Реакции преципитации. Реакция агглютинации, реакция преципитации Иммунная электронная микроскопия
Иммунодиагностические реакции. Реакции антиген-анитело и реакции с меченными компонентами. Использование в целях идентификации микроорганизмов и диагностики инфекционных заболеваний.
Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от лат. serum - сыворотка и logos - учение), т. е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген-антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.
Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др.
При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические антитела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.
В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный, иммунофлюорес- центный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно- . ваны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммунитета характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью.
Ниже приводятся принципы и схемы основных иммунодиагностических реакций. Детальная техника постановки реакций дана в. практических руководствах по иммунодиагностике.
Реакция агглютинации - РА (от лат. aggluti - natio - склеивание) - простая по постановке реакция, при которой происходит связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекуляр- ных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изотонического раствора натрия хлорида.
Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осадка
РА используют для:
определения антител в сыворотке крови больных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля) и других инфекционных болезнях;
определения возбудителя, выделенного от больного;
определения групп крови с использованием моноклональных антител против алло- антигенов эритроцитов.
Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разведениям сыворотки крови больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 °С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.
Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диа- гностикумов (О- и Я-антигенов) со специфическими антителами. Реакция агглютинации с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие термолабильный жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.
Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентировочную реакцию агглютинации, применяя диагностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диагностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больного. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микробами хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увеличивающимися разведениями агглютинирующей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. Одновременно учитывают контроли: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.
Разные родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудняет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии. Получение таким:^особом монорецепторных диагностических агглютинирующих сывороток было предложено А. Кастелляни (1902).
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использовании эритроцитов с адсорбированными на ■х поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови бальных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка (рис. 13.2). При отрицательной реакции эритроциты оседают ■ виде «пуговки». Обычно в РНГА выявляют антитела с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами. Иногда применяют антительные эритроцитарные диагностику мы, на которых адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации - РОНГА). РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.
Реакция коагглютинации . Клетки возбудителя определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие белок А, имеющий сродство к Fc -фрагменту иммуноглобулинов, неспецифически адсорбируют антимикробные антитела, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты (рис. 13.3). РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.
Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО (см. разд. 10.1.4.1) с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки против антигенов групп крови А (II), В (III). Контролем служат: сыворотка, несодер- жащая антител, т. е. сыворотка AB (ГУ) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эритроциты группы 0 (I).
В реакции агглютинации для определения резус-фактора (см. разд. 10.1.4.1) используют антирезусные сыворотки (не менее двух различных серий). При наличии на мембране исследуемых эритроцитов резус-антигена происходит агглютинация этих клеток. Контролем служат стандартные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты всех групп крови.
Реакцию агглютинации для определения антирезусных антител (непрямую реакцию Кумбса) применяют у больных при внутрисосудистом гемолизе. У некоторых таких больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалентными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему анти- резусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов (рис. 13.4). С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов иммунного генеза, например гемолитическую болезнь новорожденных: эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной матери.
Реакции преципитации
Реакция преципитации - РП (от лат. praeci- pito - осаждать,) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
Реакции преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агаро- зы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони. радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектро- форез и др.
Реакция кольцепреципитации . Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках с иммунной сывороткой, на которую наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата (рис. 13.5). Избыток антигена не влияет на результат реакции кольцепреципитации вследствие постепенной диффузии реагентов к границе жидкости. Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципита- иии (реакция Асколи, при сибирской язве/
Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерюни . Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после его затвердевания в нем вырезают лунки размером 2-3 мм. В эти лунки раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с разными антигенами и антителами сыворотки появляется несколько линий преципитата; у идентичных антигенов линии преципитата сливаются; у неидентичных - пересекаются (рис. 13.6).
Реакция радиальной иммунодиффузии . Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольце- зые зоны преципитации вокруг лунок (рис. 13.7). Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют лля определения содержания в крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.
Иммуноэлектрофорез - сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза зносят иммунную сыворотку, антитела которой, диффундируя в гель, образуют в месте - встречи» с антигеном линии преципитации.
Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат. floccus - хлопья шерсти)- появление опалес- ценции или хлопьевидной массы (иммуноп- реципитации) в пробирке при реакции токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.
Иммунная электронная микроскопия - электронная микроскопия микробов, чаще вирусов, обработанных соответствующими антителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется «венчик» из антител, контрастирован- ный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электронно-оптически плотными препаратами.
Реакции с участием комплемента
Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента комплексом антиген-антитело (реакция связывания комплемента, радиального гемолиза и др.).
Реакция связывания комплемента (РСК ) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc -фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент остается свободным (рис. 13.8). РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - ан- тиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.
РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана).
Реакцию радиального гемолиза (РРГ ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии антител) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после че
го к этому комплексу присоединяются компоненты комплемента, вызывая гемолиз.
Реакция иммунного прилипания (РИП ) основана на активации системы комплемента корпускулярными антигенами (бактериями, вирусами), обработанными иммунной сывороткой. В результате образуется активированный третий компонент комплемента (СЗЬ), который присоединяется к корпускулярному антигену в составе иммунного комплекса. На эритроцитах, тромбоцитах, макрофагах имеются рецепторы для СЗЬ, благодаря чему при смешивании этих клеток с иммунными комплексами, несущими СЗЬ, происходят их соединение и агглютинация.
Реакция нейтрализации
Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией. Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген-антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело (рис. 13.9).
Реакция иммунофлюоресценции - РИФ (метод Кунса)
Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой (рис. 13.10), с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.
Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.
Бактерии в мазке, обработанные такой люми- несцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьеи диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
Иммуноферментный метод, или анализ (ИФА)
ИФА - выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
Твердофазный ИФА - наиболее распространенный вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках планшеток из полистирола
При определении антител в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат (хромоген) для фермента.
Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшие- ся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрата для фермента.
Конкурентный вариант ИФА . искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Другой тест - искомые антитела
и меченые антитела конкурируют друг с другом за антигены.
Радиоиммунологический метод, или анализ (РИА)
Высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125 J, 14 С, 3 Н, 51 Сг и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение):
интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
При твердофазном варианте РИА один из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. Другой вариант метода - конкурентный РИА. искомый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант используют для определения количества антигена в исследуемом материале.
РИА применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях - 10~ |0 -И0~ 12 г/л. Метод представляет определенную экологическую опасность.
Иммуноблоттинг
Иммуноблоттинг (ИБ) - высокочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.
Антиген выделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят его (блоттинг - от англ. blot , пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлоз- ную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами»
антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс антиген + антитело больного + антитело против Ig человека выявляют добавлением субстрата/хромогена, изменяющего окраску под действием фермента (рис. 13.12).
ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.
Реакция преципитации основана на образовании преципитата - осаждении иммунных комплексов антиген-антитело. В растворах они выпадают в осадок, а в гелях откладываются в виде полос. Для определения концентрации антител в исследуемом материале используют очищенные антигены, при этом существует несколько способов проведения реакции преципитации.
Преципитация в растворе
Реакция преципитации в растворах имеет особенность: количество преципитата зависит от количества реагента (антител). Если количество антител меньше количества антигена, то увеличение количества последних приводит к большему образованию преципитата. Наибольшее количество преципитата образуется при относительно равном количестве антигенов и антител. Если антиген находится в избыточном количестве по сравнению с антителами, то при увеличении его концентрации количество преципитата уменьшается.Иммунодиффузия
Наиболее распространенный способ проведения реакций преципитации связан с иммунодиффузией - способностью антител и антигенов проникать в гель.Для простой радиальной иммунодиффузии используют гель, в состав которого включены антитела. В тонком слое геля делают круглые прорези и помещают в них исследуемый материал с антигенами, которые проникают вглубь геля, взаимодействуют с антителами и образуют вокруг лунок кольца преципитата. Таким способом определяют содержание иммуноглобулинов в крови.
Многие реагенты для биохимических анализов выпускают зафиксированными на планшетках. В каждой ячейке планшетки содержится строго отмеренное количество реагента, поэтому можно проводить сразу множество анализов с высокой точностью результатов.
При двойной радиальной иммунодиффузии в тонком слое геля на определенном расстоянии друг от друга вырезают два круглых отверстия. В одно помещают реагент, а в другое - исследуемый материал. Антитела и антигены проникают в гель навстречу друг другу. В месте их взаимодействия образуется преципитат.
Для определения концентрации антигена в исследуемом материале измеряют расстояние от лунки с ним до линии преципитата.
В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул. Это могут быть белки, комплексы белков с углеводами и липидами, бактериальные экстракты, различные дизаты или фильтраты бульонных культур микробов. Антитела, участвующие в реакции преципитации, называют преципитинами. Образующийся мелкодисперсный комплекс антиген — антитело выявляется при определенных методах постановки реакции преципитации.
Реакция кольцепреципитации предложена впервые Асколи. Ее используют при диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии, менингита. Метод прост и доступен.
В узкие преципитационные пробирки разливают специфическую иммунную преципитирующую сыворотку и на нее очень осторожно наслаивают антиген. В качестве антигена берут, например, при диагностике сибирской язвы кусочки кожи, шерсти, шкуры павшего животного и др. Их кипятят, жидкость фильтруют и используют как антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца — преципитата свидетельствует о наличии соответствующего антигена.
Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузионной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водорастворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более густой агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в разных участках геля, где и образуются линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген — антитело. Реакцию преципитации ставят обычно при комнатной температуре.
Метод иммуноэлектрофореза получил широкое распространение в последние годы при исследовании антигенной структуры микробов. Комплекс антигенов помещают в луночку, которая находится в центре агарового геля, залитого на пластинку. Затем через агаровый гель пропускают электрический ток, в результате чего различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в поле электрического тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген — антитело появляются линии преципитации.
Реакция преципитации является очень чувствительным методом и ее применяют при исследовании различных белковых и полисахаридных антигенов в судебно- медицинской практике для определения видовой принадлежности пятен крови, спермы, сыворотки, имеющихся на белье и различных предметах. Эту реакцию можно также использовать для выявления различных примесей к молоку, рыбным и мясным продуктам, определения природы белков, входящих в краски старинных мастеров живописи.
В реакции преципитации происходит выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, гаптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.
Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом. От реакции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.
Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для определения видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установлении фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:
1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5 - 1:10.
2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной природы (полные антигены и гаптены).
3. Изотонический раствор.
Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).
Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципитации, должны быть совершенно прозрачными.
Реакция кольцепреципитации . В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2-0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное "кольцо" - преципитат (см. рис. 48).
Реакцию сопровождают рядом контролей (табл. 18). Очень важна последовательность внесения в пробирку ингредиентов реакции. Нельзя наслаивать сыворотку на антиген (в контроле - на изотонический раствор), так как относительная плотность сыворотки больше, она опустится на дно пробирки, и граница между жидкостями не выявится.
Таблица 18. Схема постановки реакции кольцепреципитации
Примечание. + наличие "кольца"; - отсутствие "кольца".
Учет результатов производят через 5-30 мин, в некоторых случаях через час, как всегда начиная с контролей. "Кольцо" во 2-й пробирке свидетельствует о способности иммунной сыворотки вступать в специфическую реакцию с соответствующим антигеном. В 3-5-й пробирках "колец" не должно быть - там нет соответствующих друг другу антител и антигенов. "Кольцо" в 1-й пробирке - положительный результат реакции - говорит о том, что испытуемый антиген соответствует взятой иммунной сыворотке, отсутствие "кольца" ("кольцо" только во 2-й пробирке) свидетельствует о их несоответствии - отрицательный результат реакции.
Реакция преципитации в агаре (геле) . Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсутствие полосы свидетельствует о несоответствии компонентов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изучении токсинообразования у возбудителя дифтерии.
1. В чем основное различие между реакцией агглютинации и преципитации?
2. Почему нельзя применять мутные ингредиенты в реакции преципитации?
Задание
1. Поставьте реакцию кольцепреципитации и зарисуйте результат.
2. Изучите характер взаимодействия антигена с антителом в реакции преципитации в агаре, зарисуйте результат (чашку получите у преподавателя).
Реакция лизиса (иммунный цитолиз)
Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Для реакции необходимы:
1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.
2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвующие в лизисе бактерий; гемолитическая - гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток - итолизины и т. д.
3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок. Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента. Свежий (нативный) комплемент нестоек и легко разрушается при нагревании, встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не дольше двух дней после получения. Для консервации комплемента к нему добавляют 2% борной кислоты и 3% сульфата натрия. Такой комплемент можно сохранять при 4° С до двух недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед употреблением его растворяют в изотоническом растворе до первоначального объема (указан на этикетке).
4. Изотонический раствор.
Реакция гемолиза (табл. 19). Для реакции необходимы:
1. Антиген - 3% взвесь отмытых эритроцитов барана из расчета 0,3 мл осадка эритроцитов и 9,7 мл изотонического раствора.
2. Антитело - гемолитическая сыворотка (гемолизин) против эритроцитов барана; обычно готовят на производстве, лиофилизируют и на этикетке указывают титр.
Титр гемолизина - то наибольшее разведение сыворотки, при котором происходит полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов в присутствии комплемента. Для реакции гемолиза гемолизин берут в тройном титре, т. е. разводят в 3 раза меньше, чем до титра. Например, при титре сыворотки 1:1200, сыворотку разводят 1:400 (0,1 мл сыворотки * и 39,9 мл изотонического раствора). Избыток гемолизина необходим, так как часть его могут адсорбировать другие компоненты реакции.
* (Меньше 0,1 мл сыворотки брать не следует - страдает точность измерения. )
3. Комплемент разводят 1:10 (0,2 мл комплемента и 1,8 мл изотонического раствора).
4. Изотонический раствор.
Таблица 19. Схема реакции гемолиза
Учет результатов. При правильно поставленной реакции в 1-й пробирке произойдет гемолиз - содержимое ее станет прозрачным. В контролях жидкость остается мутной: во 2-й пробирке для наступления гемолиза недостает комплемента, в 3-й - нет гемолизина, в 4-й - нет ни гемолизина, ни комплемента, в 5-й - антиген не соответствует антителу,
В случае надобности гемолитическую сыворотку титруют по следующей схеме (табл. 20).
Перед титрованием готовят исходное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки и 9,9 мл изотонического раствора), из которого делают необходимые разведения, например:
Из этих разведений вносят по 0,5 мл сыворотки в пробирки опыта титрования, как показано в табл. 20.
Таблица 20. Схема титрования гемолитической сыворотки (гемолизина)
В примере, приведенном в табл. 20, титр гемолитической сыворотки равен 1:1200.
При использовании свежей гемолитической сыворотки ее необходимо инактивировать, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ лучше: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки непригодны для опыта.
Реакция бактериолиза . В этой реакции комплемент лизирует бактерии в присутствии соответствующей (гомологичной) сыворотки. Схема реакции принципиально сходна со схемой реакции гемолиза. Отличие состоит в том, что после двухчасовой инкубации из всех пробирок делают высев на чашки Петри со средой, благоприятной для взятого в опыт микроорганизма, чтобы узнать, лизирован ли он. При правильно поставленном опыте в посевах из 2-5-й пробирок (контроли) должен быть обильный рост. Отсутствие роста или слабый рост в посеве из 1-й пробирки (опыт) говорит о гибели микробов, т. е. о том, что они гомологичны антителу.
Внимание! Реакцию бактериолиза необходимо проводить в асептических условиях.
Контрольные вопросы
1. Что произойдет с эритроцитами, если вместо изотонического раствора натрия хлорида применить дистиллированную воду? Что лежит в основе этого феномена?
2. Какая реакция произойдет при взаимодействии эритроцитов с гомологичной иммунной сывороткой в отсутствии комплемента?
Задание
Поставьте реакцию гемолиза. Зафиксируйте и зарисуйте результат.
В реакции преципитации происходит выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, гаптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.
Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом . От реакции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.
Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для определения видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установлении фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:
1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100 000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5 -1:10.
2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной природы (полные антигены и гаптены).
3. Изотонический раствор.
Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).
Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципитации, должны быть совершенно прозрачными.
Реакция кольцепреципитации. В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2 - 0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное «кольцо» - преципитат.
Реакция преципитации в агаре (геле). Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсутствие полосы свидетельствует о несоответствии компонентов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изучении токсинообразования у возбудителя дифтерии.
Реакция лизиса (иммунный цитолиз)
Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Для реакции необходимы:
1. Антиген -микробы, эритроциты или другие клетки.
2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвуюищие в лизисе бактерий; гемолитическая- гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток- итолизины и т. д.
3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок. Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента.
4. Изотонический раствор .