamaliit na dilution + formalinized erythrocytes);

3) ang kawastuhan ng pagtukoy ng minimum na neutralizing dosis ng antigen (2, 1 at 0.5 ng neutralizing dosis ng antigen + antibody erythrocyte diagnosticum).

Ang reverse indirect hemagglutination (rong) ay ginagamit upang ipahiwatig ang bacterial at viral antigens sa mga test materials, gayundin para sa express diagnostics ng isang bilang ng mga impeksyon.

Kabaligtaran sa RNHA, sa reaksyong ito, ang mga erythrocyte ay hindi sensitized ng isang antigen, ngunit sa pamamagitan ng mga antibodies, ang agglutination na nangyayari kapag ang antigen ay idinagdag.

Ang mga erythrocyte ay preliminarily na naayos na may formalin o glutaraldehyde, at pagkatapos ay sila ay nakatali sa gamma globulin, na nakahiwalay sa immune sera at nililinis mula sa iba pang mga serum na protina. Ang pagbubuklod ng gamma globulin sa ibabaw ng erythrocytes ay nangyayari sa tulong ng chromium chloride. Upang gawin ito, 1 dami ng mga immunoglobulin na nakahiwalay sa immune serum, 1 dami ng 50% na suspensyon ng pormal na erythrocytes at 1 dami ng 0.1-0.2% na chromium chloride solution ay idinagdag sa 8 volume ng distilled water. Ang halo ay naiwan sa loob ng 10-15 minuto sa temperatura ng silid, pagkatapos ay ang mga erythrocytes ay ginagamot bilang isang passive hemagglutination reaction.

Ang pagtitiyak ng antibody diagnosticum ay nasuri sa reaksyon ng pagsugpo ng passive hemagglutination na may homologous antigen. Ang reaksyon ay dapat na inhibited ng isang homologous antigen ng hindi bababa sa 16 na beses at hindi inhibited ng isang heterologous. Gumamit ng kontrol para sa kawalan ng spontaneous hemagglutination.

Sa tulong ng reaksyong ito, ang mga pathogen ay ipinahiwatig sa materyal na kinuha mula sa mga organo ng mga patay na tao at hayop, halimbawa, mula sa utak, pali, atay ng mga baga. Maghanda ng 10% na suspensyon ng mga organ na ito sa isotonic sodium chloride solution, i-centrifuge ang mga ito sa loob ng 30-60 minuto sa 10,000 rpm at gamitin ang supernatant bilang antigen.

Pamamaraan. Maghanda ng 2-tiklop na dilution ng test material (antigen) sa isang stabilizing solution. Gumawa ng 1 patak ng bawat pagbabanto ng antigen sa 3 katabing balon ng microarray (ang reaksyon ay tumatagal ng 3 parallel na hanay ng mga balon). 1 patak ng stabilizing solution ay idinagdag sa bawat balon ng unang hilera, 1 patak ng homologous immune serum sa isang pagbabanto ng 1: 10 ay idinagdag sa mga balon ng pangalawang hilera, 1 patak ng heterologous immune serum ay idinagdag sa mga balon ng ang ikatlong hanay. Ang pangalawa at pangatlong hanay ay nagsisilbing mga kontrol para sa pagtitiyak ng reaksyon. Ang halo ay naiwan sa loob ng 20 minuto sa temperatura ng kuwarto.

Magdagdag ng 1 patak ng 1% na suspensyon ng sensitized erythrocytes (erythrocyte antibody diagnosticum) sa lahat ng mga balon at iling ang mga plato nang lubusan. Ang mga resulta ng reaksyon ay isinasaalang-alang pagkatapos ng 30-40 minuto. Sa pagkakaroon ng isang tiyak na antigen, ang hemagglutination ay nabanggit sa una at ikatlong hilera (na may heterologous serum) at wala sa pangalawang hilera, kung saan ang antigen ay dati nang neutralisado sa homologous serum.

Ang reaksyon ay sinamahan ng mga kontrol ng sensitized erythrocytes para sa spontaneous agglutination.

Reverse indirect hemagglutination inhibition reaction (RTONGA) nagbibigay-daan sa iyo upang matukoy ang pagkakaroon ng mga antibodies sa sera ng mga tao at hayop.

Pamamaraan. Ang mga serum ay natunaw ng 10 beses na may isotonic sodium chloride solution, pinainit ng 20 minuto sa temperatura na 65 ° C upang sirain ang mga di-tiyak na mga inhibitor, at pagkatapos ay ang 2-tiklop na dilution ng sera ay inihanda sa isang stabilizing solution at isang gumaganang dosis ng antigen na naglalaman ng 4 na agglutinating unit. Gumawa ng 1 patak ng bawat serum dilution sa mga balon ng micropanel at magdagdag ng 1 patak ng antigen sa kanila, ang pagbabanto nito ay tumutugma sa gumaganang dosis. Matapos makipag-ugnayan ang mga bahagi ng pinaghalong 20 minuto sa temperatura ng silid, 1 patak ng erythrocyte antibody diagnosticum ay idinagdag sa lahat ng mga balon at inalog nang husto. Pagkatapos ng 1.5-2 na oras ng pagpapapisa ng itlog sa temperatura ng silid, ang mga resulta ng reaksyon ay isinasaalang-alang ng hemagglutination. Ang titer ng serum ay ang pinakamataas na pagbabanto nito, na ganap na pumipigil sa reaksyon ng hemagglutination na may apat na antigen agglutinating unit.

Ang reaksyon ay sinamahan ng mga kontrol ng sensitized erythrocytes para sa spontaneous agglutination sa pagkakaroon ng: a) isang stabilizing solution; b) normal na antigen (mula sa isang materyal na hindi naglalaman ng virus); c) ang test serum. Ang bentahe ng reaksyon ay nakasalalay sa kakayahang magamit nito at ang posibilidad ng paggamit nito upang makita ang iba't ibang mga antigens.

Pagsusuri ng mga resulta ng hemagglutination. Ang mga resulta ng RNGA, RONGA at RTONGA ay isinasaalang-alang ayon sa antas ng erythrocyte agglutination: (++++) - kumpletong agglutination; (+++) - hindi gaanong kumpletong agglutination; (++) - bahagyang agglutination; (+) - mga bakas ng aglutinasyon; (–) – kawalan ng aglutinasyon.

Ang reaksyon ay itinuturing na positibo kung ang agglutination ay kumpleto (++++) o halos kumpleto (+++), ang diagnosticum ay hindi kusang nag-agglutinate sa pagkakaroon ng bawat bahagi ng reaksyon, at ang antigen o antibody specificity control ay positibo. .

Ito ay batay sa katotohanan na ang mga erythrocytes, kung saan ang mga antigen ay pre-adsorbed, ay nakakakuha ng kakayahang mag-agglutinate sa pagkakaroon ng homologous sera (antibodies).

Sa kasong ito, ang mga erythrocytes ay gumaganap ng papel na ginagampanan ng mga carrier na may mga tiyak na determinant, ang agglutination na nangyayari bilang isang resulta ng reaksyon ng antigen + antibody.

Ang mga erythrocyte, sa ibabaw kung saan ang mga antigen ay mahigpit na nakakabit, ay tinatawag na erythrocyte antigenic diagnosticum, o mga erythrocyte na na-sensitize ng antigen.

Ang isa pang uri ng RNHA - ang mga antibodies ay na-adsorbed sa ibabaw ng mga erythrocytes at ang kanilang kasunod na agglutination ay nangyayari sa pagkakaroon ng isang homologous antigen. Sa kasong ito, ang mga naturang erythrocyte ay tinatawag na erythrocyte antibody diagnosticum, o mga erythrocyte na na-sensitize ng mga antibodies.

Sa batayan ng dalawang pangunahing pamamaraang metodolohikal na ito, maraming pagbabago ng RNGA ang binuo at ginagamit. Kaya, ang mga maliliit na karaniwang particle ng latex ay ginagamit bilang mga carrier. Sa kasong ito, ang reaksyon ay tinatawag na latex agglutination reaction (RLA) o Staphylococcus aureus ang ginagamit - ang coagglutination reaction, atbp. Karaniwan, ang mga erythrocyte diagnosticum ay inihahanda sa mga negosyo ng biological na industriya, at ang pangunahing karanasan sa RNGA ay nakatakda na sa diagnostic laboratories.

Ang paghahanda ng erythrocyte diagnosticum ay kinabibilangan ng mga sumusunod na hakbang:

• pag-aayos ng mga erythrocytes na may formaldehyde o glutaric o acrylic aldehydes. Ang mga naprosesong erythrocytes ay nakaimbak nang mahabang panahon. Mas madalas, ang mga erythrocytes ng tupa, tao, manok, atbp ay ginagamit para sa layuning ito;
• paggamot ng mga nakapirming erythrocytes na may solusyon sa tannin. Bilang resulta, ang mga erythrocyte ay nakakuha ng pag-aari ng hindi maibabalik na adsorbing na mga protina (mga virus at antibodies) sa kanilang ibabaw;
• sensitization ng tanized erythrocytes sa pamamagitan ng mga virus o antibodies.

Dapat pansinin na ang mga pamamaraan para sa paghahanda ng mga erythrocyte diagnosticum para sa mga impeksyon sa viral ay iba.

Ang pamamaraan para sa pag-set up ng RNHA para sa pag-detect at pagtukoy ng titer ng antibody ay ang mga sumusunod:

• sa magkakasunod na 2-tiklop na dilution ng serum magdagdag ng pantay na dosis ng erythrocytes na sensitized ng antigen;
• ang timpla ay naiwan sa loob ng 2-3 oras sa temperatura ng silid o para sa 16-18 na oras sa 4 °C;
• isaalang-alang ang mga resulta. Kung ang serum ay naglalaman ng mga antibodies sa virus kung saan ang mga erythrocyte ay na-sensitize, ang hemagglutination ay sinusunod, na sinusuri sa mga krus.

Kinukuha ang serum antibody titer bilang pinakamataas na dilution ng serum na nagbibigay pa rin ng hemagglutination ng hindi bababa sa dalawang crosses.

Ang RNGA ay sinamahan ng lahat ng nauugnay na kontrol. Kadalasan inilalagay nila ang reaksyon sa pamamagitan ng micromethod.

Binibigyang-daan ng RNHA ang paglutas ng mga sumusunod na gawaing diagnostic:

• tuklasin ang mga antibodies at matukoy ang kanilang titer sa serum ng dugo gamit ang isang kilalang erythrocyte antigenic diagnosticum;
• tuklasin at kilalanin ang isang hindi kilalang virus gamit ang isang kilalang erythrocyte antibody diagnosticum.

Mga kalamangan ng RNGA: mataas na sensitivity, kadalian ng diskarte sa pagtatakda at mabilis na pagtugon. Gayunpaman, mahalagang tandaan na may mga malalaking kahirapan sa paghahanda ng mga matatag na erythrocyte diagnosticums (malaking pag-asa sa kadalisayan ng mga sangkap na ginamit, ang pangangailangan upang piliin ang mode ng pag-aayos, tanization at sensitization ng mga erythrocytes para sa bawat uri ng virus). .