Какую кровь приносит плод у пупочная вена. Все о пуповине. Когда с пуповиной что-то не так

Промежуточные филаменты (ПФ) строятся из фибриллярных мономеров. Поэтому основная конструкция промежуточных филаментов напоминает канат, имеющий толщину около 8-10 нм. Они локализуются главным образом в околоядерной зоне и в пучках фибрилл, отходящих к периферии клеток и располагающихся под плазматической мембраной (рис. 238, 240, 241). Встречаются промежуточные филаменты во всех типах клеток животных, но особенно обильны в тех, которые подвержены механически воздействиям: клетки эпидермиса, нервные отростки, гладкие и исчерченные мышечные клетки. В клетках растений ПФ не обнаружены.

В состав промежуточных филаментов входит большая группа изобелков, родственных белков, которую можно разделить на четыре типа. Первый – кератины , кислые и нейтральные, встречающиеся в эпителиальных клетках; они образуют гетерополимеры из этих двух подтипов. Кератины, кроме того, имеют некоторую гетерогенность, зависящую от тканевого источника. Так, в эпителиях встречается до 20 форм кератинов, 10 форм других кератинов найдено в волосах и ногтях. Молекулярный вес кератинов колеблется от 40 до 70 тыс.

Второй тип белков ПФ включает в себя три вида белков, имеющих сходный молекулярный вес (45-53 тыс.). Это – виментин , характерный для клеток мезенхимного происхождения, входящий в состав цитоскелета клеток соединительной ткани, эндотелия, клеток крови. Десмин – характерен для мышечных клеток, как гладких, так и исчерченных. Глиальный фибриллярный белок входит в состав ПФ некоторых клеток нервной глии – в астроциты и некоторые Шванновские клетки. Периферин – входит в состав периферических и центральных нейронов.

Третий тип – белки нейрофиламентов (мол. вес от 60 до 130 тыс.) встречается в аксонах нервных клеток.

И наконец, четвертый тип – белки ядерной ламины . Хотя эти последние имеют ядерную локализацию, они сходны по строению и свойствам со всеми белками промежуточных филаментов.

Как уже говорилось, промежуточные филаменты, построены из фибриллярных белков наподобие каната. При этом некоторые белки могут образовывать сополимеры, например виментин с десмином, или виментин с глиальными белками.

Все белки промежуточных филаментов обладают сходной аминокислотной последовательностью из 130 остатков в центральной части фибриллярной молекулы, которая обладает a-спиральным строением. Концевые же участки молекул имеют разные последовательности аминокислот, разную длину, и не имеют a-спирального строения. Наличие протяженных a-спиральных участков позволяет двум молекулам образовывать двойную спираль, подобно тому, что приводит к образованию палочковидного димера, длиной около 48 нм. Два димера, объединяясь бок о бок, образуют короткий протофиламент, тетрамер, толщиной около 3 нм. Такие протофиламенты могут объединяться в более толстые и длинные фибриллы и в конечном итоге в промежуточный полный филамент, состоящий из 8 продольных протофиламентов (рис. 242).

Иначе полимеризуются белки ядерной ламины: они образуют димеры с головками на одном конце и полимеризуются, образую рыхлую прямоугольную решетку. Такие слои ламины быстро разрушаются во время митоза при фосфорилировании ламинов.

Цитоплазматические промежуточные филаменты относятся к самым стабильным и долгоживущим элементам цитоскелета. Однако in vivo наблюдается включение инъецированных меченых молекул кератина в состав ПФ эпителиальных клеток. ПФ устойчивы к действию солей низкой и высокой концентрации, разрушаются только после воздействия денатурирующих растворов, таких как мочевина.

Такая структура и химическая устойчивость промежуточных филаментов, вероятно, определяет и их физическую устойчивость. Они служат как бы истинно опорной системой в клетках подвергающихся значительным физическим нагрузкам. В клетках кожного эпидермиса промежуточные филаменты образуют пучки (тонофиламенты), связанные с десмосомами, и создают жесткую внутриклеточную сеть (рис. 243). Так, в нервных аксонах, простирающихся на многие десятки сантиметров, ПФ или нейрофиламенты создают жесткую основу, обеспечивающую гибкость и целостность тонких цитоплазматических отростков нервных клеток. В поперечно исчерченных мышечных клеток десминовые филаменты входят в состав z-дисков и связывают их друг с другом как в составе саркомера, так и в соседних миофибриллах, а также с плазматической мембраной.

Специфических ингибиторов полимеризации белков промежуточных филаментов пока еще не найдено. Поэтому остается неясным сам процесс сборки и разборки этих элементов цитоскелета в живой клетке. Вероятнее всего, что они подобно ламинам деполимеризуются при действии цитоплазматических киназ, приводящих к их фосфорилированию. Выделенные промежуточные филаменты под действием фосфорилаз могут распадаться на мономеры, деполимеризоваться.

Топографически в клетке расположение промежуточных филаментов повторяет расположение микротрубочек, они как бы идут бок о бок. При разрушении микротрубочек колхицином, происходит т.н. колапс промежуточных филаментов: они собираются в плотные пучки или кольца вокруг ядра. Восстановление новой сети промежуточных филаментов начинается от зоны клеточного центра. Это наводит на мысль, что центром их полимеризации или нуклеации могут быть центры, общие с микротрубочками.

Глава 21.Микрофиламенты

Общие свойства микрофиламентов .

Микрофиламенты встречаются во всех клетках эукариот. Особенно они обильны в мышечных волокнах и клетках – высокоспециализированных клетках, выполняющих функции сокращения мышц. Микрофиламенты (МФ) входят также в состав специальных клеточных компонентов, таких как микроворсинки, ленточные соединения эпителиальных клеток, в состав стереоцилий чувствительных клеток. МФ образуют пучки в цитоплазме подвижных клеток животных, и образуют слой под плазматической мембраной – кортикальный слой (рис. 244а, 245). У многих растительных клеток и клеток низших грибов они располагаются в слоях движущейся цитоплазмы.

Основным белком микрофиламентов является актин. Актин – неоднородный белок, в различных клетках могут быть разные его варианты или изоформы, каждая из которых кодируется своим геном. Так, у млекопитающих есть 6 различных актинов: один в скелетных мышцах, один в сердечной мышце, два типа – в гладких мышцах (один из них в сосудах), и два, немышечных, цитоплазматических актина, являющихся универсальным компонентом любых клеток млекопитающих. Все эти изоформы актина очень сходны по аминокислотным последовательностям, вариантными в них являются концевые участки, которые определяют скорость полимеризации, но не влияют на сокращение. Такое сходство актинов, несмотря на некоторые отличия, определяет их общие свойства. Актин имеет молекулярный вес около 42 тыс. и в мономерной форме имеет вид глобулы (G-актин), содержащей в своем составе молекулу АТФ. При его полимеризации образуется тонкая фибрилла (F-актин) толщиной 8 нм, представляющая собой пологую спиральную ленту (рис. 246). Актиновые микрофиламенты полярны по своим свойствам. При достаточной концентрации G-актин начинает самопроизвольно полимеризоваться. При такой спонтанной полимеризации актина на образовавшейся нити микрофиламента один из ее концов быстро связывается с G-актином (+)- конец микрофиламента) и поэтому растет быстрее, чем противоположный (минус-конец). Если концентрация G-актина будет недостаточной, то образовавшиеся фибриллы F-актина начинают разбираться. В растворах, содержащих т.н. критическую концентрацию G-актина, будет устанавливаться динамическое равновесие между полимеризацией и деполимеризацией, в результате чего фибрилла F-актина будет иметь постоянную длину (рис. 247). Из этого следует, что актиновые микрофиламенты представляют собой очень динамичные структуры, которые могут возникать и расти или же, наоборот, разбираться и исчезать в зависимости от наличия глобулярного актина. На растущем конце нити актина встраиваются мономеры, содержащие АТФ. По мере нарастания полимера происходит гидролиз АТФ, и мономеры остаются связанными с АДФ. Молекулы актина, связанные с АТФ, прочнее взаимодействуют друг с другом, чем мономеры, связанные с АДФ.

В клетках такая, казалось бы, неустойчивая фибриллярная система, стабилизируется массой специфических белков, ассоциирующих с F-актином. Так, белок тропомиозин , взаимодействуя с микрофиламентами, придает им необходимую жесткость. Целый ряд белков, например филамин и a-актинин образуют поперечные скрепки между нитями F–актина, что приводит к образованию сложной трехмерной сети, придающей гелеобразное состояние цитоплазме. Другие дополнительные белки могут связывать филаменты в пучки (фимбрин) и т.д. Кроме того, существуют белки, взаимодействующие с концами микрофиламентов и предотвращая их разборку, стабилизируют их. Взаимодействие F–актина со всей этой группой белков регулирует агрегатное состояние микрофиламентов, их рыхлое или наоборот тесное расположение, связь их с другими компонентами. Особую роль при взаимодействии с актином играют белки миозинового типа , которые образуют вместе с актином комплекс, способный к сокращению при расщеплении АТФ (см. ниже) (рис. 262).

Таким образом, МФ представляют собой фибриллы полимеризованного актина, связанного с многими другими белками. В принципе микрофиламенты во всех немышечных клетках могут осуществлять по крайней мере два ряда функций: быть частью сократительного аппарата, взаимодействуя с моторными белками (миозин), или участвовать в формировании скелетных структур, способных к собственному движению за счет процессов полимеризации и деполимеризации актина.

Особенно много сведений о цитоскелете, и о микрофиламентах получено при изучении фибробластов в культуре ткани, обладающих способностью к амебоидному движению. Эти клетки не имеют ответственных за движение постоянных фибриллярных структур, их фибриллярный аппарат все время находится в реорганизации: часть фибриллярных элементов разбирается в одних участках клетки и новообразуется в других.

Обычно ползущий по поверхности субстрата фибробласт поляризован: у него есть движущийся конец и “хвостовой” отдел. (рис. 248, 249) На движущемся конце, который часто более распластан по субстрату, чем боковые и хвостовые участки фибробласта, постоянно возникают и убираются тонкие нитевидные или пластинчатые выросты – ламеллоподии. Это – ведущий край клетки (ламеллоплазма). Который и обеспечивает движение фибробласта вперед. В таком движущемся фибробласте с помощью антител можно узнать места расположения актина. Он будет распределяться по трем основным частям клетки: он в виде тонкого слоя (1) располагается по всему периметру клетки под плазматической мембраной. Это кортикальный (cortex – кора) слой. Обильно актин выявляется в выростах цитоплазмы ведущего края клетки (2) и (3) в пучках актиновых филаментов, отходящих от ведущего края вглубь клетки (рис. 245).

Кортикальный слой состоит из плотной трехмерной сети актиновых филаментов, ассоциированных с плазматической мембраной (таб.). Он обеспечивает механическую устойчивость поверхностному слою цитоплазмы и создает условия, позволяющие клетке изменять свою форму и двигаться. Этот слой постоянно меняет свое агрегатное состояние, переходя из состояния структурированного геля в жидкий золь. Такие переходы гель-золь связаны с изменениями в структуре кортикального слоя. Здесь в ассоциации с актиновыми филаментами находятся фибриллярные белки-стабилизаторы (например, филамин ), которые образуют сшивки в местах пересечения филаментов, что придает жесткость всему кортикальному слою. Однако эта жесткость может быть легко снята за счет взаимодействия с другими белками, такими как гельзолин, которые вызывают фрагментацию и разборку филаментов и тем разжижают гель. Такая перестройка подмембранного слоя особенно выражена в ведущем крае, что позволяет быстро менять форму его поверхности, образовывать ламеллоподии и двигаться вперед. С другой стороны сеть актиновых филаментов способна к сокращению, т.к. в ней обнаружены короткие миозиновые агрегаты. Это приводит или к втягиванию ламеллоподий или же к подтаскиванию клеток вперед. Сеть актиновых филаментов в ведущем крае организована более определенно, чем в остальном кортексе. Здесь от небольших начальных выростов плазмалеммы внутрь клетки отходят пучки актиновых филаментов, оканчивающихся своими (+)-концами на плазматической мембране.

Сам процесс образования актиновых филаментов и их роста в зоне ламеллоплазмы зависит от ряда регуляторных белков. Один из них белок WASp/Scar связывается с плазматической мембраной. В его составе есть участки, связывающиеся с актином, другой специальный белковый комплекс Arp2/3, который связывается с (-)-концом растущей цепи полимера, препятствуя его деполимеризации. Такие сложные взаимодействия двух групп регуляторных белков приводят к тому, что на границе с плазматической мембраной происходит надстраивание растущих филаментов, которые могут прогибать плазматическую мембрану так, что возникает тонкий вырост – филоподия (рис. 250).

Иначе происходит полимеризация актина при образовании ламеллоподий. Здесь также ведущую роль играют белки WASp/Scar, которые закрепляются на плазматической мембране и связываются с комплексом Arp2/3и прикрепляют его к боковой поверхности уже готовой актиновой фибриллы. Комплекс Arp2/3 инициирует полимеризацию новой актиновой фибриллы, которая начинает расти под углом около 70 0 по отношению к первичной нити актина и закрепляется на плазматической мембране. Таких новых белковых цепей возникает несколько, и они как бы веером простираются к плазматической мембране и толкают ее вперед. Так образуется псевдоподия или ламеллоподия (рис. 251) За счет наращивания актиновых филаментов на (+) концах. Одновременно с этим происходит деполимеризация тех (-) концов филаментов, которые не заблокированы комплексами Arp2/3 и подвергаются воздействию белков, способствующих деполимеризации МФ.

Таким образом сложный процесс роста МФ приводит к перемещению в пространстве края движущейся клетки. По мере возникновения ламеллоподий их плазматическая мембрана с помощью белков интегринов образует с субстратом фокальные контакты, от которых отходят пучки актиновых филаментов, участвующие уже в другой форме подвижности, связанной со взаимодействиями между актиновыми филаментами и моторными белками-миозинами.

Миозины являются одним из составных компонентов МФ. Основная работа по перемещению клеток или их внутренних компонентов с помощью МФ происходит за счет работы акто-миозинового комплекса, где актиновые фибриллы играют роль направляющих (“рельсы”), а миозины – транслокаторы. Весь акто-миозиновый комплекс представляет собой АТФ-азу, и движение происходит за счет энергии гидролиза АТФ.

Миозины представляют собой семейство сходных белков. У всех из них есть головная (моторная) часть, отвечающая за АТФ-азную активность комплекса, шейка , которая связана с несколькими регуляторными белковыми субъединицами и хвост , характерный для каждого типа миозина, определяющего специфичность функции в клетке. Существуют три основных типа миозинов. Миозин II и миозин V являются димерами, у которых a-спиральный участок хвоста образует сверхспиральный палочковидный участок. Миозин I представляет собой мономерную молекулу (рис. 252). Две молекулы миозина II могут ассоциировать друг с другом, образуя биполярную толстую фибриллу, участвующую в мышечном сокращении, при сокращении внутриклеточных пучков МФ и при делении клетки. Миозины I и V типа участвуют во взаимодействиях между элементами цитоскелета и мембранами, например в транспорте везикул.

Механизмы работы актомиозиновых комплексов очень сходен, независимо от типа миозина: он начинается со связи миозиновой головки с актиновым филаментом, ее изгибанием и последующим откреплением. За каждый цикл миозиновая головка перемещается в направлении (+)-конца актинового филамента на 5-25 нм при гидролизе одной молекулы АТФ. Таким образом происходит однонаправленное смещение или скольжение МФ относительно молекул миозина (рис. 253).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПФ - промежуточные филаменты

ЭР - эндоплазматический ретикулум

GFAP - кислый глиальный белок

IFAP - ПФ-ассоциированные белки

ВВЕДЕНИЕ

Помимо основных внутриклеточных компонентов некоторые клетки имеют специализированные структуры, реснички или жгутики, которые позволяют им или самим перемещаться, или перемещать окружающую их жидкость. У многоклеточных животных организмов есть специализированные клетки, мышечная работа которых позволяет производить различные движения органов, отдельных его частей или всего организма. В основе всех этих многочисленных двигательных реакций лежат общие молекулярные механизмы. Кроме того, наличие каких-либо двигательных аппаратов должно сочетаться и структурно связываться с существованием опорных, каркасных или скелетных внутриклеточных образований. Поэтому можно говорить об опорно-двигательной системе клеток.

Существует три системы двигательных элементов, которые различаются по химическому составу, ультраструктуре и функциональным свойствам. Это микрофиламенты, микротрубочки и промежуточные филаменты.

В данной работе будет описана молекулярная организация, ультраструктура и функциональные свойства последней группы двигательных элементов.

ГЛАВА 1. ОБЩЕЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ФИЛАМЕНОТВ

Промежуточные филаменты (ПФ) нитевидные структуры из особых белков, один из трех основных компонентов цитоскелета клеток эукариот. ПФ строятся из фибриллярных мономеров . Они называются промежуточными, поскольку их диаметр (812 нм) имеет промежуточное значение по сравнению с микротрубочками (25 нм) и актиновыми микрофиламентами (58 нм) . Поэтому основная конструкция ПФ напоминает канат, имеющий толщину около 8-12 нм. Они локализуются главным образом в околоядерной зоне и в пучках фибрилл, отходящих к периферии клеток и располагающихся под плазматической мембраной. Встречаются ПФ во всех типах животных клеток, но особенно они обильны в тех клетках, которые подвержены механическим воздействиям: клетки эпидермиса, нервные отростки, гладкие и исчерченные мышечные клетки. В клетках растений ПФ не обнаружены .

На разных этапах эмбрионального развития, на разных стадиях дифференцировки, в разных типах клеток экспрессируются ПФ, состоящие из разных белков. В некоторых типах клеток одновременно присутствуют несколько различных ПФ. Всего в геноме человека обнаружено около 70 генов, кодирующих различные белки ПФ, которые образуют одно из самых многочисленных белковых семейств .

Исследования in vitro показали очень высокую устойчивость ПФ к механическим нагрузкам. Большое число полипептидов на поперечном сечении филамента, сильные боковые гидрофобные взаимодействия, характерные для белков, содержащих скрученную суперспираль, и электростатические взаимодействия, возникающие при образовании тетрамеров, придают ПФ свойства каната: они легко гнутся, но крайне трудно рвутся. При обработке клетки детергентами, растворами с высокой ионной силой ПФ последними из клеточных структур переходят в раствор, то есть проявляют очень высокую стабильность. ПФ могут собираться in vitro в физиологическом буфере без каких-либо кофакторов после полной денатурации белка в мочевине. Как показали недавние исследования, ПФ проявляют высокую динамичность и подвижность in vivo . Экзогенный виментин, инъецированный в клетку, быстро встраивается в уже сформированные филаменты. Это показывает, что структура ПФ регулируется равновесием между протофиламентами и полимерами и что обмен субъединицами происходит по всей длине филамента.

ГЛАВА 2. БЕЛКИ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ФИЛАМЕНТОВ

В состав ПФ входит большая группа изобелков. Эти белки, в отличие от глобулярных актина и тубулина, имеют палочковидную форму. Общим свойством всех белков промежуточных филаментов является наличие центрального стержневого домена с высоким содержанием α-спиральных участков. Он очень консервативен по размерам, вторичной структуре и первичной последовательности. Этот стержневой домен имеет около 310 аминокислот (350 для ламинов и белков беспозвоночных) и состоит из 4 α-спиральных участков, соединенных связками. Концевые домены белков ПФ не имеют спиральной структуры. Они сильно различаются по длине и по последовательности аминокислот. Все белки ПФ способны фосфорилироваться. Участки фосфорилирования локализованы на С- и N-концах молекул. Кроме того, белки промежуточных филаментов могут подвергаться другим типам посттрансляционной модификации, а именно, ограниченному протеолизу с помощью высокоспецифичных, активируемых ионами кальция протеаз, гликозилированию, убихитинированию, карбоксиметилированию.

Основываясь на биохимическом, иммунологическом и структурном сходстве, выделяют пять различных типов ПФ.

Наиболее многочисленной и наиболее сложной по составу группой белков ПФ являются кератины, они представлют два типа белков I и II тип. Кислые кератины относятся к типу I (16 изоформ), а основные к типу II (13 изоформ). Для сборки кератиновых ПФ необходимы белки обоих типов они образуют гетерополимеры. Известны эпидермальные кератины, простые эпителиальные кератины и кератины, которые экспрессирутся в волосах, шерсти и ногтях. К белкам ПФ III типа относятся четыре белка: десмин, виментин, переферин и кислый глиальный белок (GFAP). Десмин экспрессируется во всех типах мышечных клеток; виментин обнаружен в фибробластах, лимфоцитах, эндотелиальных клетках и некоторых других мезенхимальных тканях; перферин присутствует, в основном, в периферических нейронах, где он участвует в сборке ПФ вместе с белками IV типа; GFAP экспрессируется в глиальных клетках. В отличие от кератинов белки ПФ III типа могут формировать гомополимеры, однако они могут образовывать и гетерополимеры с другими белками III типа и с белком NF-L. Белки ПФ IV типа экспрессируются, главным образом, в нервных клетках, где они участвуют в радиальном росте аксонов. К ним относится α-интернексин и триплет белков нейрофиламентов: NF-L, NF-M, NF-H. Еще один белок, нестин, впервые обнаруженный в предшественниках нервных клеток, иногда относят к особому типу белков ПФ VI. Однако исходя из его структурных особенностей, нестин можно отнести к IV типу. Кроме вышеперечисленных белков, которые входят в состав цитоплазматических ПФ, существуют еще два типа, сильно от них отличающихся это ядерные ламины, образующие V тип, и два белка VI типа, найденные в хрусталике глаза. Пять типов белков ПФ, выделенных на основе гомологии последовательностей, разделяют на три группы, различающихся принципами сборки. К первой группе относят кератины, ко второй ПФ III и IV типа, а третью группу сборки образуют ламины. Эти три группы могут сосуществовать как 3 независимые системы ПФ внутри одной и той же клетки. Цитоплазматические ПФ могут собираться in vitro в отсутствие вспомогательных белков. Члены первой группы являются облигатными гетерополимерами, то есть для сборки кератиновых филаментов необходимо соединение ПФ I и II типов. Кератины не способны образовывать полимеры с ПФ других типов. Белки ПФ III типа и NF-L, относящиеся ко второй группе сборки, образуют гомополимеры in vitro , однако в клетке они очень часто обнаруживаются в виде сополимеров. Ламины не способны образовывать сополимеры с белками цитоплазматических ПФ .

ГЛАВА 3. СТРУКТУРА ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ФИЛАМЕНТОВ

Субъединицы промежуточных филаментов включают различные типы мономерных белков, которые состоят только из одного вида белка, тогда как другие (например нейрофиламенты) состоят из трёх различных белков.

Вне зависимости от типа клетки белки ПФ представляют собой волокнистые длинные полипептиды с N -концевым головным доменом, C -концевым хвостовым доменом и центральным стержневым доменом. Последний состоит из α-спирального участка, который содержит серию повторений участка из 7 аминокислот. Этот участок отвечает за образование скрученных спиральных димеров между двумя параллельными α-спиралями.

При формировании ПФ два скрученных спиральных димера связываются друг с другом антипараллельно и образуют тетрамер; т.е. N -конец одного димера и С-конец другого ориентированы в одном направлении. Поскольку N -конец и С-конец белков ПФ различаются, а димеры и тетрамеры уложены антипараллельно, филаменты не полярны; скорее идентичны с каждой стороны. Это отличает их от полярной структуры микротрубочек и актиновых филаментов и объясняет, почему ПФ имеют совершенно другие свойства.

Эластичность этих филаментов обеспечивается в частности тем, что димеры каждого тетрамера расположены в шахматном порядке относительно друг друга; это строение позволяет тетрамерам связываться между собой. Когда тетрамеры выравниваются вдоль оси филамента и связываются со свободными концами, образуется зрелый ПФ .

Анализ первичной последовательности белков ПФ показал, что, несмотря на большое разнообразие, все они имеют общий план строения (рис. 1). У всех белков ПФ есть центральный α-спиральный домен, который фланкирован неспиральными N-концевым («голова») и C-концевым («хвост») доменами. Концевые домены разных типов ПФ сильно различаются по размерам и первичной аминокислотной последовательности.

Рисунок 1. Схематическое изображение молекул некоторых белков ПФ.

Строение центрального домена, наоборот, чрезвычайно консервативно. Он содержит четыре спиральных сегмента 1А, 1В, 2А, 2В, прерывающихся в трех местах короткими не спиральными участками-линкерами L1, L1-2 и L2, которые часто содержат остатки пролина и глицина. Аминокислотная последовательность α-спиральных участков центрального домена состоит из повторов, представляющих собой гептады вида (abcdefg)n, где положения а и d предпочтительно занимают небольшие гидрофобные остатки лейцин, изолейцин, метионин и валин. Такой повторяющийся мотив из 7 а.о. характерен для белков, способных к образованию скрученной α- спирали (coiled-coil) или по-другому суперспирали, состоящей из двух α-спиралей. Поверхность α-спирального домена белков ПФ сильно заряжена. Например, у виментина из 310 аминокислот, образующих центральный домен, заряженными являются 116 70 кислых и 46 основных аминокислот. Таким образом, на одну субъединицу виментина приходится избыток отрицательного заряда 24 кислых аминокислотных остатка. В отличие от центрального домена, «голова» многих белков ПФ заряжена положительно. У виментина в N-концевом домене содержится 12 аргининов, а у ламина B2 3. При этом количество положительно заряженных аминокислотных остатков коррелирует с длиной N-концевого домена (у виментина он состоит из 102 остатков, а у ламина В2 из 25). Даже кислый глиальный белок, с коротким N-концевым доменом из 68 аминокислот, содержит 9 основных остатков. Считают, что положительно заряженные аминокислотные остатки «головы» взаимодействуют с отрицательно заряженными аминокислотами центрального домена. Кроме того, эти заряженные кластеры на поверхности филаментов могут являться потенциальными участками связывания с различными клеточными компонентами.

Центральный домен цитоплазматических ПФ длиной около 45 нм состоит из 310 аминокислот. У ядерных ламинов из-за наличия дополнительных 42 аминокислот в сегменте 1В, центральный домен содержит 356 аминокислотных остатков, и его длина составляет 53 нм. Размеры сегментов, образующих α-спиральный домен ПФ, высоко консервативны: 1А 35 аминокислот, 1В 101 аминокислота, 2А 19 аминокислот и 2В 115 аминокислот. Оказалось, что у различных по аминокислотной последовательности ПФ есть две области, расположенные на концах α-спирального домена, неизменные по своему составу. Одна из них участок из 26 a.о., первые две трети сегмента 1А, 8 из которых абсолютно консервативны; другая участок из 32 остатков на самом конце сегмента 2В, содержащий 13 абсолютно консервативных остатков. С помощью метода поперечных сшивок установлено, что обе эти области участвуют во взаимодействии соседних димеров белков ПФ в зрелых филаментах. Еще одной характерной особенностью строения сегмента 2В является небольшое нарушение гептадной структуры. После 8 полных гептад у всех белков ПФ обнаружена вставка из 4 дополнительных остатков. Это нарушение структуры также важно для сборки ПФ. Линкер L1 сильно варьирует по размеру и последовательности, в то время как последовательность линкера L2 высоко консервативна и состоит из 8 аминокислот у всех пяти типов ПФ. Сильнее всего различаются по длине и аминокислотному составу неспиральные концевые домены белков ПФ «голова» и «хвост». Например, длина «хвоста» у кератина К19 всего 9 остатков, а длина «хвоста» нестина 1491 остатков.

Таким образом, все белки ПФ имеют похожий по структуре и размеру центральный домен, несущий суммарный отрицательный заряд, и сильно варьирующие по длине и аминокислотному составу концевые домены, несущие суммарный положительный заряд .

ГЛАВА 4. СБОРКА ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ФИЛАМЕНТОВ

ПФ это полимеры, которые обладают уникальной способностью к самосборке без участия дополнительных белков и, в отличие от микротрубочек и актиновых микрофиламентов, без дополнительной энергии в виде молекул АТФ или ГТФ. На основе данных о структуре белков ПФ был предсказан возможный механизм их сборки, который затем был в основном подтвержден электронно-микроскопическими наблюдениями, а также с помощью рентгеноструктурного анализа и ЭПР-спектроскопии.

Сборка ПФ происходит в несколько этапов (рис.2). Сначала образуются димеры центральные домены двух полипептидных цепочек обвиваются друг относительно друга, образуя скрученную спираль с шагом 14 нм. Димеры получаются в результате гидрофобных взаимодействий между аминокислотными остатками, расположенными в положениях а и d гептадных повторов взаимодействующих белковых молекул.

Рисунок 2 . Схема, показывающая отдельные этапы самосборки ПФ.

Особую роль в сборке ПФ играют концевые участки центрального домена. Исследования формирования филаментов in vitro показали, что даже точечная замена аминокислоты на N-конце сегмента 1А или на С-конце сегмента 2В приводит к серьезным нарушениям их структуры.

Следующий этап сборки соединение димеров в более крупные комплексы. В случае цитоплазматических ПФ это объединение димеров в тетрамеры, что отличает их от ламинов, которые при сборке соединяются по механизму «голова к хвосту» образуя линейные полимеры. В образовании тетрамеров участвуют электростатические взаимодействия чередующихся зон положительных зарядов, избыток которых имеется в N-концевом домене виментина, и отрицательных, преобладающих в центральном домене молекулы. Существует несколько моделей соединения димеров в тетрамеры, предложенных на основе результатов, полученных методом поперечных сшивок (рис. 3).

Рисунок 3. Схема, показывающая три возможных модели образования тетрамеров при сборке ПФ.

Этот метод заключается в образовании ковалентной связи между определенными остатками аминокислот соседних молекул с помощью специальных реагентов, имеющих две реакционных группы, взаимодействующие с этими остатками. Чаще других используются реагенты, которые реагируют с лизином или цистеином. Полученные комплексы выделяют, очищают, расщепляют протеазами и анализируют при помощи хроматографии. Сравнение хроматографических профилей образцов, полученных до и после расщепления сшивок периодатом натрия, позволяет обнаружить несколько возможных вариантов поперечных сшивок между молекулами или внутри одной молекулы. Пики на хроматограммах, которые исчезают после обработки периодатом натрия, соответствуют молекулам, которые образовались в результате поперечных сшивок между разными молекулами или внутри одной молекулы белка. Таким образом, этот метод позволяет обнаружить участки белков, расположенные в непосредственной близости друг от друга, т.е. выяснить взаимное расположение субъединиц в филаментах. Большинство пептидов, полученных в результате протеолитического расщепления виментиновых ПФ, оказались довольно короткими (меньше 10 остатков), так что их аминокислотный состав позволил однозначно определить расположение пептида внутри последовательности виментина. В некоторых случаях, когда обнаруживался только один пептид после обработки периодатом, это означало, что поперечная сшивка образовалась внутри цепи.

Для виментина были найдены 16 уникальных поперечных сшивок, 5 из которых возникают между двумя параллельными цепочками, находящимися «в регистре» и образующими двухцепочечную скрученную гомодимерную молекулу виментина. 11 поперечных сшивок могут быть отнесены к трем возможным моделям межмолекулярного взаимодействия, изображенным на рис. 3. Модель А 11 (6 поперечных сшивок) предполагает, что два антипараллельных димера взаимодействуют таким образом, что 1В сегменты их центральных доменов значительно перекрываются. Согласно другой модели, А 22 (3 поперечные сшивки), два антипараллельных димера перекрываются в области сегментов 2В. В третьей модели А 12 (2 поперечных сшивки) два димера антипараллельны и полностью перекрываются. Существование этих трех типов взаимодействия димерных молекул было подтверждено для кератинов. Для виментина предложена еще и четвертая модель взаимодействия между димерными комплексами в составе филаментов A CN . Если два тетрамера, образованные согласно моделям А 11 и А 22 , оказываются рядом, то по одному димеру из каждого тетрамера будут взаимодействовать по принципу «голова-хвост». В этом случае 510 N-концевых остатков сегмента 1А одного димера будут перекрываться с 510 C-концевыми остатками сегмента 2В другого димера. Сходные данные были получены и для структуры десминовых ПФ.

До недавнего времени структурную информацию о сборке ПФ можно было получить, только наблюдая препараты, зафиксированные через определенные промежутки времени, при помощи электронного микроскопа. Позднее для наблюдения за ходом процесса сборки был применен метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (small angle x-ray scattering SAXS), который используется для исследования макромолекул в растворе. Оказалось, что сборка виментиновых ПФ in vitro происходит с последовательным образованием различных олигомеров, включающих тетрамеры, октамеры единичный протофиламент, состоящий из четырех октамеров. Измерения, проведенные с помощью этого метода, указывают на то, что димеры в тетрамере находятся на расстоянии 3,4 нм друг от друга, в то время как расстояние между скрученными спиралями 1,5 нм. Возможно, такое разъединение связано с тем, что непосредственный контакт кислых центральных доменов электростатически неблагоприятен. Также оказалось, что соединение димеров в тетрамер в соответствии с моделью А 11 происходит во многом благодаря второй половине головного домена (3570 остатков), т.е. электростатическое притяжение положительно заря женной «головы» и кислого центрального домена, по-видимому, является движущей силой. Конечная субъединица ПФ - протофиламент единичной длины (65 нм) в среднем состоит из четырех октамеров. В поперечном сечении протофиламент единичной длины скорее овальный, чем круглый. Согласн измерениям, полученным с помощью сканирующего электронного микроскопа, отдельные протофиламенты могут значительно различаться по количеству образующих его виментиновых цепочек. На последнем этапе сборки происходит уплотнение субъединиц филаментов до толщины 1012 нм. Возможно, этот этап также сопровождается перестройкой внутри филаментов, потому что варианты сборки тетрамеров А 22 и А 12 обнаруживаются только в зрелых структурах. Существование тетрамеров виментина in vivo уже доказано, а вот вопрос о присутствии других промежуточных компонентов сборки, таких как октамеры или единичные филаменты, требует дальнейших исследований. Количество протофибрилл (октамеров), приходящихся на поперечный срез ПФ, варьирует от 2 до 6, в зависимости от типа ПФ и условий сборки. Предполагается, что каждая протофибрилла состоит из двух протофиламентов, а каждый протофиламент, в свою очередь, состоит из тетрамеров, соединенных конец к концу. Таким образом, по ширине один филамент может состоять из 2440 полипептидов (обычно из 2 8 тетрамеров). Толщина может меняться не только от одного филамента к другому, но даже в пределах одного филамента .

Иначе полимеризуются белки ядерной ламины: они образуют димеры с головками на одном конце и полимеризуются, создавая рыхлую прямоугольную решётку.

Топографически в клетке расположение ПФ повторяет расположение микротрубочек, они как бы идут бок о бок. При разрушении микротрубочек колхицином происходит так называемый коллапс ПФ: они собираются в плотные пучки или кольца вокруг ядра. Восстановление новой сети ПФ начинается от зоны клеточного центра. Это наводит на мысль о том, что центром их полимеризации или нуклеации могут быть центры, общие с микротрубочками .

ГЛАВА 5. ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ФИЛАМЕНТЫ В КЛЕТКЕ

Зрелые ПФ и их предшественники динамичны и подвижны внутри клеток. Сборка, разборка и перемещение ПФ в клетках происходят непрерывно. Образование внутриклеточной сети раз личных типов ПФ в разных типах клеток происходит по-разному. Это может быть связано с тем, что ПФ взаимодействуют с разными типами молекулярных моторов и другими факторами. Субъединицы ПФ и зрелые полимеры находятся в цитоплазме в равновесии, и включение новой субъединицы может происходить в любом месте зрелого филамента. Однако образование сети ПФ начинается около ядра. Перемещаются в клетках не только отдельные субъединицы, но и зрелые фибриллы. Для виментиновых ПФ было показано, что они могут перемещаться в цитоплазме как по направлению к клеточной поверхности, так и по направлению к ядру. Средняя скорость перемещения длинных ПФ составляет 0,20,3 мкм/мин, субъединицы ПФ двигаются быстрее (12 мкм/сек), в основном вдоль микротрубочек. Большинство из них (6570%) перемещается к периферии клетки. Способность виментиновых субъединиц двигаться вдоль микротрубочек в разном направлении объясняется их ассоциацией с моторными белками кинезином и динеином. Связывание с кинезином обуславливает движение виментиновых филаментов и их субъединиц к плюс-концу микротрубочек и к поверхности клетки. Движение к минус-концу микротрубочек, к ядру, обусловлено взаимодействием с моторным комплексом, состоящим из динеина и динактина. По-видимому, эти взаимодействия необходимы для формирования и поддержания сети ПФ. Длинные виментиновые ПФ связываются с IFAP, например, с плектином, который образует поперечные связи между отдельными ПФ и другими структурами цитоскелета, тем самым препятствуя их движению. По-видимому, такое взаимодействие необходимо для стабилизации ПФ в особых областях цитоплазмы, подвергающихся механическому стрессу или деформации. В отличие от виментиновых ПФ, состоящих из одного белка, кератиновые ПФ всегда являются гетерополимерами. Поэтому для поддержания стабильной сети кератиновых филаментов необходим баланс между кератинами I и II типа, избыток кератинов одного из типов приводит к нарушению сети ПФ. Интересно, что в клетках, одновременно экспрессирующих кератин и виментин, длинные кератиновые филаменты двигаются в 3 раза медленнее виментиновых (0,06 мкм/мин), а кератиновые субъединицы в 15 раз медленнее виментиновых субъединиц. Кроме того, транспорт кератиновых субъединиц в основном направлен к ядру (84%). Возможно, причина этих различий заключается в разной способности кератинов и виментина связываться с микротрубочками и моторными белками. Действительно, большая часть кератиновых субъединиц ассоциирована с сетью актиновых микрофиламентов, и динамические свойства кератиновых ПФ обусловлены взаимодействием с миозином. А поскольку миозин перемещается медленнее моторных белков, ассоциированных с микротрубочками, этим, возможно, и объясняются различия в скорости перемещения кератинов и виментина внутри одного типа клеток. Особый интерес представляет формирование системы ПФ в нейронах, называемых нейрофиламентами. Отростки этих клеток могут достигать длины порядка метра. Если бы транс порт ПФ происходил с той же скоростью, что и медленный транспорт других структур цитоскелета (0,38 мм/день), то понадобились бы годы, чтобы они могли достичь дистальных областей отростков. Однако субъединицы нейрофиламентов перемещаются вдоль аксона со скоростью, равной 1,8 мкм/сек, так как они транспортируются по микротрубочкам при помощи кинезина и динеина. Правда, движение этих структур прерывается долгими паузами, так что двигаются они только 27% времени, а в зрелых сенсорных аксонах нейрофиламенты находятся в покое около 99% времени .

ГЛАВА 6. ФУНКЦИИ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ФИЛАМЕНТОВ

По сложившимся представлениям, основной функцией ПФ является поддержание клеточной и тканевой целостности, основанной на их механических свойствах и способности к самосборке. Повышенный интерес к их механической роли связан с тем, что известны наследственные заболевания, вызванные нарушениями структуры ПФ в тканях, подверженных механическому стрессу, таких как кожа, мышцы и кровеносные сосуды. Однако ПФ имеются во всех типах клеток, в том числе и не подверженных механическому стрессу, а нарушение их сетей также приводит к патологическим последствиям. Существуют, например, серьезные болезни, связанные с нарушением функций ПФ в нервной системе. Этот факт, а также динамическая природа ПФ и наличие большого количества связанных с ними сигнальных белков, указывает на то, что ПФ не только обеспечивают устойчивость к внешним воздействиям, но также выполняют другие специализированные функции в клетках. Хотя эти функции в различных типах клеток пока недостаточно изучены, уже сейчас видно, как велико их значение. По-видимому, немеханическая функция ПФ связана с их участием во внутриклеточном распределении органелл и белков, а также в транспорте липидов. Функции ПФ обусловлены их взаимодействием с многообразными клеточными компонентами. Так, механическую целостность клеток ПФ обеспечивают, связываясь с другими компонентами цитоскелета микротрубочками, микрофиламентами и плазматической мембраной, взаимодействие с которой происходит в особых участках прикрепления: в десмосомах и полудесмосомах эпителиальных клеток и в местах фокальных контактов фибробластов. Для взаимодействия с такими органеллами, как митохондрии, аппарат Гольджи, эндосомы и лизосомы ПФ связываются с различными компонентами мембран этих органелл. Это связывание обеспечивается большим семейством белков IFAP, но, по-видимому, может происходить и непосредственно.

6.1. Механические функции

Как показывают электронно-микроскопические исследования, различные структуры цитоскелета связаны между собой и с мембранными органеллами. Различимые на электронных микрофотографиях «мостики» долгое время считались связующими структурами неизвестной природы. Позже выяснилось, что за связь многих клеточных органелл с микротрубочками отвечают молекулярные моторы кинезины и динеины. Роль кинезина для взаимодействия ПФ с микротрубочками была продемонстрирована с помощью антител, блокирующих работу этого моторного белка. Оказалось, что радиальное распределение ПФ вдоль микротрубочек осуществляется благодаря кинезин-зависимому транспорту.

Но основную роль во взаимодействии ПФ со многими клеточными компонентами играют IFAP, которые соединяют их и с органеллами, микрофиламентами и микротрубочками, и с межклеточными контактами. Такие белки, как десмоплакин, BPAG1 и плектин относятся к семейству плакинов. Все они содержат очень длинный центральный α-спиральный домен, который обра зует скрученную спираль при образовании димерного комплекса. Центральный домен фланкирован не спиральным N-концевым доменом, который может содержать места связывания с актином и/или места связывания с микротрубочками, и С-концевым доменом, который, помимо участков связывания с ПФ, может содержать различное количество повторяющихся доменов А, В, С, типичных для десмоплакина.

Наиболее хорошо изучен белок плектин, который может соединять три различные цитоскелетные системы и взаимодействовать с различными белками. При помощи электронной микроскопии можно увидеть, что плектин образует боковые отростки, отходящие от ПФ, длиной примерно 200 нм и толщиной 23 нм. Способность плектина связываться с ПФ обоими концами навела на мысль, что концы его цепи одинаковы по своим свойствам, и его молекулы являются гомотетрамерами. Количественный анализ комплексов виментин-плектин показал, что на участок ПФ длиной 1мкм приходится 10 молекул плектина. В мышцах плектин колокализуется с десминовыми ПФ около Z-дисков и структур, образующих внутриклеточный миофибриллярный каркас.

6.2. Внутриклеточное распределение органелл

Вплоть до недавнего времени никто не предполагал, что ПФ могут участвовать в мембранном транспорте, однако недавно было показано, что ПФ играют важную роль не только в транспорте мембранных органелл, но и в их функционировании.

6.2.1. Митохондрии и промежуточные филаменты

Одним из наиболее важных для физиологии клеток типом мембранных органелл являются митохондрии. Они располагаются около ПФ в различных типах клеток, и это, по-видимому, играет важную роль. Так оказалось, что у митохондрий в сердечных и скелетных мышцах, лишенных десмина, изменяется морфология и внутри клеточная локализация. Кроме того, в таких митохондриях наблюдается прогрессирующее разрушение матрикса, а сами они собираются в группы около сарколеммы. Все эти изменения приводят к нарушению функций митохондрий: снижается максимальная скорость дыхания, АДФ-стимулируемое потребление кислорода, исчезает креатинкиназа, падает уровень цитохрома с.

6.2.2. Аппарат Гольджи и промежуточные филаменты

Аппарат Гольджи располагается вдоль ПФ около центра организации микротрубочек. Взаимодействие аппарата Гольджи и виментиновых ПФ хорошо изучено, и найдены белки, с помощью которых происходит их связывание. Один из них форм-имино-трансфераза циклодеаминаза, белок, расщепляющий гистидин. Другой белок аппарата Гольджи - GM130 при разрушении микротрубочек, приводящем к нарушению распределения аппарата Гольджи, также локализуется вдоль виментиновых филаментов. Третий белок, MICAL (molecule interacting with CasL), непосредственно связывает виментин и ГТФазу Rab1, которая является главным участником везикулярного транспорта от эндоплазматического ретикулума к аппарату Гольджи. Таким образом, связь между ПФ и аппаратом Гольджи, изученная на культуре клеток, играет, по-видимому, важную физиологическую роль.

6.2.3. Эндосомы, лизосомы и промежуточные филаменты

Другим примером участия ПФ в функциях мембранных органелл является их роль в транспорте эндосом и лизосом. Установлено, что виментин, периферин и α-интернексин связываются с адаптерным белком АР-3. Белок АР-3 это гетеротетрамерный адаптерный комплекс, который участвует в транспорте везикул между эндосомальным и лизосомальным компартментами и регулируетпоступление белков в лизосомы и тканеспецифичные органеллы меланосомы, гематопоэтические гранулы и синаптические везикулы. С ПФ белок АР-3 взаимодействует при помощи специализированного домена субъединиц β3А и β3В, который также необходим для выполнения АР-3 функции, связанной с сортировкой белков, и это единственный его участок, взаимодействующий с виментином. Отсутствие в клетках АР-3 или виментина приводит к появлению одинакового фенотипа, в обоих случаях нарушается распределение ионов цинка. В фибробластах, лишенных АР-3 или виментина, снижается его уровень. Внутриклеточный цинк в основном локализуется в эндоцитарных везикулах и в эндосомах, а его запасание зависит от тока ионов хлора через их мембраны. Каналы, через которые поступает хлор, регулируют и рН в эндосомах, и запасание в них ионов цинка. Белки, образующие эти каналы, переносятся мембранными везикулами, с которыми связан адаптерный комплекс АР-3. Предполагается, что отсутствие комплекса АР-3 в клетках приводит к нарушению рН внутри эндосом, который определяется транспортом ионов хлора. У клеток, лишенных виментина, содержание цинка в везикулах падает в 40 раз.

Другой груз, за транспорт которого отвечает комплекс АР-3, это молекула LAMP-2 (lysosome associated membrane protein). Она представляет собой резидентый белок эндосом и лизосом, который нужен для их слияния с вакуолями автофагосом, которые образуются из эндоплазматического ретикулума, охватывают органеллу, предназначенную для расщепления, и доставляют ее к лизосомам или эндосомам. Показано, что нарушение сборки ПФ приводит к нарушению образования вакуолей автофагосом, однако механизм их взаимодействия пока не известен. Существует предположение, что совместное действие ПФ и АР-3 связано с транспортом белка LAMP-2. Важно отметить, тем не менее, что локализация эндосом и лизосом от ПФ не зависит.

6.2.4. Ядро и промежуточные филаменты

Одной из важных функций ПФ является локализация ядер. Однако роль ПФ в локализации ядра изучена пока недостаточно. Скорее всего, она заключается в удержании ядра на месте и в привлечении белков, которые могли бы взаимодействовать с остальными компонентами цитоскелета.

6.2.5. Другие функции промежуточных филаментов

К другим известным функциям ПФ можно отнести их участие в под держании липидного состава мембран. Так, в преадипоцитах отсутствие или нарушение структуры виментиновых ПФ вызывало снижение стабильности триглицеридов, а в фибробластах и клетках надпочечников приводило к нарушению метаболизма холестерина. Целый ряд данных указывает на то, что изменения в липидном составе мембран возникают в результате повреждений, происходящих на поздних стадиях эндосомального пути. Оказалось, что с виментиновыми ПФ взаимодействует один из ключевых ферментов холестеринового обмена оксистеролсвязывающий белок. В клетках, лишенных ПФ, наблюдается повышение синтеза холестерина, и снижение образования из него сложного эфира. Предполагают, что это также связано с нарушениями перехода холестерина в эндосомальные и лизосомальные мембраны. Также замедляется созревание гликосфинголипидов в клетках, лишенных ПФ, потому что затруднен их транспорт из аппарата Гольджи в эндосомальную систему. Нарушения транспорта липидов говорят о том, что, по-видимому, роль взаимодействия транспортных везикул с ПФ чрезвычайно важна. В заключение можно отметить многообразие функций ПФ в клетке. Наряду с другими компонентами цитоскелета они обеспечивают механическую прочность клетки, участвуют в правильном расположении внутриклеточных органелл и ядра и в транспорте белков. Однако некоторые детали и тонкие механизмы этих взаимодействий пока остаются невыясненными, как и роли многих участников .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Необходимость более глубокого изучения принципов и механизмов функционирования ПФ в различных типах клеток диктуется, прежде всего тем, что нарушения, связанные с этими структурами цитоскелета являются причиной многих патологических состояний. К настоящему времени установлены мутации генов белков ПФ, лежащих в основе тяжелых наследственных заболеваний. Среди них есть такие, как наследственный буллезный эпидермолиз, связанный с мутациями кератинов 5 и 14; миопатия и кардиомиопатия, вызванные нарушениями десмина; такие тяжелые неврологические заболевания, как амиотрофический латеральный склероз и болезнь Александра, связанные с мутациями периферина и GFAP, соответственно; болезнь Паркинсона и некоторые другие тяжелые нервные патологии, причиной которых являются нарушения нейрофиламентов. Другим приложением фундаментальных знаний о ПФ явилось успешное использование образующих их белков в качестве маркеров различных злокачественных опухолей. Для многих видов опухолей тип «неправильного» белка ПФ может служить диагностическим маркером. В последнее время в связи с повышенным интересом к проблеме использования стволовых клеток многие исследователи обратили внимание на ПФ как удобный маркер клеточной дифференцировки. Действительно, выяснив, какой белок ПФ экспрессируется в клетках, можно легко и быстро определить их тип. Таким образом, ПФ представляют собой важный компонент цитоскелета, который обладает многими уникальными свойствами и играет важную роль в физиологии клеток.

ЛИТЕРАТУРА

Wiki - Linki [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://wiki-linki.ru/Page/1580780 .
Виментиновые промежуточные филаменты и их роль во внутриклеточном распределении органелл / А.А. Минин, М.В. Молдавер // Успехи биологической химии. 2008. Т. 48, С. 221-252.
Введение в клеточную биологии. Учебник для вузов. 4-е изд., перераб. и доп. / Ю.С. Ченцов. М.: ИКЦ «Академкнига», - 2004. 495 с.
Фалер Д.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. Руководство для врачей. Пер. с англ. М.: Издательство БИНОМ, 2006. 256 с.

Промежуточные филаменты (ПФ) напоминают канат, имеющий толщину около 8-10 нм, состоящий из фибриллярных мономеров. Они локализуются главным образом в околоядерной зоне и в пучках фибрилл, отходящих к периферии клеток и располагающихся под плазматической мембраной (рис. 238, 240, 241). ПФ встречаются во всех типах клеток животных, но особенно обильны в тех, которые подвержены механическим воздействиям: клетки эпидермиса, нервные отростки, гладкие и исчерченные мышечные клетки. В клетках растений ПФ не установлены.

Промежуточные филаменты состоят из большой группы родственных белков, которую делят на четыре типа. Первый тип – кератины , кислые и нейтральные, встречающиеся в эпителиальных клетках; они образуют гетерополимеры из этих двух подтипов. Кератины, кроме того, имеют некоторую гетерогенность, зависящую от тканевого источника. Так, в эпителиях встречается до 20 форм кератинов, 10 форм других кератинов найдено в волосах и ногтях. Молекулярный вес кератинов колеблется от 40 до 70 тыс.

Третий тип – белки нейрофиламентов (мол. вес от 60 до 130 тыс.) встречается в аксонах нервных клеток.

Белки ядерной ламины образуют рыхлую прямоугольную решетку. Такие слои ламины быстро разрушаются во время митоза при фосфорилировании ламинов.

Цитоплазматические промежуточные филаменты относятся к самым стабильным и долгоживущим элементам цитоскелета.

Особенности строения и химическая устойчивость промежуточных филаментов определяет их физическую устойчивость. Они служат как бы истинно опорной системой в клетках подвергающихся значительным физическим нагрузкам. В клетках кожного эпидермиса промежуточные филаменты образуют пучки (тонофиламенты), связанные с десмосомами, и создают жесткую внутриклеточную сеть (рис. 243). Так, в нервных аксонах, простирающихся на многие десятки сантиметров, ПФ или нейрофиламенты создают жесткую основу, обеспечивающую гибкость и целостность тонких цитоплазматических отростков нервных клеток. В поперечно исчерченных мышечных клеток десминовые филаменты входят в состав z-дисков и связывают их друг с другом как в составе саркомера, так и в соседних миофибриллах, а также с плазматической мембраной.

Промежуточные филоменты – прочные и устойчивые в химическом отношении белковые нити толщиной около 10 нм (что является промежуточным значением между толпщной микротрубочек и микро-филаментов). Они встречаются в клетках разных тканей (см. ниже) и располагаются в виде трехмерных сетей в различных участках цитоплазмы, окружают ядро, входят в состав десмосом и полудесмосом эпителиальных клеток (в плазмолемме которых они закреплены посредством трансмембранных белков), лежат по всей длнне отростков нейронов. Промежуточные филаменты образованы нитевидными белковыми молекулами, сплетенными друг с другом наподобие каната.

Функции промежуточных филаментов изучены недостаточно; установлено, однако, что они не влияют ни на движение, ни на деление клетки. К их основным функциям относятся:

(1)структурная – поддерживающая и опорная, обеспечение распределения органелл по определенным участкам цитоплазмы;

(2) обеспечение равномерного распределения сил деформации между клетками ткани, что препятствует повреждению отдельных клеток (благодаря связи промежуточных филаментов с трансмембранными белками десмосом и полудесмосом);

(3) участие в образовании рогового вещества в эпителии кожи; в эпителиальных клетках связываются с другими белками и образуют непрошщаемые барьеры (роговые чешуйки), являются главным компонентом волос и ногтей;

(4) поддержание формы отростков нервных клеток и фиксация трансмембранных белков (в частности, ионных каналов);

(5) удержание миофибрилл в мышечной ткани и прикрепление к плазмолемме, что обеспечивает их сократительную функцию.

Очевидно, что функции, отмеченные цифрами (2)-(5), служат частными проявлениями более общей структурной функции (1) в различных тканях.

В поврежденной клетке сеть промежуточных филаментов (в отличие от других компонентов цитоскелета) спадается и концентрируются вокруг ядра, связывая поврежденные органеллы и белковые агрегаты. Формируется своеобразная структура, которая наподобие кокона концентрирует поврежденные компоненты клетки для последующего уничтожения путем их внутриклеточного переваривания. В ходе восстановления структуры и функции клетки после повреждения сеть промежуточных филаментов вновь развертывается по всей цитоплазме. В отличие от микрофиламентов и микротрубочек, для образования промежуточных филаментов не требуется АТФ, причем они не подвергаются постоянной сборке и диссоциации, а представляют собой менее лабиль-ные и сравнительно устойчивые структуры.

Распределение промежуточных филаментов различных классов в клетках и тканях человека

Классы промежуточных филаментов и их идентификация.

Несмотря на то, что строение промежуточных филаментов в клетках различных типов сходно, они существенно различаются по своей молекулярной массе и химической природе, что может быгь продемонстрировано иммуноцитохимическими методами с антителами к промежуточным филаментам различных классов. Различают 6 основных классов промежуточных филаментов (см. выше). В цитоплазме большинства клеток содержится лишь один их класс; в части клеток выделяются два класса, из которых один является основным.

Идентификация классов промежуточных филаментов имеет важное значение в диагностике опухолей для выявления тканевой принадлежности опухолевых клеток, что может определить выбор лечения и прогноз. Наибольшее диагностическое значение имеет выявление цитокератинов, десмина и глиального фибриллярного кислого белка, которые служат маркерами опухолей эпителиального, мышечного и глиального происхождения. Менее отчетливые результаты дает обнаружение виментина, который экспрессируется и коэкспрессируется (экспрессируется в сочетании с белками других классов промежуточных филаментов) многими типами клеток. Существенную информацию о степени поражения эпителия можно получить путем определения экспрессии молекулярных форм кератинов, специфичных для клеток конкретной локализации и уровня дифференцировки. Таким путем можно установить, например, ранние предраковые изменения в эпителии, не выявляемые стандартными морфологическими методами.

Промежуточные филаменты представляют собой основные компоненты ядерного и цитоплазматического цитоскелета

Промежуточные филаменты необходимы для поддержания правильной структуры тканей и их функционирования

По диаметру промежуточные филаменты находятся между актиновыми филаментами и микротрубочками и образуют прочные сети

Промежуточные филаменты представляют собой полимеры, состоящие из белковых субъединиц

Белки, из которых состоят промежуточные филаменты, гетерогенны и кодируются семейством больших и сложно устроенных генов

У человека более 50 болезней обусловлены возникновением мутаций в белках промежуточных филаментов

Микротрубочки, актиновые филаменты (микрофиламенты) и промежуточные филаменты представляют собой три основные системы белковых филаментов, составляющих цитоскелет. Промежуточные филаменты образуют в цитоплазме и ядре сеть и присутствуют во всех клетках метазоа (животных).

В отличие от микротрубочек и актиновых филаментов, которые необходимы даже для выживания изолированных клеток in vitro , основная функция промежуточных филаментов проявляется на уровне тканевой организации, где они необходимы для надлежащего функционирования тканей и органов. Некоторые типы промежуточных филаментов участвуют в скреплении клеток друг с другом, что необходимо для формирования тканей.

Белки промежуточных филаментов кодируются несколькими большими семействами генов . Эти белки образуют сложную систему филаментов, на долю которых в клетке в нормальных физиологических условиях приходится до 80% общего клеточного белка. Внутриклеточное распределение промежуточных филаментов отличается от характерного для актиновых филаментов и микротрубочек.

Распределение различных типов промежуточных филаментов в культивируемых фибробластах.
Иммунофлуоресцентное окрашивание на виментин и ламин В. Виментин находится в цитоплазме, а ламины в ядре.

Гистологи обнаружили их (в виде нейрофибрилл нейронов и тонофиламентов клеток эпидермиса) задолго до того, как в 1960-х гг. при электронно-микроскопическом исследовании мышечной ткани были описаны индивидуальные филаменты. В клетках мышц «промежуточные» филаменты занимали по диаметру среднее положение между «толстыми филаментами» миозина-II и «тонкими филаментами» актина. Их средний диаметр составляет около 10 нм, т. е. они толще, чем актиновые филаменты (около 8 нм), и тоньше микротрубочек (около 25 нм). Все три системы филаментов представлены рисунке ниже.

Белки промежуточных филаментов характеризуются общей молекулярной структурой и полимеризуются в филаменты, обладающие высокой механической прочностью. В электронном микроскопе они выглядят одинаково. У высших позвоночных семейство соответствующих белков организовано наиболее сложно, и этот вопрос будет рассмотрен в настоящей главе.

Похожие промежуточные филаменты также обнаружены у беспозвоночных, однако у них количество генов, кодирующих соответствующие белки, значительно меньше, чем у позвоночных. Также промежуточные филаменты беспозвоночных менее гетерогенны и обладают меньшей тканевой специфичностью, чем у млекопитающих. В геноме человека находится порядка 70 генов, кодирующих белки промежуточных филаментов. Принимая во внимание альтернативный сплайсинг для пары из них, общее количество этих белков приближается к 75.

Они представлены гораздо большим числом вариантов и более гетерогенны, чем актиновые или тубулиновые белки . Для всех белков промежуточных филаментов характерна тканеспецифическая экспрессия. Также их экспрессия изменяется в процессе дифференцировки.

Большинство сведений, касающихся экспрессии и биохимических свойств , были получены до того, как были установлены их функции и связь с некоторыми заболеваниями. Сейчас показано, что мутации в генах белков промежуточных филаментов связаны с многими генетическими заболеваниями, которые характеризуются различными фенотипическими проявлениями. Они включают по меньшей мере 50 отдельных болезней, от фликтены до прогерии.

Почти все типы генов белков промежуточных филаментов связаны с той или иной формой проявления хрупкости тканей. Это позволяет предполагать, что для функционирования ткани in vivo необходима надлежащая механическая прочность и что в значительной степени она прямо или опосредованно связана с промежуточными филаментами. Принимая во внимание, что экспрессия генов белков промежуточных филаментов носит тканеспецифический характер, весьма возможно, что все эти белки придают клеткам тканей мельчайшие оттенки различия. Клеткам тканей необходимы различные свойства, такие как прочность, пластичность, быстрота сборки и разборки структур, обеспечивающих прочность.

Может быть, в этом кроется причина того, что в ходе эволюции возникло столь много генов, кодирующих белки промежуточных филаментов.

Основные компоненты цитоскелета в электронном микроскопе.
На ультратонком срезе клетки эпителия почки видны актиновые микрофиламенты, промежуточные филаменты К8/К18 и микротрубочки.