Ang reaksyon para sa DNA polymerase ay positibo. Pagsusuri ng PCR: ano ito? Paano kumuha ng PCR test. Ang PCR ay ang pangunahing paraan para makita ang mga nakatagong impeksyon

Polymerase chain reaction (PCR)- ay isang pamamaraan ng biochemical na teknolohiya sa molecular biology, na isinasagawa na may layuning madagdagan ang isa o higit pang mga kopya ng mga fragment ng DNA ng ilang degree, na nagpapahintulot sa iyo na lumikha mula sa ilang libo hanggang sa milyon-milyong mga kopya ng isang tiyak na pagkakasunud-sunod ng DNA.

Binuo noong 1983 ni Cary Mullis, ang paraan ng PCR ay isa na ngayong karaniwan at kadalasang kailangang-kailangan na paraan na ginagamit sa mga laboratoryo ng medikal at biyolohikal na pananaliksik para sa maraming iba't ibang mga aplikasyon. Kabilang dito ang DNA cloning para sa sequencing, DNA-based phylogeny, o functional analysis ng mga gene; diagnosis ng mga namamana na sakit; pagkakakilanlan ng genetic fingerprints (ginagamit sa mga sangay ng forensic science at sa paternity testing), pati na rin ang pagtuklas at pagsusuri ng mga nakakahawang sakit. Noong 1993, ginawaran si Mullis ng Nobel Prize sa Chemistry kasama si Michael Smith para sa kanilang trabaho sa PCR.

Ang pamamaraan ay batay sa thermal cycling, na binubuo ng mga paulit-ulit na cycle ng heating at cooling reactions sa denature at pagkopya ng DNA ng mga enzyme. Ang mga panimulang aklat, (maiikling piraso ng DNA) na naglalaman ng mga pagkakasunud-sunod na pantulong sa target na site kasama ang DNA polymerase (kung saan pinangalanan ang pamamaraan), ay mga pangunahing bahagi upang humimok ng pumipili at muling pagpapalakas. Sa proseso ng PCR, ang synthesized DNA mismo ay ginagamit bilang isang template para sa pagtitiklop, na nagtatakda ng isang chain reaction kung saan ang template na DNA ay pinalaki nang exponentially. Ang PCR ay maaaring makabuluhang mabago upang maisagawa ang isang malawak na hanay ng mga genetic manipulations.

Halos lahat ng PCR application ay gumagamit ng thermostable DNA polymerase gaya ng Taq polymerase, isang enzyme na orihinal na nakahiwalay sa bacteria. Thermusaquaticus. Ang DNA polymerase na ito ay enzymatically na nag-iipon ng bagong strand ng DNA mula sa mga building blocks ng DNA - mga nucleotides, gamit ang single-stranded DNA bilang template at DNA oligonucleotides (tinatawag ding DNA primers) na kailangan para simulan ang DNA synthesis. Ang karamihan sa mga pamamaraan ng PCR ay gumagamit ng thermal cycling, ibig sabihin, kahaliling pag-init at paglamig ng sample ng PCR sa isang tiyak na serye ng mga hakbang sa temperatura. Ang mga thermal cycling na hakbang na ito ay kinakailangan muna upang pisikal na paghiwalayin ang dalawang strand ng DNA double helix sa mataas na temperatura sa isang proseso na tinatawag na DNA denaturation. Sa mas mababang temperatura, ang bawat strand ay gagamitin bilang isang template sa DNA synthesis ng DNA polymerase upang piliing palakasin ang target na rehiyon ng DNA. Selectivity ng mga resulta ng PCR gamit ang mga primer na pantulong sa target na rehiyon ng DNA para sa amplification sa ilalim ng ilang partikular na kondisyon ng thermal cycling.

Mga prinsipyo ng PCR diagnostics

Ginagamit ang PCR upang palakihin ang isang partikular na seksyon ng isang DNA chain (target DNA). Karamihan sa mga pamamaraan ng PCR ay karaniwang nagpapalaki ng mga fragment ng DNA hanggang sa ~10,000 base pairs (kb), bagama't ang ilang mga pamamaraan ay nagpapahintulot sa mga fragment na ma-scale hanggang 40 kb ang laki. Ang reaksyon ay gumagawa ng isang limitadong halaga ng panghuling amplified na produkto, na kinokontrol ng mga magagamit na reagents sa reaksyon at feedback-inhibition ng mga produkto ng reaksyon.

Ang pangunahing PCR kit ay nangangailangan ng ilang bahagi at reagents. Kabilang dito ang:

template ng DNA, na naglalaman ng target na rehiyon ng DNA na palakihin.
dalawang panimulang aklat, pandagdag sa 3' dulo ng bawat sense at antisense strands ng target na DNA.
Taq polymerase o ibang DNA polymerase na gumagana sa pinakamabuting kalagayan na temperatura na humigit-kumulang 70°C.
Mga deoxynucleoside triphosphate(dNTPs; triphosphate group na naglalaman ng mga nucleotides), ang mga bloke ng gusali kung saan ang DNA polymerase ay nag-synthesize ng bagong DNA strand.
solusyon sa buffer, na nagbibigay ng angkop na kondisyong kemikal para sa pinakamainam na aktibidad at katatagan ng DNA polymerase.
divalent cations, magnesiyo o mangganeso ions; Ang Mg2+ ay karaniwang ginagamit, ngunit ang Mn2+ ay maaari ding gamitin para sa PCR-mediated DNA mutagenesis, dahil ang mas mataas na konsentrasyon ng Mn2+ ay nagpapataas ng error rate sa panahon ng DNA synthesis.
Mga monovalent na kasyon potassium ions.

Karaniwang isinasagawa ang PCR sa dami ng reaksyon na 10-200 µl sa maliliit na tubo ng reaksyon (volume 0.2-0.5 ml) sa isang thermal cycler-amplifier. Pinapainit at pinapalamig ng cycler ang mga tubo ng reaksyon upang makamit ang mga temperatura na kinakailangan para sa bawat hakbang ng reaksyon. Maraming modernong cyclers ang gumagamit ng Peltier effect, na nagpapahintulot sa pagpainit at paglamig ng PCR tube assembly sa pamamagitan lamang ng pag-reverse ng direksyon ng electrical current. Ang mga tubo ng reaksyon na may manipis na pader ay nagtataguyod ng paborableng thermal conductivity upang matiyak ang mabilis na thermal equilibrium. Ang mga matatandang siklista na walang pinainit na takip ay nangangailangan ng isang layer ng langis sa ibabaw ng pinaghalong reaksyon o isang butil ng wax sa isang vial.

Pagkakasunud-sunod ng pamamaraan

Karaniwan, ang PCR ay binubuo ng isang serye ng 20-40 na paulit-ulit na pagbabago sa temperatura na tinatawag na mga cycle, na ang bawat cycle ay karaniwang binubuo ng 2-3 discrete temperature steps, karaniwang tatlo. Ang pagbibisikleta ay madalas na nagsisimula at nagtatapos sa isang hakbang sa temperatura (tinatawag na pag-asa) sa mataas na temperatura (> 90 ° C) para sa panghuling pagpapalawak ng produkto o maikling imbakan. Ang mga temperatura na ginamit at ang tagal ng kanilang aplikasyon sa bawat cycle ay depende sa maraming mga parameter. Kabilang dito ang enzyme na ginagamit para sa DNA synthesis, ang konsentrasyon ng mga divalent ions at dNTP sa reaksyon, at ang melting point (Tm) ng mga primer.

Yugto ng pagsisimula: Ang hakbang na ito ay binubuo ng pag-init ng reaksyon sa isang temperatura na 94-96°C (o 98°C kung ginagamit ang mga polymerase na mataas ang init), na isinasagawa sa loob ng 1-9 minuto. Ang hakbang ay kinakailangan lamang para sa DNA polymerases na nangangailangan ng heat activation, ang tinatawag na hot start PCR.
Hakbang sa denaturation: Ito ang unang regular na thermal cycling event at binubuo ng pag-init ng reaksyon sa 94-98°C sa loob ng 20-30 segundo. Nagiging sanhi ito ng cleavage ng DNA template na may pagkasira ng hydrogen bonds sa pagitan ng mga complementary base at pagbuo ng single-stranded DNA molecules.
Hakbang ng pagsusubo: Ang temperatura ng reaksyon ay binabawasan sa 50-65°C sa loob ng 20-40 segundo, na nagpapahintulot sa mga primer na magbigkis sa single-stranded na template ng DNA. Karaniwan ang temperatura ng pagsusubo ay humigit-kumulang 3-5 degrees Celsius sa ibaba ng Tm ng mga panimulang aklat na ginamit. Ang matatag na DNA-DNA hydrogen bond ay nabubuo lamang kapag ang primer sequence ay mas malapit na tumugma sa sequence template. Ang polymerase ay nagbubuklod sa primer-template hybrid at nagpasimula ng DNA synthesis.
Yugto ng pagpapalawak / pagpapahaba: Ang temperatura sa hakbang na ito ay depende sa DNA polymerase na ginamit; Ang Taq polymerase ay may pinakamainam na temperatura ng aktibidad sa 75-80°C; ang temperaturang 72°C ay karaniwang ginagamit para sa enzyme na ito. Sa yugtong ito, ang DNA polymerase ay nag-synthesize ng bagong DNA strand na pandagdag sa DNA template strand sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga dNTP na pantulong sa template sa 5" hanggang 3" na direksyon, na nag-uugnay sa 5"-phosphate group ng dNTP sa 3"- hydroxyl group sa dulo ng nagreresulta (lumalawak ) na DNA. Ang oras ng pagpapalawak ay nakasalalay sa parehong DNA polymerase na ginamit at ang haba ng fragment ng DNA na palakihin. Karaniwan, sa pinakamabuting kalagayan na temperatura nito, ang DNA polymerase ay nagpapapolimerize ng isang libong base kada minuto. Sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon, i.e. sa kawalan ng mga paghihigpit dahil sa paglilimita sa mga substrate o reagents, sa bawat hakbang ng pagpapalawak, ang dami ng target na DNA ay nadodoble, na nagreresulta sa isang exponential (geometric) amplification ng isang fragment ng DNA.
Panghuling extension: Ito ang tanging hakbang, kung minsan ay ginagawa sa 70-74°C sa loob ng 5-15 minuto pagkatapos ng huling PCR cycle, upang matiyak na ang anumang natitirang single-stranded na DNA ay ganap na lumawak.
Panghuling inaasahan: Ang hakbang na ito sa 4-15 °C nang walang katiyakan ay maaaring gamitin upang mapanatiling maikli ang reaksyon. Upang suriin kung na-synthesize ng PCR ang inaasahang fragment ng DNA (tinatawag din minsan bilang "amplimer" o "amplicon"), ginagamit ang agarose gel electrophoresis upang paghiwalayin ang mga produkto ng PCR ayon sa laki. Ang laki ng mga produkto ng PCR ay tinutukoy sa pamamagitan ng paghahambing sa isang hagdan ng DNA (molecular weight marker) na naglalaman ng mga fragment ng DNA na alam ang laki, na ginawa sa isang gel kasama ng mga produkto ng PCR.

Mga yugto ng polymerase chain reaction

Ang proseso ng PCR ay maaaring nahahati sa tatlong hakbang:

Exponential Amplification: Sa bawat pag-ikot, nadodoble ang dami ng produkto (ipagpalagay na 100% ang kahusayan ng reaksyon). Napakasensitibo ng reaksyon: kaunting DNA lang ang kailangan.
Yugto ng pag-level: bumagal ang reaksyon habang nawawalan ng aktibidad ang DNA polymerase at ang pagkonsumo ng mga reagents tulad ng dNTPs at mga primer ay nagiging sanhi ng kanilang paglimita .
Talampas: Hindi na naiipon ang produkto dahil sa pagkaubos ng mga reagents at enzymes.

Pag-optimize ng PCR

Sa pagsasagawa, ang PCR ay maaaring mabigo sa iba't ibang dahilan, lalo na dahil sa pagiging sensitibo nito sa kontaminasyon, na nagiging sanhi ng pagpapalakas ng mga by-product ng DNA. Sa pagsasaalang-alang na ito, maraming mga pamamaraan at pamamaraan ang binuo upang ma-optimize ang mga kondisyon ng PCR. Ang dayuhang kontaminasyon ng DNA ay pinangangasiwaan ng mga protocol at pamamaraan ng laboratoryo na naglilinis ng mga pre-PCR mixtures ng mga potensyal na contaminant ng DNA. Karaniwang kasama rito ang paghihiwalay ng mga PCR kit mula sa mga lugar ng pagsusuri o paglilinis ng mga produkto ng PCR, gamit ang mga disposable plastic na kagamitan, at masusing paglilinis sa ibabaw ng trabaho sa pagitan ng mga hakbang ng reaksyon. Ang mga diskarte sa disenyo ng panimulang aklat ay may mahalagang papel sa pagpapabuti ng paghihiwalay ng mga produkto ng PCR at sa pag-iwas sa pagbuo ng mga by-product, at ang paggamit ng mga alternatibong bahagi ng buffer o polymerase enzyme ay maaaring makatulong sa pagpapalaki ng mahaba o kung hindi man ay may problemang mga rehiyon ng DNA. Ang pagdaragdag ng mga reagents tulad ng formamide sa mga buffer system ay maaaring tumaas ang pagiging tiyak at pagbawi ng PCR. Maaaring isagawa ang computer simulation ng teoretikal na resulta ng PCR (electronic PCR) upang tumulong sa panimulang disenyo.

Paglalapat ng PCR

Selective DNA isolation

Pinapayagan ng PCR ang paghihiwalay ng mga fragment ng DNA mula sa genomic DNA sa pamamagitan ng selective amplification ng isang partikular na rehiyon ng DNA. Ang application na ito ng PCR ay umaakma sa maraming pamamaraan, tulad ng paglikha ng hybridization probes para sa Southern o Northern blotting at DNA cloning method, na nangangailangan ng malaking halaga ng DNA na kumakatawan sa isang partikular na rehiyon ng DNA. Ang PCR ay nagbibigay ng mga pamamaraang ito ng mataas na nilalaman ng purong DNA, na nagpapahintulot sa pagsusuri ng mga sample ng DNA, kahit na may maliit na halaga ng panimulang materyal.

Kasama sa iba pang mga aplikasyon ng PCR ang DNA sequencing upang matukoy ang hindi kilalang mga PCR-amplified sequence, kung saan ang isa sa mga amplification primer ay maaaring gamitin sa Sanger sequencing, DNA sequence isolation upang mapabilis ang mga recombinant na teknolohiya ng DNA na kinasasangkutan ng pagpasok ng isang DNA sequence sa isang plasmid o genetic material. ng ibang organismo. Ang mga kolonya ng bakterya (E. coli) ay maaaring mabilis na ma-screen ng PCR upang itama ang disenyo ng vector DNA. Maaari ding gamitin ang PCR para sa genetic fingerprinting; isang pamamaraan na ginagamit sa forensic na gamot upang makilala ang isang tao o organismo sa pamamagitan ng paghahambing ng eksperimentong DNA gamit ang iba't ibang paraan ng PCR.

Ang ilang "fingerprint" na mga paraan ng PCR ay may mataas na kapangyarihan sa diskriminasyon at maaaring gamitin upang matukoy ang mga genetic na relasyon sa pagitan ng mga indibidwal, tulad ng magulang-anak o sa pagitan ng magkakapatid, at ginagamit sa pagsusuri sa paternity. Ang pamamaraan na ito ay maaari ding ilapat upang matukoy ang mga ebolusyonaryong relasyon sa pagitan ng mga organismo.

Pagpapalaki at dami ng DNA

Dahil pinapataas ng PCR ang bilang ng kopya ng mga target na rehiyon ng DNA, maaaring gamitin ang PCR upang pag-aralan ang napakaliit na halaga ng sample. Ito ay madalas na kritikal para sa forensic na pagsisiyasat kung saan ang mga bakas na halaga ng DNA lamang ang magagamit bilang ebidensya. Ang PCR ay maaari ding gamitin upang pag-aralan ang sinaunang DNA na sampu-sampung libong taong gulang. Ang mga pamamaraan ng PCR na ito ay matagumpay na ginamit sa mga hayop tulad ng 40,000 taong gulang na mammoth, gayundin sa DNA ng tao, sa mga aplikasyon mula sa pagsusuri ng mga Egyptian mummies hanggang sa pagkilala sa isang Russian tsar.

Tinatantya ng quantitative na mga pamamaraan ng PCR ang dami ng isang naibigay na sequence na nasa isang sample, isang paraan na kadalasang ginagamit upang mabilang ang antas ng expression ng gene. Ang real-time na PCR ay isang itinatag na tool sa quantification ng DNA na sumusukat sa akumulasyon ng DNA ng produkto pagkatapos ng bawat cycle ng PCR amplification.

PCR sa pagsusuri ng mga sakit

Pinapayagan ng PCR ang maagang pagsusuri ng mga malignant na sakit tulad ng leukemia at lymphoma, na kasalukuyang lubos na binuo sa pananaliksik sa kanser at ginagamit na nang regular. Maaaring direktang isagawa ang PCR sa mga genomic DNA sample upang matukoy ang translocation-specific na malignant na mga cell na may sensitivity na hindi bababa sa 10,000 beses na mas mataas kaysa sa iba pang mga pamamaraan.

Pinapayagan din ng PCR ang pag-detect ng mga hindi nalilinang o mabagal na paglaki ng mga organismo tulad ng mycobacteria, anaerobic bacteria, at mga virus mula sa tissue culture at mga modelo ng hayop. Ang batayan para sa mga aplikasyon ng diagnostic ng PCR sa larangan ng microbiology ay ang pagkilala sa mga nakakahawang ahente at ang pagkita ng kaibahan ng mga non-pathogenic na strain mula sa mga pathogenic dahil sa mga partikular na gene.

Ang viral DNA ay maaari ding matukoy ng PCR. Ang mga panimulang aklat ay dapat na tiyak sa target na DNA sequence ng virus, at ang PCR ay maaaring gamitin para sa diagnostic DNA test o sequencing ng viral genome. Ang mataas na sensitivity ng PCR ay ginagawang posible na makakita ng mga virus sa lalong madaling panahon pagkatapos ng impeksyon at kahit na bago ang pagsisimula ng sakit. Ang maagang pagtuklas ng virus na ito ay maaaring magbigay sa mga doktor ng makabuluhang opsyon sa paggamot. Ang dami ng virus ("viral load") sa isang pasyente ay maaari ding matukoy sa pamamagitan ng quantitative PCR-based DNA analysis.

Mga pagkakaiba-iba sa mga pangunahing pamamaraan ng polymerase chain reaction

PCR na partikular sa allele: diagnostic o cloning method batay sa single nucleotide polymorphisms (SNPs) (mga single base differences sa DNA). Nangangailangan ng paunang kaalaman sa pagkakasunud-sunod ng DNA, kabilang ang mga pagkakaiba sa pagitan ng mga alleles, at gumagamit ng mga primer na ang 3' dulo ay sumasaklaw sa mga SNP. Ang mahigpit na PCR amplification ay hindi gaanong mahusay sa pagkakaroon ng hindi pagkakatugma sa pagitan ng template at primer, kaya matagumpay na amplification na may partikular na SNP panimulang senyales tungkol sa pagkakaroon ng mga tiyak na SNP sa pagkakasunud-sunod.
PCR assembly o polymerase cycling assembly (PCP): artipisyal na synthesis ng mahabang DNA sequence ng PCR sa isang pool ng mahabang oligonucleotides na may maiikling magkapatong na mga segment. Ang mga oligonucleotides ay nagpapalit-palit sa pagitan ng sense at antisense strand na mga direksyon, at ang magkakapatong na mga segment ay tumutukoy sa pagkakasunud-sunod ng mga fragment ng PCR, at sa gayon ay piling bumubuo ng panghuling mahabang produkto ng DNA.
Asymmetric PCR: mas gusto ang pagpapalaki ng isang strand ng DNA sa isang double-stranded na template ng DNA. Ginagamit sa sequencing at hybridization probing kung saan kailangan ang amplification ng isa lang sa dalawang complementary strand. Ang PCR ay isinasagawa gaya ng dati, ngunit may malaking labis na mga panimulang aklat para sa kadena na inilaan para sa pagpapalakas. Dahil sa mabagal na (aritmetika na pag-unlad) amplification sa dulo ng reaksyon pagkatapos ng paggamit ng isang naglilimita na panimulang aklat, kinakailangan ang mga karagdagang PCR cycle. Ang pinakahuling pagbabago ng prosesong ito, na kilala bilang "LATE-PCR" (linearity after exponential phase - PCR) ay gumagamit ng limiting primer na may mas mataas na melting point (Tm) kaysa sa sobrang primer upang mapanatili ang kahusayan ng reaksyon, dahil bumababa ang konsentrasyon ng naglilimitang primer. sa gitna ng reaksyon.
I-dial-out ang PCR: isang lubos na parallel na paraan upang makakuha ng tumpak na mga molekula ng DNA para sa gene synthesis. Ang kumplikadong pool ng mga molekula ng DNA ay binago ng mga natatanging flank tag sa napakalaking parallel sequencing. Ang mga primer na nakadirekta sa tag ay nagbibigay ng mga sequenced molecule sa pamamagitan ng PCR.
Helicase dependent amplification: katulad ng tradisyonal na PCR ngunit nangangailangan ng pare-parehong temperatura kaysa sa pagbibisikleta sa pamamagitan ng mga siklo ng denaturation at annealing/expansion. Ang DNA helicase, isang enzyme na nag-unwind ng DNA, ay ginagamit sa halip na heat denaturation.
Mainit na simula ng PCR: Isang pamamaraan na binabawasan ang hindi partikular na amplification sa panahon ng paunang pag-setup ng mga hakbang sa PCR. Maaaring gawin nang manu-mano sa pamamagitan ng pag-init ng mga bahagi ng reaksyon sa temperatura ng denaturation (hal. 95 °C) bago idagdag ang polymerase. Ang mga espesyal na sistema ng enzyme ay binuo na pumipigil sa aktibidad ng polymerase sa temperatura ng silid, alinman sa pamamagitan ng antibody binding o sa pagkakaroon ng mga covalently bound inhibitors na naghihiwalay lamang pagkatapos ng isang hakbang sa pag-activate ng mataas na temperatura. Ang hot start/cold finish PCR ay nakakamit gamit ang novel hybrid polymerases na hindi aktibo sa ambient temperature at agarang na-activate sa elongation temperature.
Intermicrosatellite sequence specific PCR (ISSR): Paraan ng fingerprinting ng PCR DNA na nagpapataas ng bilang ng kopya ng mga rehiyon sa pagitan ng mga simpleng pag-uulit na pagkakasunud-sunod upang makakuha ng natatanging fingerprint mula sa pinalakas na haba ng fragment.
Baliktad PCR malawakang ginagamit upang tukuyin ang mga sequence region sa paligid ng genomic insert. Kabilang dito ang isang serye ng mga cleavage ng DNA at self-ligation, na nagreresulta sa mga kilalang sequence sa magkabilang dulo ng hindi kilalang sequence.
PCR mediated sa pamamagitan ng ligation: Gumagamit ng maliliit na DNA linker na naka-link sa DNA ng interes at ilang primer na naka-link sa DNA linker; ginagamit para sa DNA sequencing, genome walking, at DNA footprinting.
PCR na tukoy sa methylation(MSP): Binuo nina Stephen Bailin at Jim Herman sa Johns Hopkins School of Medicine, ginagamit ito upang makita ang methylation ng mga isla ng CpG sa genomic DNA. Ang DNA ay unang ginagamot ng sodium bisulfite, na nagko-convert sa mga unmethylated cytosine base sa uracil, na kinikilala ng mga PCR primer bilang thymine. Dalawang PCR ang ginagawa sa binagong DNA gamit ang mga set ng magkaparehong primer maliban sa anumang CpG na isla sa loob ng primer sequence. Sa mga puntong ito, kinikilala ng isang hanay ng mga panimulang aklat ang DNA na may mga cytosine upang madagdagan ang bilang ng kopya ng methylated DNA, at ang isang set ay kinikilala ang DNA na may uracil o thymine upang palakihin ang hindi namethylated DNA. Ang MSP gamit ang qPCR ay maaari ding isagawa upang makakuha ng quantitative kaysa sa qualitative na impormasyon sa methylation.
Miniprimer - PCR: ang mga thermostable polymerases (S-Tbr) ay ginagamit, na maaaring umabot mula sa mga maiikling primer ("smalligos"), na may bilang na 9 o 10 nucleotides. Ang diskarteng ito ay nagbibigay-daan sa PCR na i-target ang mga rehiyon na nauugnay sa mas maliliit na primer at ginagamit upang palakasin ang mga conserved DNA sequence gaya ng 16S (o eukaryotic 18S) rRNA gene.
Multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA): nagbibigay-daan sa pagpapalakas ng maramihang mga target na may isang pares lamang ng mga panimulang aklat, kaya iniiwasan ang mga limitasyon sa paglutas ng multiplex PCR.
Multiplex PCR ay binubuo ng ilang hanay ng mga panimulang aklat sa isang pinaghalong PCR upang makakuha ng mga amplicon na may iba't ibang laki na tiyak para sa iba't ibang mga pagkakasunud-sunod ng DNA. Sa pamamagitan ng pagtutok sa ilang mga gene sa parehong oras, posibleng makakuha ng karagdagang impormasyon sa panahon ng isang pagsubok, na kung hindi man ay mangangailangan ng ilang beses na mas maraming reagents at mas maraming oras para gumanap. Ang mga temperatura ng pagsusubo para sa bawat set ng panimulang aklat ay dapat na i-optimize upang gumana nang tama sa loob ng isang reaksyon, at may mga laki ng amplicon. Iyon ay, ang haba ng kanilang base pair ay dapat na sapat na naiiba upang bumuo ng mga natatanging banda kapag nakikita ng gel electrophoresis.
Nested PCR: pinapataas ang pagiging tiyak ng amplification ng DNA, sa pamamagitan ng pagbabawas ng background dahil sa hindi partikular na amplification ng DNA. Dalawang hanay ng mga panimulang aklat ang ginagamit sa dalawang magkasunod na PCR. Sa unang reaksyon, isang pares ng mga panimulang aklat ang ginagamit upang i-synthesize ang mga produkto ng DNA, na, bilang karagdagan sa nilalayon na layunin, ay maaari pa ring binubuo ng mga hindi partikular na pinalakas na mga fragment ng DNA. Pagkatapos ay gagamitin ang mga produkto sa pangalawang PCR na may panimulang set na ang mga binding site ay ganap o bahagyang naiiba sa 3' dulo ng bawat primer na ginamit sa unang reaksyon. Ang nested PCR ay kadalasang mas matagumpay sa partikular na pagpapalaki ng mahabang fragment ng DNA kaysa tradisyonal na PCR, ngunit nangangailangan ito ng mas detalyadong kaalaman sa mga pagkakasunud-sunod ng target.
PCR na may magkakapatong na extension o splicing na may magkakapatong na extension(SOE): Isang genetic engineering technique na ginagamit upang pagsamahin ang dalawa o higit pang piraso ng DNA na naglalaman ng mga pantulong na pagkakasunud-sunod. Ginagamit upang ikonekta ang mga piraso ng DNA na naglalaman ng mga gene na kumokontrol sa mga pagkakasunud-sunod o mutasyon; pinahihintulutan ng pamamaraan ang paglikha ng mga tiyak at mahabang konstruksyon ng DNA.
Quantitative PCR (QPCR): ginagamit upang sukatin ang dami ng produkto ng PCR (kadalasan sa real time). Binibilang ang mga paunang dami ng DNA, cDNA o RNA. Ang qPCR ay malawakang ginagamit upang matukoy ang pagkakaroon ng isang DNA sequence sa isang sample at ang numero ng kopya nito sa sample. Ang real-time na quantitative PCR ay may napakataas na antas ng katumpakan. Gumagamit ang mga pamamaraan ng QRT-PCR (o QF-PCR) ng mga fluorescent dyes gaya ng Sybr Green, EvaGreen, o fluorophore-containing DNA probes gaya ng TaqMan para sukatin ang dami ng amplified na produkto sa real time. Minsan tinutukoy bilang RT-PCR (real-time PCR) o RQ-PCR. Ang QRT-PCR o RTQ-PCR ay mas angkop na mga pagdadaglat dahil karaniwang tumutukoy ang RT-PCR sa reverse transcription PCR na kadalasang ginagamit kasabay ng qPCR.
Reverse transcription PCR (RT-PCR): upang madagdagan ang bilang ng kopya ng DNA mula sa RNA. Ang reverse transcriptase ay nag-transcribe ng RNA sa cDNA, na pagkatapos ay pinalakas ng PCR. Ang RT-PCR ay malawakang ginagamit sa expression profiling upang makita ang expression ng gene o upang matukoy ang pagkakasunud-sunod ng isang RNA transcript, kabilang ang mga site ng pagsisimula at paghinto ng transkripsyon. Kung alam ang genomic DNA sequence ng isang gene, maaaring gamitin ang RT-PCR upang i-map ang lokasyon ng mga exon at intron sa gene. Ang 5' dulo ng isang gene (naaayon sa transcription start site) ay karaniwang tinutukoy ng RACE-PCR (mabilis na paglaki ng mga dulo ng cDNA).
solid phase PCR: sumasaklaw sa ilang mga kahulugan, kabilang ang "Polonia Amplification" (kung saan ang PCR ng mga kolonya ay ginawa sa isang gel matrix, halimbawa), "Bridge PCR" (primer ay covalently bonded sa isang solid support surface), tradisyonal na solid phase PCR (kung saan "asymmetric PCR" ay ginagamit sa pagkakaroon ng mga primer na may solidong suporta na may pagkakasunud-sunod na tumutugma sa isa sa mga may tubig na primer), at pinahusay na solid phase PCR (kung saan ang conventional solid phase PCR ay maaaring mapabuti sa pamamagitan ng paggamit ng mataas na Tm at nested solid-support primer na may ang opsyon ng paglalapat ng isang thermal "hakbang" upang itaguyod ang pagbuo ng mga primer na may matatag na suporta).
Thermal Asymmetric Interleaved PCR (TAIL-PCR): ay ginagamit upang ihiwalay ang isang hindi kilalang sequence kasunod ng isang kilalang sequence. Sa isang kilalang sequence, ang TAIL-PCR ay gumagamit ng isang nested na pares ng mga primer na may iba't ibang temperatura ng pagsusubo; Ang primer degenerate ay ginagamit upang palakihin sa ibang direksyon mula sa hindi kilalang sequence.
Touchdown PCR (Step PCR): isang variant ng PCR na naglalayong bawasan ang hindi partikular na background sa pamamagitan ng unti-unting pagbaba sa temperatura ng pagsusubo habang umuusad ang mga cycle ng PCR. Ang temperatura ng pagsusubo sa mga unang cycle ay karaniwang ilang degrees (3-5°C) sa itaas ng Tm ng mga primer na ginamit, habang sa mga susunod na cycle, ang temperatura ay ilang degrees (3-5°C) sa ibaba ng Tm ng mga panimulang aklat. Ang mas mataas na temperatura ay nagbibigay ng higit na partikularidad para sa panimulang pagbubuklod, at ang mas mababang temperatura ay nagbibigay-daan para sa mas mahusay na amplification mula sa mga partikular na produkto na nabuo sa mga unang cycle.
PAN-AC: Gumagamit ng isothermal na kondisyon para sa amplification at maaaring ilapat sa mga buhay na selula.
Universal mabilis na paglalakad sa genome: para sa paglalakad sa genome at genetic fingerprinting gamit ang mas tiyak na "two-sided" PCR kaysa sa tradisyonal na "one-sided" approach (gamit lamang ang isang gene-specific primer at isang karaniwang primer - na maaaring humantong sa artifactual na "ingay") dahil sa mekanismo , kabilang ang pagbuo ng isang istraktura ng laso. Ang mga pinasimpleng derivatives ng UFW ay "Lane RAGE" (lasso nested PCR para sa mabilis na pag-amplification ng genomic DNA ends), "5" RACE Lane" at "3" RACE Lane.
SasilicoPCR(digital PCR, virtual PCR, e-PCR, e-PCR) ay tumutukoy sa mga computational tool na ginagamit upang kalkulahin ang mga resulta ng isang theoretical polymerase chain reaction gamit ang isang naibigay na hanay ng mga primer (probes) upang palakihin ang mga sequence ng DNA mula sa isang sequenced genome o transcriptome.

Kasaysayan ng PCR

Sa isang artikulo sa Journal of Molecular Biology noong 1971, unang inilarawan ni Kleppe et al. ang isang pamamaraan gamit ang enzymatic assay upang kopyahin ang isang maikling DNA template na may mga primer sa ilalim ng mga kondisyong in vitro. Gayunpaman, ang maagang pagpapakita ng pangunahing prinsipyo ng PCR ay hindi nakatanggap ng maraming pansin, at ang pag-imbento ng polymerase chain reaction noong 1983 ay karaniwang kredito kay Carey Mullis.

Nang bumuo si Mullis ng PCR noong 1983, nagtatrabaho siya sa Emeryville, California para sa Cetus Corporation, isang maagang kumpanya ng biotech. Doon siya ay responsable para sa synthesis ng maikling DNA chain. Isinulat ni Mullis na siya ay naglihi ng PCR habang nagmamaneho sa highway ng Pacific Coast isang gabi sa kanyang sasakyan. Naglaro siya sa kanyang isip ng isang bagong paraan upang pag-aralan ang mga pagbabago (mutations) sa DNA nang mapagtanto niya na sa halip ay nag-imbento siya ng isang paraan upang madagdagan ang numero ng kopya ng anumang seksyon ng DNA sa pamamagitan ng paulit-ulit na mga siklo ng pagdoble na dulot ng DNA polymerase. Sa Scientific American, ibinuod ni Mullis ang pamamaraan: “Simula sa isang molekula ng DNA genetic material, ang PCR ay maaaring makabuo ng 100 bilyong gayong mga molekula sa isang araw. Ang reaksyong ito ay madaling gawin. Nangangailangan ito ng hindi hihigit sa isang test tube, ilang simpleng reagents, at pinagmumulan ng init." Ginawaran siya ng Nobel Prize sa Chemistry noong 1993 para sa kanyang imbensyon, makalipas ang pitong taon nang isagawa niya at ng kanyang mga kasamahan sa Cetus ang kanyang panukala sa unang pagkakataon. Gayunpaman, nananatili ang ilang kontrobersya tungkol sa intelektwal at praktikal na mga kontribusyon ng ibang mga siyentipiko sa gawain ni Mullis, at kung siya ang nag-iisang imbentor ng prinsipyo ng PCR.

Ang paraan ng PCR ay batay sa paggamit ng angkop na DNA polymerase na may kakayahang makayanan ang mataas na temperatura na >90°C (194°F) na kinakailangan upang maputol ang dalawang strand ng DNA sa DNA double helix pagkatapos ng bawat ikot ng pagtitiklop. Ang mga polymerase ng DNA, na orihinal na ginamit para sa mga in vitro na eksperimento, na inilarawan ng PCR, ay hindi nakayanan ang gayong mataas na temperatura. Samakatuwid, ang mga maagang pamamaraan ng pagtitiklop ng DNA ay napaka hindi epektibo at nakakaubos ng oras, at nangangailangan ng malaking halaga ng DNA polymerase at patuloy na pagproseso sa buong proseso.

Pagtuklas noong 1976 ng Taq polymerase, isang DNA polymerase na nakahiwalay sa isang thermophilic bacterium, Thermusaquaticus, na natural na naninirahan sa mainit (50 hanggang 80°C (122 hanggang 176°F)) na mga kapaligiran tulad ng mga hot spring, ang nagbigay daan para sa isang kapansin-pansing pagpapabuti sa paraan ng PCR. Nahiwalay ang DNA polymerase sa T.Aquaticus, ay matatag sa mataas na temperatura at nananatiling aktibo kahit na pagkatapos ng denaturation ng DNA, kaya inaalis ang pangangailangan na magdagdag ng mga bagong DNA polymerases pagkatapos ng bawat cycle. Ginawa nitong posible na i-automate ang proseso ng DNA amplification batay sa isang thermal cycler.

Patent Wars

Ang iminungkahing paraan ng PCR ay patented ni Carey Mullis at na-kredito sa Cetus Corporation kung saan nagtrabaho si Mullis noong naimbento niya ang pamamaraan noong 1983. Ang Taq polymerase enzyme ay protektado rin ng mga patent. Mayroong ilang mga high-profile na demanda na nauugnay sa pamamaraan, kabilang ang isang hindi matagumpay na demanda na inihain ng DuPont. Nakuha ng kumpanya ng parmasyutiko na Hoffmann-La Roche ang mga karapatan sa mga patent noong 1992 at kasalukuyang hawak ang mga protektado pa rin.

Ang isang katulad na labanan sa patent sa Taq polymerase enzyme ay nagpapatuloy pa rin sa ilang hurisdiksyon sa buong mundo sa pagitan ng Roche at Promega. Ang mga legal na argumento ay lumampas sa mga tuntunin ng orihinal na mga patent ng PCR at Taq polymerase, na nag-expire noong Marso 28, 2005.

Ang polymerase chain reaction (PCR) ay isang mataas na katumpakan na pamamaraan sa larangan ng pag-diagnose ng mga namamana na pathologies, impeksyon, mga sakit sa viral sa anumang yugto (talamak o talamak), at gayundin - sa isang maagang yugto - bago ang mga halatang pagpapakita ng sakit sa pamamagitan ng pagtukoy ng mga pathogen. batay sa kanilang DNA, RNA , na genetic material, sa mga sample na nakuha mula sa pasyente. At ngayon ay pag-uusapan natin ang kakanyahan, mga yugto ng diagnostic at mga prinsipyo ng mga pamamaraan ng polymerase chain reaction (PCR), pati na rin ang gastos nito.

Ano ang polymerase chain reaction

Ang batayan ng pagsusuri ay amplification (pagdodoble) - ang paglikha ng maraming mga kopya mula sa isang maikling seksyon ng DNA (deoxyribonucleic acid), na kumakatawan sa genetic complex ng tao. Ang pag-aaral ay nangangailangan ng napakaliit na halaga ng physiological substance (dura, feces, epithelial scrapings, prostate juice, dugo, semen, amniotic fluid, mucus, placental tissue, ihi, laway, pleural fluid, cerebrospinal fluid). Sa kasong ito, halimbawa, kahit na ang isang nakakapinsalang mikrobyo ay maaaring makita sa urogenital tract ng isang pasyente.

Ang PCR technique (polymerase chain reaction) ay binuo ng American scientist na si K. Mullis, na nakatanggap ng Nobel Prize noong 1993.

Aktibong ginagamit:

sa maagang pagsusuri ng mga impeksyon, genetic,;
sa forensic na medikal na pagsusuri sa pagkakaroon ng napakaliit na halaga ng DNA para sa pananaliksik;
sa veterinary medicine, pharmaceuticals, biology, molecular genetics;
para sa pagkakakilanlan ng isang tao sa pamamagitan ng DNA, kumpirmasyon ng pagiging ama;
sa paleontology, antropolohiya, ekolohiya (kapag sinusubaybayan ang kalidad ng mga produkto, mga kadahilanan sa kapaligiran).

Sasabihin sa iyo ng video na ito kung ano ang polymerase chain reaction:

Kanino ito nakatalaga

Ang reaksyon ng kadena ng polymerase sa pagsusuri ng mga nakakahawang sakit ay isa sa mga pinaka maaasahang pamamaraan ng mataas na katumpakan at pagiging maaasahan. Halimbawa, ang pagiging maaasahan ng pagsusuri ng PCR para sa chlamydia at maraming iba pang mga pathogen ay lumalapit sa 100% (ganap). Kadalasan, ang pamamaraan ng reaksyon ng polymerase chain ay inireseta sa mga pasyente na, kapag nag-diagnose, ay nahihirapang makilala ang isang partikular na pathogen.

Ginagamit ang laboratoryo ng PCR test:

upang makita ang mga pathogen na nagdudulot ng impeksyon sa ihi at genital organ, na mahirap matukoy gamit ang mga pananim o immunological na pamamaraan;
para sa muling pagsusuri ng HIV sa paunang yugto sa kaso ng isang positibo, ngunit kaduda-dudang resulta ng paunang pagsusuri (halimbawa, sa mga bagong silang mula sa mga magulang na nahawaan ng AIDS);
upang magtatag ng isang oncological disease sa isang maagang yugto (pag-aaral ng oncogene mutations) at indibidwal na pagwawasto ng regimen ng paggamot para sa isang partikular na pasyente;
para sa layunin ng maagang pagtuklas at potensyal na paggamot ng namamana na mga pathology.

Kaya, ang mga hinaharap na magulang ay sinusuri upang malaman kung sila ay mga carrier ng isang genetic na patolohiya; sa mga bata, tinutukoy ng PCR ang posibilidad ng pagkakalantad sa isang namamana na sakit.

upang makita ang mga pathology ng pangsanggol sa isang maagang yugto ng pagbubuntis (ang mga indibidwal na selula ng isang lumalagong embryo ay sinusuri para sa mga posibleng mutasyon);
sa mga pasyente bago ang paglipat ng organ - para sa "pag-type ng tissue" (pagtukoy sa pagiging tugma ng tissue);
upang makita ang mga mapanganib na pathogenic na organismo sa naibigay na dugo;
sa mga bagong silang na sanggol - upang makita ang mga nakatagong impeksiyon;
upang suriin ang mga resulta ng antiviral at antimicrobial na paggamot.

Bakit dumaan sa pamamaraang ito?

Dahil ang PCR ay isang napaka-epektibong paraan ng diagnostic na nagbibigay ng halos 100% na resulta, ang pamamaraan ay ginagamit:

upang kumpirmahin o ibukod ang panghuling diagnosis;
mabilis na pagtatasa ng pagiging epektibo ng therapy.

Sa maraming mga kaso, ang PCR ay ang tanging posibleng pagsusuri para sa pag-detect ng isang lumalagong sakit kung ang ibang bacteriological, immunological at virological diagnostic na pamamaraan ay walang silbi.

Ang mga virus ay natutukoy ng PCR kaagad pagkatapos ng impeksyon at bago lumitaw ang mga palatandaan ng sakit. Ang maagang pagtuklas ng virus ay nagbibigay-daan sa agarang paggamot.
Ang tinatawag na "viral load" (o ang bilang ng mga virus sa katawan) ay tinutukoy din ng quantitative DNA analysis.
Ang mga partikular na pathogen (tulad ng tubercle bacillus ni Koch) ay mahirap at masyadong mahaba sa kultura. Binibigyang-daan ka ng pagsusuri ng PCR na mabilis na matukoy ang pinakamababang bilang ng mga pathogen (buhay at patay) sa mga sample na maginhawa para sa pananaliksik.

Ang detalyadong pagsusuri ng pathogen DNA ay ginagamit:

upang matukoy ang pagiging sensitibo nito sa mga partikular na uri ng antibiotics, na nagbibigay-daan sa iyo upang agad na simulan ang paggamot;
upang makontrol ang pagkalat ng mga epidemya sa mga alagang hayop, ligaw na hayop;
upang matukoy at masubaybayan ang mga bagong nakakahawang microbial species at mga subtype ng pathogen na nagpasigla sa mga nakaraang epidemya.

Mga uri ng diagnostic

Pamamaraan ng pamantayan

Ang pagtatasa ng polymerase chain reaction ay isinasagawa batay sa maraming amplification (pagdodoble) ng isang tiyak na fragment ng DNA at RNA gamit ang mga espesyal na primer enzymes. Bilang resulta ng kadena ng pagkopya, isang halaga ng materyal na sapat para sa pananaliksik ay nakuha.

Sa panahon ng pamamaraan, ang nais na fragment lamang ang kinopya (naaayon sa tinukoy na mga partikular na kondisyon) kahit na ito ay aktwal na naroroon sa sample.

Ang detalyadong video na ito na may mga kapaki-pakinabang na diagram ay nagsasabi kung paano gumagana ang PCR:

Iba pang Pamamaraan

Real-time na PCR. Sa ganitong uri ng pag-aaral, ang proseso ng pagtukoy sa isang ibinigay na fragment ng DNA ay magsisimula pagkatapos ng bawat cycle, at hindi pagkatapos makumpleto ang buong chain ng 30-40 cycle. Ang ganitong uri ng pag-aaral ay nagbibigay-daan sa iyo upang makakuha ng impormasyon tungkol sa dami ng isang pathogen (virus o microbe) sa katawan, iyon ay, upang magsagawa ng isang quantitative analysis.
RT-PCR (reverse transcription mode). Ginagamit ang assay na ito upang makahanap ng single-stranded na RNA upang makita ang mga virus na ang genetic base ay RNA (halimbawa, hepatitis C virus, immunodeficiency virus). Sa naturang pag-aaral, isang espesyal na enzyme ang ginagamit - reverse transcriptase at isang tiyak na panimulang aklat, at ang single-stranded na DNA ay binuo batay sa RNA. Pagkatapos ang pangalawang DNA strand ay naibalik mula sa strand na ito at ang karaniwang pamamaraan ay isinasagawa.

Mga indikasyon para sa paghawak

Ang pamamaraan ng PCR ay ginagamit sa klinika ng mga nakakahawang sakit, neonatology, obstetrics, pediatrics, urology, gynecology, venereology, neurology, nephrology, ophthalmology.

Mga indikasyon para sa layunin ng pagsusuri:

paglilinaw ng panganib ng pagbuo ng mga abnormalidad ng genetic sa isang bata na may posibilidad ng mga namamana na pathologies;
pag-diagnose ng parehong mga magulang kapag nagpaplano ng pagbubuntis o isang seryosong kondisyon ng ina sa panahon ng patuloy na pagbubuntis;
mga paghihirap sa paglilihi, pagkilala sa mga sanhi ng kawalan ng katabaan;
hinala ng mga impeksiyong sekswal sa talamak na yugto at may mga sintomas ng kanilang paglipat sa talamak;
pagtuklas ng mga sanhi ng nagpapasiklab na proseso ng hindi malinaw na pinagmulan;
hindi protektadong kaswal at patuloy na pakikipagtalik;
pagpapasiya ng sensitivity ng isang pathogenic microorganism sa mga tiyak na antibiotics;
mga pasyente na may pinaghihinalaang nakatagong impeksiyon upang makita ang mga pathogen bago ang pagbuo ng mga hayagang sintomas (preclinical diagnosis);
mga pasyente upang kumpirmahin ang paggaling pagkatapos ng sakit (retrospective diagnosis);

Ginagamit din ang mga diagnostic kung kinakailangan upang tumpak na matukoy ang mga sumusunod na pathogens:

hepatitis virus (A B C G), human immunodeficiency, cytomegalovirus;
vibrio cholera;
herpes simplex virus, herpetiform species;
retro - adeno - at rhinoviruses;
rubella virus, Epstein-Barr, varicella (Zoster - virus);
parvo at picornaviruses;
bacterium Helicobacter pylori;
legionella, mga pathogenic na uri ng Escherichia coli;
staphylococcus aureus;
pathogen;
Clostridia, dipterya at Haemophilus influenzae;

Ginagamit din ito upang matukoy ang mga impeksyon:

Nakakahawang mononucleosis;
borreliosis, listeriosis, tick-borne encephalitis;
candidiasis na sanhi ng Candida fungi;
mga impeksiyong sekswal - trichomoniasis, ureaplasmosis, maputlang treponema, gardnerellosis, gonorrhea, mycoplasmosis, chlamydia;
tuberkulosis.

Contraindications para sa paghawak

Dahil ang pamamaraan ay hindi isinagawa sa pasyente, nang walang anumang epekto sa katawan, ngunit may biological na materyal na kinuha para sa pananaliksik, walang mga kontraindiksyon para sa PCR dahil sa kawalan ng potensyal na panganib.

Gayunpaman, ang biomaterial sampling mula sa cervical canal ng matris ay hindi isinasagawa pagkatapos ng colposcopy procedure. Ang paghahatid ng mga smears, scrapings para sa pagsusuri ay pinapayagan lamang 4 hanggang 6 na araw pagkatapos ng pagtatapos ng regla at ang kumpletong pagtigil ng paglabas.

Ligtas ba ang pamamaraan

Walang negatibong epekto sa pasyente sa isang nakahiwalay na pag-aaral ng kanyang biomaterial sa laboratoryo ay posible.

Paghahanda para sa pamamaraan (paghahatid ng mga biological na sangkap para sa pagsusuri)

Bilang isang sample para sa pagsusuri ng PCR, kung saan ang DNA ng isang dayuhang pathogen ay nakita, ang anumang biological fluid, tissue, body secretions ay ginagamit. Ang sampling ng sangkap ng pagsubok ay isinasagawa sa anyo ng pagkuha ng dugo mula sa isang ugat, pag-scrape mula sa larynx, lukab ng ilong, urethra, pleural cavity, cervix.

Bago ang diagnostic procedure, ipinapaliwanag ng doktor sa pasyente kung anong materyal ang kukunin:

Kapag sinusuri ang mga impeksyong sekswal, ang mga pagtatago mula sa mga genital organ, ihi, at isang pahid mula sa urethra ay kinukuha.
Kapag pinag-aaralan para sa mga impeksyon sa herpetic, cytomegalovirus, mononucleosis - kumukuha sila ng ihi, isang pamunas sa lalamunan para sa pagsusuri, para sa hepatitis, toxoplasmosis - dugo mula sa isang ugat.
Upang masuri ang iba't ibang uri, ang cerebrospinal fluid ay kinuha.
Sa pulmonology, ang mga sample para sa pagsusuri ay plema at pleural fluid.
Kapag nagsasagawa ng pag-aaral ng mga posibleng impeksyon sa intrauterine sa panahon ng pagbubuntis, ginagamit ang amniotic fluid at placental cells para sa pagsusuri.

Ang pagiging maaasahan at katumpakan ng pagsusuri ay nakasalalay sa sterility ng mga kondisyon kapag kumukuha ng materyal. Dahil ang pagsusuri sa PCR ay lubhang sensitibo, ang anumang kontaminasyon ng sangkap ng pagsubok ay maaaring masira ang resulta.

Ang karampatang paghahanda para sa paghahatid ng biomaterial ay hindi nagpapakita ng anumang kahirapan para sa mga pasyente. Mayroong ilang mga rekomendasyon:

kapag pinag-aaralan para sa mga impeksyong sekswal:
- ibukod ang mga intimate contact 72 oras bago ang paghahatid ng materyal;
- itigil ang paggamit ng anumang mga produkto ng vaginal sa loob ng 3 araw;
- mula sa gabi ng nakaraang araw, huwag magsagawa ng kalinisan sa lugar na pinag-aaralan;
- ibukod ang pag-ihi sa loob ng 3-4 na oras kapag kumukuha ng sample mula sa urethra;
itigil ang pag-inom ng antibiotics isang buwan bago ang pagsusuri para sa mga impeksiyon;
mag-donate ng dugo sa umaga bago kumain at uminom;
ang koleksyon ng unang bahagi ng umaga ng ihi ay isinasagawa sa isang sterile na lalagyan pagkatapos ng isang masusing intimate toilet.

Magbasa nang higit pa tungkol sa kung paano isinasagawa ang mga diagnostic gamit ang polymerase chain reaction method.

Paano ang procedure

Kapag paulit-ulit na nagsasagawa ng PCR study sa reactor (amplifier o thermal cycler), inuulit ang ilang mga cycle:

Ang unang hakbang ay denaturation. Ang laway, dugo, biopsy, gynecological sample, sputum, kung saan ang pagkakaroon ng DNA (o RNA) ng pathogen ay pinaghihinalaang, ay inilalagay sa isang amplifier, kung saan ang materyal ay pinainit at ang DNA ay nahahati sa dalawang magkahiwalay na kadena.
Ang ikalawang hakbang ay pagsusubo o bahagyang paglamig ng materyal. at pagdaragdag ng mga panimulang aklat dito na maaaring makilala ang nais na mga seksyon sa molekula ng DNA at magbigkis sa kanila.
Ang ikatlong hakbang ay pagpapahaba- nangyayari pagkatapos ng pagdaragdag ng 2 panimulang aklat sa bawat isa sa mga hibla ng DNA. Sa panahon ng proseso, ang DNA fragment ng pathogen ay nakumpleto, at ang kopya nito ay nabuo.

Ang mga cycle na ito ay paulit-ulit na parang "chain reaction", sa bawat pagkakataon na humahantong sa pagdodoble ng mga kopya ng isang partikular na fragment ng DNA (halimbawa, isang segment kung saan naka-program ang isang partikular na virus). Sa loob ng ilang oras, maraming mga kopya ng DNA fragment ang nabuo, at ang kanilang presensya sa sample ay nakita. Pagkatapos nito, ang mga resulta ay sinusuri at inihambing sa database ng iba't ibang uri ng pathogens upang matukoy ang uri ng impeksiyon.

Basahin ang tungkol sa interpretasyon ng mga resulta at ang konklusyon batay sa reaksyon ng PCR sa ibaba.

Pag-decipher ng mga resulta

Ang huling resulta ng pag-aaral ay ibinibigay 1-2 araw pagkatapos ng paghahatid ng biological na materyal. Kadalasan - nasa unang araw pagkatapos ng pagsusuri.

Qualitative Analysis

Negatibo ang resulta ay nangangahulugan na walang mga bakas ng mga nakakahawang ahente ang natagpuan sa sangkap na isinumite para sa pananaliksik.
Positibo ang resulta ay nangangahulugan ng pagtuklas ng mga pathogenic na virus o bacteria sa isang biological sample na may napakataas na antas ng katumpakan sa oras ng pagsusumite.

Kung positibo ang resulta, ngunit walang mga palatandaan ng pag-activate ng impeksyon, ang estadong ito ng katawan ay tinatawag na asymptomatic na "malusog na karwahe". Kadalasang sinusunod kapag kumukuha ng biomaterial mula sa isang tiyak na lugar (cervical canal, urethra, oral cavity) sa mga sakit na viral. Ang paggamot sa kasong ito ay hindi kinakailangan, ngunit ang patuloy na pangangasiwa ng medikal ay kinakailangan, dahil may posibilidad:

pagkalat ng virus mula sa mga carrier at impeksyon ng mga malulusog na tao;
pag-activate ng proseso at ang paglipat ng sakit sa isang talamak na anyo.

Gayunpaman, kung ang pagsusuri sa dugo ay positibo, ito ay nagpapahiwatig na ang impeksyon ay nakaapekto sa katawan, at ito ay hindi na isang carrier state, ngunit isang patolohiya na nangangailangan ng agarang partikular na therapy.

Pagsusuri ng Dami

Ang dami ng resulta ay tinutukoy ng espesyalista para sa partikular na uri ng impeksiyon. Sa batayan nito, posible na masuri ang antas ng pag-unlad, ang yugto ng sakit, na ginagawang posible na agad na magreseta ng tamang paggamot.

average na gastos

Ang mga presyo para sa pagsasagawa ng polymerase chain reaction ay tinutukoy ng: ang uri ng pag-aaral, ang pagiging kumplikado ng pagtukoy ng pathogen, ang kahirapan sa pagkolekta ng biological na materyal, ang uri ng pagsusuri (qualitative o quantitative), ang antas ng presyo sa laboratoryo.

Sa kabilang banda, sa pag-aaral ng PCR, maraming mga pathogen ang maaaring makita nang sabay-sabay kapag kumukuha ng isang uri ng materyal para sa pagsusuri. Makakatipid ito sa iba pang mga pagsubok sa laboratoryo.

Tinatayang, ang halaga ng pagsusuri ng PCR sa rubles:

gonococcus, gardnerella, trichomonas vaginalis - mula 180
chlamydia trachomatis - mula 190
papillomavirus - mula 380 hanggang 500
biocenosis ng urogenital tract sa mga kababaihan (quantitative at qualitative assessment ng microflora) - mula 800.

Para sa higit pang kapaki-pakinabang na impormasyon tungkol sa pag-aaral ng PCR, tingnan ang video sa ibaba:

Nakatanggap ng Nobel Prize.

Sa simula ng paggamit ng pamamaraan, pagkatapos ng bawat siklo ng pag-init-paglamig, ang DNA polymerase ay kailangang idagdag sa pinaghalong reaksyon, dahil ito ay hindi aktibo sa mataas na temperatura na kinakailangan upang paghiwalayin ang mga hibla ng DNA helix. Ang pamamaraan ng reaksyon ay medyo hindi epektibo, na nangangailangan ng maraming oras at enzyme. Noong 1986, ang paraan ng reaksyon ng polymerase chain ay makabuluhang napabuti. Iminungkahi na gumamit ng DNA polymerases mula sa thermophilic bacteria. Ang mga enzyme na ito ay napatunayang thermostable at nakayanan ang maraming mga siklo ng reaksyon. Ang kanilang paggamit ay naging posible upang pasimplehin at i-automate ang PCR. Ang isa sa mga unang thermostable DNA polymerases ay nahiwalay sa bakterya Thermus aquaticus at pinangalanan Taq- polymerase. Ang kawalan ng polymerase na ito ay ang posibilidad ng pagpasok ng isang maling nucleotide ay medyo mataas, dahil ang enzyme na ito ay walang mga mekanismo ng pagwawasto ng error (3" → 5" exonuclease na aktibidad). Mga polymerase pfu at Pwo, na nakahiwalay sa archaea, ay may ganoong mekanismo, ang kanilang paggamit ay makabuluhang binabawasan ang bilang ng mga mutasyon sa DNA, ngunit ang bilis ng kanilang trabaho (processivity) ay mas mababa kaysa sa Taq. Kasalukuyang gumagamit ng mga mixtures Taq at pfu upang makamit ang parehong mataas na bilis ng polimerisasyon at mataas na katumpakan ng kopya.

Sa panahon ng pag-imbento ng pamamaraan, si Carey Mullis ay nagtrabaho bilang isang sintetikong chemist (siya ay nag-synthesize ng oligonucleotides, na noon ay ginamit upang makita ang mga point mutations sa pamamagitan ng hybridization na may genomic DNA) sa Cetus Corporation, na nag-patent ng PCR method. Noong 1992, ibinenta ni Cetus ang mga karapatan sa pamamaraan at ang patent na gagamitin Taq polymerase company na Hoffman-La Roche sa halagang $300 milyon. Gayunpaman, ito pala Taq-polymerase ay nailalarawan ng mga biochemist ng Sobyet na sina A. Kaledin, A. Slyusarenko at S. Gorodetsky noong 1980, at 4 na taon din bago ang publikasyong ito ng Sobyet, iyon ay, noong 1976, ng mga biochemist ng Amerikano na sina Alice Chien, David B. Edgar at John M. Trela. Kaugnay nito, sinubukan ng kumpanyang Promega (Promega) sa korte na pilitin si Roche na isuko ang mga eksklusibong karapatan sa enzyme na ito. Ang patent ng Amerika para sa paraan ng PCR ay nag-expire noong Marso 2005.

Pagsasagawa ng PCR

Ang pamamaraan ay batay sa maraming pumipili na pagkopya ng isang tiyak na rehiyon ng DNA sa tulong ng mga enzyme sa ilalim ng mga artipisyal na kondisyon ( sa vitro). Sa kasong ito, tanging ang lugar na nakakatugon sa mga tinukoy na kundisyon ang kinokopya, at kung ito ay nasa sample na pinag-aaralan. Kabaligtaran sa pagpapalakas ng DNA sa mga buhay na organismo (pagtitiklop), ang mga medyo maikling seksyon ng DNA ay pinalaki gamit ang PCR. Sa isang maginoo na proseso ng PCR, ang haba ng mga replicated na rehiyon ng DNA ay hindi hihigit sa 3000 base pairs (3 kbp). Sa tulong ng isang halo ng iba't ibang polymerases, sa paggamit ng mga additives at sa ilalim ng ilang mga kundisyon, ang haba ng PCR fragment ay maaaring umabot sa 20-40 thousand base pairs. Ito ay mas mababa pa kaysa sa haba ng chromosomal DNA ng isang eukaryotic cell. Halimbawa, ang genome ng tao ay humigit-kumulang 3 bilyong base pairs ang haba.

Mga bahagi ng reaksyon

Para sa PCR, sa pinakasimpleng kaso, ang mga sumusunod na bahagi ay kinakailangan:

template ng DNA, na naglalaman ng seksyon ng DNA na kailangang palakihin.
Dalawang panimulang aklat, pantulong sa magkabilang dulo ng iba't ibang hibla ng gustong DNA fragment.
thermostable DNA polymerase ay isang enzyme na catalyzes ang polimerisasyon ng DNA. Ang polymerase para sa paggamit sa PCR ay dapat manatiling aktibo sa mataas na temperatura sa loob ng mahabang panahon, samakatuwid, ang mga enzyme na nakahiwalay sa mga thermophile ay ginagamit - Thermus aquaticus(Taq polymerase), Pyrococcus furiosus(Pfu polymerase), Pyrococcus woesei(Pwo-polymerase) at iba pa.
Mga deoxyribonucleoside triphosphate(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Mg 2+ ions na kailangan para gumana ang polymerase.
solusyon sa buffer, na nagbibigay ng mga kinakailangang kondisyon ng reaksyon - pH, lakas ng ionic ng solusyon. Naglalaman ng mga asing-gamot, bovine serum albumin.

Upang maiwasan ang pagsingaw ng pinaghalong reaksyon, isang mataas na kumukulo na langis, tulad ng vaseline, ay idinagdag sa test tube. Kung gumamit ng heated lid cycler, hindi ito kinakailangan.

Ang pagdaragdag ng pyrophosphatase ay maaaring mapataas ang ani ng reaksyon ng PCR. Ang enzyme na ito ay nag-catalyze sa hydrolysis ng pyrophosphate, isang by-product ng pagdaragdag ng nucleotide triphosphates sa lumalaking DNA strand, sa orthophosphate. Maaaring pigilan ng Pyrophosphate ang reaksyon ng PCR.

Mga panimulang aklat

Ang pagtitiyak ng PCR ay batay sa pagbuo ng mga pantulong na complex sa pagitan ng template at mga primer, maikling synthetic oligonucleotides na 18-30 base ang haba. Ang bawat isa sa mga panimulang aklat ay pantulong sa isa sa mga chain ng double-stranded na template at nililimitahan ang simula at dulo ng amplified na rehiyon.

Pagkatapos ng hybridization ng template na may panimulang aklat (pagsusubo), ang huli ay nagsisilbing panimulang aklat para sa DNA polymerase sa synthesis ng pantulong na strand ng template (tingnan).

Ang pinakamahalagang katangian ng mga primer ay ang melting point (Tm) ng primer-matrix complex.

Ang T m ay ang temperatura kung saan ang kalahati ng mga template ng DNA ay bumubuo ng isang kumplikadong may oligonucleotide primer. Ang average na formula para sa pagkalkula ng T m para sa isang maikling oligonucleotide (at para sa mahabang mga fragment ng DNA), na isinasaalang-alang ang konsentrasyon ng K + ions at DMSO:

kung saan ang L ay ang bilang ng mga nucleotide sa primer, ang K + ay ang molar na konsentrasyon ng mga potassium ions, ang G+C ay ang kabuuan ng lahat ng guanine at cytosines.

Kung ang haba at komposisyon ng nucleotide ng panimulang aklat o ang temperatura ng pagsusubo ay napili nang hindi tama, ang pagbuo ng bahagyang komplementaryong mga kumplikado sa iba pang mga rehiyon ng template ng DNA ay posible, na maaaring humantong sa paglitaw ng mga hindi tiyak na produkto. Ang pinakamataas na limitasyon ng temperatura ng pagkatunaw ay nililimitahan ng pinakamabuting kalagayan na temperatura ng pagkilos ng polymerase, ang aktibidad na bumababa sa mga temperaturang higit sa 80 °C.

Kapag pumipili ng mga panimulang aklat, kanais-nais na sumunod sa mga sumusunod na pamantayan:

amplifier

kanin. isa: PCR cycler

Ang PCR ay isinasagawa sa isang amplifier - isang aparato na nagbibigay ng pana-panahong paglamig at pag-init ng mga test tube, kadalasang may katumpakan ng hindi bababa sa 0.1 ° C. Pinapayagan ka ng mga modernong cyclers na magtakda ng mga kumplikadong programa, kabilang ang posibilidad ng "mainit na pagsisimula", Touchdown PCR (tingnan sa ibaba) at kasunod na pag-imbak ng mga amplified molecule sa 4 °C. Para sa real-time na PCR, ang mga device na nilagyan ng fluorescent detector ay ginawa. Available din ang mga instrumento na may awtomatikong takip at microplate compartment, na nagpapahintulot sa mga ito na maisama sa mga automated system.

Pag-unlad ng reaksyon

Larawan ng isang gel na naglalaman ng marker DNA (una at huling mga puwang) at mga produkto ng PCR

Karaniwan, sa panahon ng PCR, 20-35 cycle ang ginagawa, bawat isa ay binubuo ng tatlong yugto (Larawan 2).

Denaturasyon

Ang double-stranded na template ng DNA ay pinainit sa 94-96°C (o 98°C kung ginagamit ang isang partikular na thermostable polymerase) sa loob ng 0.5-2 min upang pahintulutan ang DNA strands na maghiwalay. Ang yugtong ito ay tinatawag na denaturation dahil ang mga hydrogen bond sa pagitan ng dalawang hibla ng DNA ay nasira. Minsan, bago ang unang cycle (bago idagdag ang polymerase), ang reaction mixture ay pinainit nang 2-3 min upang ganap na ma-denature ang template at mga primer. Ang ganitong paraan ay tinatawag mainit na simula, nagbibigay-daan ito upang bawasan ang dami ng mga di-tiyak na mga produkto ng reaksyon.

Pagsusupil

Kapag ang mga strand ay pinaghiwalay, ang temperatura ay binabaan upang payagan ang mga panimulang aklat na magbigkis sa nag-iisang stranded na template. Ang yugtong ito ay tinatawag na pagsusubo. Ang temperatura ng pagsusubo ay nakasalalay sa komposisyon ng mga panimulang aklat at kadalasang pinipili na katumbas ng temperatura ng pagkatunaw ng mga panimulang aklat. Ang maling pagpili ng temperatura ng pagsusubo ay humahantong sa alinman sa hindi magandang pagbubuklod ng mga panimulang aklat sa template (sa mataas na temperatura) o sa pagbubuklod sa maling lugar at ang hitsura ng mga hindi partikular na produkto (sa mababang temperatura). Ang oras ng yugto ng pagsusubo ay 30 segundo, sa parehong oras, sa panahong ito ang polymerase ay mayroon nang oras upang synthesize ang ilang daang nucleotides. Samakatuwid, inirerekumenda na pumili ng mga panimulang aklat na may punto ng pagkatunaw sa itaas 60 °C at isakatuparan ang pagsusubo at pagpapahaba sa parehong oras, sa 60-72 °C.

Pagpahaba

Ginagaya ng DNA polymerase ang template strand gamit ang primer bilang primer. Ito ang yugto pagpapahaba. Sinisimulan ng polymerase ang synthesis ng pangalawang strand mula sa 3" dulo ng primer na nakagapos sa template at gumagalaw sa template, na nag-synthesize ng bagong strand sa direksyon mula sa 5" hanggang 3" na dulo. 72 ° C. Ang oras ng pagpahaba ay depende sa parehong uri ng DNA polymerase at sa haba ng amplified fragment.Kadalasan, ang oras ng pagpahaba ay kinukuha na isang minuto para sa bawat libong base pairs.Pagkatapos ng lahat ng mga cycle, isang karagdagang hakbang ang madalas na isinasagawa panghuling pagpapahaba upang makumpleto ang lahat ng mga single-stranded na fragment. Ang yugtong ito ay tumatagal ng 7-10 minuto.

kanin. 2: Schematic na representasyon ng unang PCR cycle. (1) Denaturasyon sa 94-96°C. (2) Pagsusupil sa 68°C (halimbawa). (3) Pagpahaba sa 72°C (P=polymerase). (4) Ang unang ikot ay tapos na. Ang dalawang resultang DNA strands ay nagsisilbing template para sa susunod na cycle, kaya ang dami ng template DNA ay dumoble sa bawat cycle.

Ang dami ng partikular na produkto ng reaksyon (nililimitahan ng mga primer) ayon sa teorya ay tumataas sa proporsyon sa 2n - 2n, kung saan ang n ay ang bilang ng mga siklo ng reaksyon. Sa katunayan, ang kahusayan ng bawat cycle ay maaaring mas mababa sa 100%, kaya sa katotohanan P ~ (1+E) n , kung saan ang P ay ang dami ng produkto, E ay ang average na kahusayan ng cycle.

Ang bilang ng mga "mahabang" kopya ng DNA ay lumalaki din, ngunit linearly, kaya isang tiyak na fragment ang nangingibabaw sa mga produkto ng reaksyon.

Ang paglago ng kinakailangang produkto ay exponentially limitado sa pamamagitan ng dami ng reagents, ang pagkakaroon ng inhibitors, at ang pagbuo ng by-products. Sa mga huling cycle ng reaksyon, bumabagal ang paglago, ito ay tinatawag na "plateau effect".

Mga uri ng PCR

Nested PCR(Nested PCR (eng.) ) - ginagamit upang bawasan ang bilang ng mga by-product ng reaksyon. Gumamit ng dalawang pares ng panimulang aklat at magsagawa ng dalawang magkasunod na reaksyon. Ang pangalawang pares ng mga panimulang aklat ay nagpapalaki sa rehiyon ng DNA sa loob ng produkto ng unang reaksyon.
Baliktad na PCR(Inverse PCR (Ingles) ) - ay ginagamit kung isang maliit na lugar lamang sa loob ng nais na pagkakasunud-sunod ang nalalaman. Ang pamamaraang ito ay lalong kapaki-pakinabang kapag kinakailangan upang matukoy ang mga kalapit na pagkakasunud-sunod pagkatapos maipasok ang DNA sa genome. Para sa pagpapatupad ng inverted PCR, isang serye ng mga pagbawas ng DNA na may mga restriction enzymes ay isinasagawa, na sinusundan ng koneksyon ng mga fragment (ligation). Bilang resulta, ang mga kilalang fragment ay nasa magkabilang dulo ng hindi kilalang rehiyon, pagkatapos kung saan maaaring isagawa ang PCR gaya ng dati.
reverse transcription PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR (English) ) - ginagamit upang palakihin, ihiwalay o tukuyin ang isang kilalang sequence mula sa isang RNA library. Bago ang maginoo na PCR, ang isang solong-stranded na molekula ng DNA ay na-synthesize sa mRNA template gamit ang reversetase at isang solong-stranded na cDNA ay nakuha, na ginagamit bilang isang template para sa PCR. Kadalasang tinutukoy ng pamamaraang ito kung saan at kailan ipinahayag ang mga gene na ito.
Asymmetric PCR(Ingles) Asymmetric PCR) - ay isinasagawa kapag kinakailangan upang palakasin ang isa sa mga kadena ng orihinal na DNA. Ginagamit sa ilang sequencing at hybridization analysis techniques. Isinasagawa ang PCR gaya ng dati, maliban na ang isa sa mga panimulang aklat ay kinukuha nang labis. Ang mga pagbabago sa pamamaraang ito ay Ingles. L malapit- A pagkatapos- T siya- E xponential-PCR (LATE-PCR), na gumagamit ng mga primer na may iba't ibang konsentrasyon, at ang mababang konsentrasyon na primer ay pinipili na may mas mataas (melting point) kaysa sa mataas na konsentrasyon ng primer. Ang PCR ay isinasagawa sa isang mataas na temperatura ng pagsusubo, sa gayon ay pinapanatili ang kahusayan ng reaksyon sa lahat ng mga cycle.
Dami ng PCR(Quantitative PCR, Q-PCR) o real time na PCR- ginagamit upang direktang subaybayan ang pagsukat ng dami ng isang partikular na produkto ng PCR sa bawat ikot ng reaksyon. Gumagamit ang pamamaraang ito ng mga primer na may label na fluorescently o DNA probe upang tumpak na sukatin ang dami ng produkto ng reaksyon habang naiipon ito; o ginagamit ang isang fluorescent intercalating dye Sybr Green I na nagbubuklod sa double-stranded na DNA. Sybr Green I nagbibigay ng simple at cost-effective na opsyon para sa real-time na PCR detection at quantification ng mga produkto ng PCR nang hindi nangangailangan ng mga partikular na fluorescent probe o primer. Sa panahon ng amplification, ang dye SYBR Green I sumasama sa minor groove ng DNA ng mga produkto ng PCR at naglalabas ng mas malakas na fluorescent signal kaysa sa unbound dye kapag na-irradiated ng asul na laser. SYBR Green I tugma sa lahat ng kasalukuyang kilalang real-time na mga instrumento ng PCR. Pinakamataas na pagsipsip para sa SYBR Green I ay nasa wavelength na 494 nm. Bilang karagdagan sa pangunahing isa, mayroong dalawang maliit na karagdagang pagsipsip ng maxima sa dye spectrum - sa 290 nm at 380 nm. Pinakamataas na paglabas para sa SYBR Green I ay nasa wavelength na 521 nm (berde).
Hakbang PCR(Touchdown PCR (English) ) - gamit ang diskarteng ito, nababawasan ang impluwensya ng di-tiyak na pagbubuklod ng mga panimulang aklat. Ang mga unang cycle ay isinasagawa sa isang temperatura na mas mataas sa pinakamainam na temperatura ng pagsusubo, pagkatapos bawat ilang mga cycle ang temperatura ng pagsusubo ay unti-unting nababawasan sa pinakamabuting kalagayan. Ito ay upang matiyak na ang panimulang aklat ay mag-hybrid sa komplementaryong strand sa buong haba nito; samantalang sa pinakamainam na temperatura ng pagsusubo, ang primer ay bahagyang nag-hybrid sa komplementaryong strand. Ang bahagyang hybridization ng primer sa genomic DNA ay humahantong sa hindi tiyak na amplification kung mayroong sapat na mga site na nagbubuklod para sa primer. Sa karamihan ng mga kaso, ang unang sampung PCR cycle ay maaaring isagawa sa annealing temperature na 72-75°C, at pagkatapos ay agad na ibababa sa pinakamabuting kalagayan, halimbawa, sa 60-65°C.
Paraan ng molekular na kolonya(PCR sa gel) Colony-PCR Colony) - acrylamide gel ay polymerized sa lahat ng mga bahagi ng PCR sa ibabaw at PCR ay isinasagawa. Sa mga puntong naglalaman ng nasuri na DNA, ang amplification ay nangyayari sa pagbuo ng mga molekular na kolonya.
Ang PCR na may mabilis na paglaki ng cDNA ay nagtatapos(Ingles) Ang mabilis na paglaki ng cDNA ay nagtatapos, RACE-PCR ).
PCR ng mahabang fragment(Ingles) Mahabang hanay ng PCR) - pagbabago ng PCR para sa amplification ng pinahabang mga segment ng DNA (10 libo o higit pang mga base). Ang isang pinaghalong dalawang polymerases ay ginagamit, ang isa ay isang Taq polymerase na may mataas na proseso (iyon ay, may kakayahang mag-synthesize ng isang mahabang DNA chain sa isang pass), at ang pangalawa ay isang DNA polymerase na may 3 "-5" exonuclease na aktibidad, karaniwang Pfu polymerase. Ang pangalawang polymerase ay kinakailangan upang maitama ang mga error na ipinakilala ng una, dahil ang Taq polymerase ay huminto sa synthesis ng DNA kung ang isang hindi komplementaryong nucleotide ay idinagdag. Ang hindi komplementaryong nucleotide na ito ay inalis ng Pfu polymerase. Ang pinaghalong polymerase ay kinukuha sa isang ratio na 50:1 o kahit na mas mababa sa 100:1, kung saan ang Taq polymerase ay kinukuha ng 25-100 beses na higit pa kaugnay ng Pfu polymerase.
RAPD(Ingles) Random na Pagpapalakas ng Polymorphic DNA ), PCR na may random na amplification ng polymorphic DNA - ay ginagamit kapag ito ay kinakailangan upang makilala sa pagitan ng mga organismo na malapit sa genetic sequence, halimbawa, iba't ibang mga varieties ng cultivated halaman, dog breed o malapit na kaugnay na microorganisms. Ang pamamaraang ito ay karaniwang gumagamit ng isang maliit na panimulang aklat (mga 10 bp). Ang panimulang aklat na ito ay bahagyang komplementaryo sa mga random na rehiyon ng DNA ng mga organismong pinag-aaralan. Sa pamamagitan ng pagpili ng mga kondisyon (haba ng panimulang aklat, komposisyon ng panimulang aklat, temperatura, atbp.), posible na makamit ang isang kasiya-siyang pagkakaiba sa pattern ng PCR para sa dalawang organismo.
PCR na partikular sa grupo(Ingles) PCR na tukoy sa pangkat) - PCR para sa mga kaugnay na sequence sa loob ng pareho o sa pagitan ng iba't ibang species gamit ang konserbatibong primer sa mga sequence na ito. Halimbawa, ang pagpili ng mga unibersal na primer para sa ribosomal 18S at 26S mga gene para sa amplification ng isang intergenic spacer na partikular sa species: sequence ng gene 18S at 26S ay konserbatibo sa pagitan ng mga species, kaya ang PCR sa pagitan ng mga gene na ito ay magaganap para sa lahat ng pinag-aralan na species. Ang kabaligtaran ng pamamaraang ito ay - natatanging PCR(Ingles) natatanging PCR), kung saan ang gawain ay pumili ng mga panimulang aklat upang palakihin lamang ang isang tiyak na pagkakasunud-sunod sa mga kaugnay na pagkakasunud-sunod.
PCR gamit ang mainit na simula(Ingles) Mainit na simula ng PCR) - pagbabago ng PCR gamit ang DNA polymerase, kung saan ang aktibidad ng polymerase ay naharang sa temperatura ng silid ng mga antibodies o maliliit na molekula na gumagaya sa mga antibodies tulad ng Affibody, iyon ay, sa oras ng reaksyon bago ang unang denaturation sa PCR. Karaniwan, ang unang denaturation ay isinasagawa sa 95°C sa loob ng 10 minuto.
Virtual PCR(eng. in silico PCR, digital PCR, electronic PCR, e-PCR) - isang mathematical na paraan ng computer analysis ng isang theoretical polymerase chain reaction gamit ang isang listahan ng mga primer sequence (o DNA probes) upang mahulaan ang potensyal na DNA amplification ng pinag-aralan na genome , chromosome, circular DNA o anumang iba pang piraso ng DNA.

Kung ang pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng template ay bahagyang kilala o hindi kilala sa lahat, maaaring gamitin ng isa degenerate primers, ang pagkakasunod-sunod ay naglalaman ng mga degenerate na posisyon, na maaaring maglaman ng anumang mga base. Halimbawa, ang primer sequence ay maaaring: …ATH…, kung saan ang N - A, T o C.

Paglalapat ng PCR

Ginagamit ang PCR sa maraming lugar para sa pagsusuri at sa mga siyentipikong eksperimento.

Kriminalistiko

Ginagamit ang PCR upang ihambing ang tinatawag na "genetic fingerprints". Kailangan ng sample ng genetic material mula sa pinangyarihan ng krimen - dugo, laway, semilya, buhok, atbp. Inihahambing ito sa genetic material ng suspek. Ang isang napakaliit na halaga ng DNA ay sapat, ayon sa teorya - isang kopya. Ang DNA ay pinutol sa mga fragment, pagkatapos ay pinalaki ng PCR. Ang mga fragment ay pinaghihiwalay ng DNA electrophoresis. Ang nagresultang larawan ng pag-aayos ng mga banda ng DNA ay tinatawag genetic fingerprint(Ingles) genetic fingerprint).

Pagtatatag ng pagiging ama

kanin. 3: Mga resulta ng electrophoresis ng mga fragment ng DNA na pinalakas ng PCR. (1) Ama. (2) Bata. (3) Ina. Ang bata ay nagmana ng ilang mga tampok ng genetic imprint ng parehong mga magulang, na nagbigay ng bago, natatanging imprint.

Bagama't ang "genetic fingerprints" ay natatangi (maliban sa kaso ng identical twins), ang mga ugnayan ng pamilya ay maaari pa ring maitatag sa pamamagitan ng paggawa ng ilang mga fingerprint (Larawan 3). Ang parehong paraan ay maaaring ilapat, na may bahagyang pagbabago, upang magtatag ng mga relasyon sa ebolusyon sa mga organismo.

Mga medikal na diagnostic

Ginagawang posible ng PCR na makabuluhang mapabilis at mapadali ang pagsusuri ng mga namamana at viral na sakit. Ang nais na gene ay pinalakas ng PCR gamit ang naaangkop na mga panimulang aklat at pagkatapos ay pinagsunod-sunod upang matukoy ang mga mutasyon. Ang mga impeksyon sa virus ay maaaring matukoy kaagad pagkatapos ng impeksyon, linggo o buwan bago lumitaw ang mga sintomas ng sakit.

Personalized na gamot

Minsan ang mga gamot ay nakakalason o allergenic para sa ilang mga pasyente. Ang mga dahilan para dito ay bahagyang sa mga indibidwal na pagkakaiba sa pagkamaramdamin at metabolismo ng mga gamot at ang kanilang mga derivatives. Ang mga pagkakaibang ito ay tinutukoy sa antas ng genetic. Halimbawa, sa isang pasyente, ang isang tiyak na cytochrome (isang protina sa atay na responsable para sa metabolismo ng mga dayuhang sangkap) ay maaaring maging mas aktibo, sa isa pa - mas mababa. Upang matukoy kung anong uri ng cytochrome ang mayroon ang isang partikular na pasyente, iminumungkahi na magsagawa ng pagsusuri sa PCR bago gamitin ang gamot. Ang pagsusuring ito ay tinatawag na preliminary genotyping. inaasahang genotyping).

Pag-clone ng gene

Ang pag-clone ng gene (hindi dapat ipagkamali sa pag-clone ng mga organismo) ay ang proseso ng paghihiwalay ng mga gene at, bilang resulta ng mga manipulasyon ng genetic engineering, pagkuha ng malaking halaga ng produkto ng isang gene. Ginagamit ang PCR upang palakihin ang gene, na pagkatapos ay ipinasok sa vector- isang fragment ng DNA na naglilipat ng isang dayuhang gene sa pareho o ibang organismo na maginhawa para sa paglaki. Bilang mga vector, halimbawa, ginagamit ang mga plasmid o viral DNA. Ang pagpasok ng mga gene sa isang dayuhang organismo ay karaniwang ginagamit upang makakuha ng isang produkto ng gene na ito - RNA o, kadalasan, isang protina. Sa ganitong paraan, maraming protina ang nakukuha sa dami ng industriya para magamit sa agrikultura, gamot, atbp.

kanin. apat: Gene cloning gamit ang isang plasmid.
(1) Chromosomal DNA ng organismo A. (2) PCR. (3) Maramihang kopya ng gene ng organismo A. (4) Pagpapasok ng gene sa isang plasmid. (5) Plasmid na may gene ng organismo A. (6) Pagpapakilala ng plasmid sa organismo B. (7) Pagpaparami ng kopyang numero ng gene ng organismo A sa organismo B.

DNA sequencing

Sa paraan ng pagkakasunud-sunod gamit ang dideoxynucleotides na may label na fluorescent na label o isang radioactive isotope, ang PCR ay isang mahalagang bahagi, dahil sa panahon ng polymerization na ang mga derivatives ng nucleotides na may label na fluorescent o radioactive na label ay ipinasok sa DNA chain. Ang pagdaragdag ng isang dideoxynucleotide sa synthesized strand ay nagtatapos sa synthesis, na nagpapahintulot sa posisyon ng mga tiyak na nucleotide na matukoy pagkatapos ng paghihiwalay sa gel.

Mutagenesis

Sa kasalukuyan, ang PCR ay naging pangunahing paraan para sa pagsasagawa ng mutagenesis (ipinapakilala ang mga pagbabago sa nucleotide sequence ng DNA). Ang paggamit ng PCR ay naging posible upang pasimplehin at pabilisin ang pamamaraan ng mutagenesis, gayundin upang gawin itong mas maaasahan at muling gawin.

S.V. Pospelova, M.V. Kuznetsova

polymerase chain reaction

S.V. Pospelova– Kandid. honey. Sciences, Associate Professor, Department of Microbiology, Virology at Immunology, M.V. Kuznetsova– Kandid. biol. Sci., empleyado ng IEGM UB RAS

Pospelova, S.V.

Idinisenyo para sa independiyenteng gawain ng mga mag-aaral ng lahat ng faculty: medikal, pediatric, medikal at preventive, dental at faculty ng mas mataas na edukasyon sa pag-aalaga (FVSO) ng Medical Academy.

Tagasuri:

ulo Kagawaran ng Biology, Ekolohiya at Medikal na Genetika, PSMA, Propesor A.B. Vinogradov

Naka-print sa pamamagitan ng desisyon ng central coordinating
methodological council ng GOU VPO PGMA
sila. ak. E.A. Wagner Roszdrav

UDC 616-078.33

Polymerase chain reaction sa klinikal na kasanayan
microbiological diagnostics

Matagumpay na ginagamit ng modernong gamot ang mga nakamit ng mga natural na agham, masinsinang naglalapat ng mga bagong teknolohiya para sa pagsusuri at paggamot ng mga sakit. Kamakailan lamang, ang mga bagong pamamaraan batay sa paggamit ng mga molecular genetic na teknolohiya ay idinagdag sa tradisyonal na microbiological at immunological na pamamaraan para sa pagsusuri sa laboratoryo ng mga nakakahawang sakit. Ang paggamit ng mga pamamaraang ito hindi lamang para sa mga layuning pang-agham, kundi pati na rin sa mga praktikal na diagnostic ng laboratoryo ay naging posible sa isang malaking lawak dahil sa paglikha noong kalagitnaan ng 80s ng proseso ng artipisyal na maramihang pagkopya ng DNA at ang karagdagang mabilis na pag-unlad ng teknolohiyang ito, kasalukuyang kilala bilang polymerase chain reaction(PCR). Sa mas mababa sa 15 taon ng pagkakaroon nito, ginawa ng PCR na regular na pag-aralan ang mga tiyak na pagkakasunud-sunod ng DNA ng maraming pathogens. Ang versatility, mataas na sensitivity, at relatibong kadalian ng pagpapatupad ay ginawa ang paraan ng PCR na kailangang-kailangan para sa paglutas ng iba't ibang mga problema ng mga klinikal na diagnostic, tulad ng direktang pagtuklas at pagkilala sa mga pathogen, molecular typing at pag-aaral ng mga katangian ng pathogenic microorganisms, pagsusuri ng mga mutasyon na nauugnay sa genetic. sakit sa mga tao, at pagkakakilanlan ng isang tao.

Ano ang PCR?

polymerase chain reaction(PCR) - isang artipisyal na proseso ng paulit-ulit na pagkopya (amplifications) isang tiyak na pagkakasunud-sunod ng DNA na isinagawa sa vitro(Larawan 1). Ang pagkopya ng DNA sa panahon ng PCR ay isinasagawa ng isang espesyal na enzyme - DNA polymerase, tulad ng sa mga selula ng mga buhay na organismo. Ang DNA polymerase, na gumagalaw sa isang solong DNA strand (matrix), ay nag-synthesize ng komplementaryong DNA sequence nito. Mahalaga na ang DNA polymerase ay hindi makapagsimula sa synthesis ng isang DNA chain "mula sa simula", kailangan nito ng isang maikling "seed" chain ng RNA o DNA, kung saan maaari itong magsimulang magdagdag ng mga nucleotide. Ang pangunahing prinsipyo ng PCR ay ang polymerization reaction (ang synthesis ng isang DNA polymer chain mula sa monomeric nucleotide units) ay pinasimulan ng espesipikong mga panimulang aklat(maiikling fragment ng "binhi" na DNA) sa bawat isa sa maraming paulit-ulit na mga cycle. Ang pagiging tiyak ng PCR ay tinutukoy ng kakayahan ng mga primer na "kilalanin" ang isang mahigpit na tinukoy na rehiyon ng DNA at itali ito ayon sa prinsipyo ng molekular. complementarity.

Sa isang maginoo na reaksyon ng PCR, isang pares ng mga panimulang aklat ang ginagamit na "nililimitahan" ang pinalakas na rehiyon sa magkabilang panig sa pamamagitan ng pagbubuklod sa magkasalungat na mga hibla ng template ng DNA. Upang ma-multiply ang bilang ng mga kopya ng orihinal na DNA, kailangan ang isang paikot na reaksyon. Bilang isang patakaran, ang bawat isa sa sunud-sunod na paulit-ulit na mga siklo ng PCR ay binubuo ng tatlong yugto:

1)denaturation, o "pagtunaw" ng double-stranded na DNA: bago magsimula ang reaksyon, ang target na DNA ay double-stranded, sa temperatura na 94-95 0 C, ang mga pantulong na DNA strands ay magkakaiba - pumasa sila sa isang single-stranded na estado;

2) nagbubuklod (pagsusubo) mga panimulang aklat: sa pinakamainam na temperatura para sa mga napiling panimulang aklat, nagbubuklod sila sa pantulong na rehiyon ng template ng DNA;

3)pagpahaba, o pagpapahaba ng chain: Ang DNA polymerase ay nagdaragdag ng mga nucleotide sa mga primer, na nagsi-synthesize ng mga bagong DNA strand na nagiging mga target para sa mga primer sa kasunod na mga PCR cycle.

Ang pagbabago ng mga yugto ng bawat cycle ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagbabago ng temperatura ng pinaghalong reaksyon (tingnan ang Fig. 1).

kanin. 1. Mga pangunahing hakbang ng PCR cycle

Sa una, ang mga panimulang aklat ay maaari lamang magbigkis sa isang tiyak na pagkakasunud-sunod ng orihinal na DNA, ngunit sa mga kasunod na mga pag-ikot ay nagbubuklod sila sa mga kopya ng pagkakasunud-sunod na ito na na-synthesize sa mga nakaraang cycle. Sa kasong ito, ang dami ng pangunahing produkto ng PCR (isang kopya ng DNA sequence na limitado ng mga primer) ay theoretically doble sa bawat cycle. Kung sa paunang cycle ay mayroon lamang isang target na DNA sa materyal na pinag-aaralan, pagkatapos ng unang cycle ay magkakaroon na ng dalawang kopya, pagkatapos ng dalawang cycle - 4 na kopya, ang resulta ng ikatlong cycle ay magiging 8 kopya, at ang tatlumpung- ikalima - mayroon nang 68 bilyong kopya (Larawan 2).

kanin. 2. Proseso ng Maramihang Pagkopya
Target na DNA sa panahon ng sunud-sunod
pagbabago ng mga cycle

Ang pangunahing paraan ng pagsusuri ng mga produkto ng reaksyon, na tradisyonal na ginagamit sa maraming mga laboratoryo upang makita ang amplified DNA at matukoy ang laki nito, ay ang pamamaraan. gel electrophoresis na sinusundan ng paglamlam ng isang DNA-specific na tina, tulad ng ethidium bromide (Larawan 3).

Control - iba't ibang mga fragment ng DNA na may kilalang bilang ng kanilang mga constituent nucleotides. Ito ay kilala na ang distansya sa pagitan ng iba't ibang mga fragment ay may logarithmic dependence sa kanilang laki at masa. Linya 1 - Nakita ang mga fragment ng PCR na humigit-kumulang 1850 base. Ang linya 2 at 4 ay mga fragment na halos 800 base ang haba.

kanin. 3. Pagsusuri ng mga produkto ng reaksyon sa pamamagitan ng pamamaraan
gel electrophoresis

Linya 3 - ang nais na mga fragment ay hindi nakita, isang negatibong resulta ng reaksyon. Linya 5 - maraming linya ang nabuo dahil ang mga panimulang aklat ay komplementaryo sa ilang mga fragment ng DNA na may iba't ibang haba: mga 550, 800 at 1500 na base.

Pagpapabuti ng teknolohiya ng PCR

Sa una, ang mga maginoo na polymerase ng DNA ay ginamit upang magsagawa ng PCR, na sumailalim sa hindi aktibo na temperatura sa bawat cycle sa yugto ng denaturation ng DNA. Ang polymerase ay kailangang paulit-ulit na idagdag sa pinaghalong reaksyon, na sa halip ay matrabaho at hindi pinapayagan ang pag-automate ng proseso.

Gumagamit ang reaksyon thermostable Mga polymerase ng DNA na lumalaban sa mataas na temperatura sa lahat ng yugto ng cycle ng PCR sa ilang sampu-sampung cycle. Ang bilang ng mga thermostable DNA polymerases na magagamit sa komersyo, na naiiba sa ilan sa kanilang mga katangian, ay medyo malaki. Pinaka karaniwang ginagamit Taq polymerase, orihinal na nakahiwalay sa isang thermophilic microorganism Thermus aquaticus. Ang iba pang mga polymerase ay mas karaniwang ginagamit para sa mga partikular na aplikasyon ng PCR. Ang mga modernong komersyal na paghahanda ng mga thermostable polymerases ay nagbibigay, bilang panuntunan, ng matatag na aktibidad na maaaring kopyahin, na nagpapahintulot sa paggamit ng teknolohiya ng PCR sa karaniwang kasanayan sa laboratoryo.

Ang teknikal na disenyo ng pagbabago ng temperatura ng pinaghalong reaksyon ay mabilis ding nabuo sa mga nakaraang taon. Una, isinagawa ang PCR gamit ang tatlong water bath na nakatakda sa iba't ibang temperatura: para sa DNA denaturation, primer annealing, at polymerization. Ang mga test tube ay inilipat mula sa isang paliguan ng tubig patungo sa isa pang "sa isang bilog", dahil sa kung saan nagkaroon ng pagbabago sa temperatura sa iba't ibang yugto ng cycle. Mayroon ding mga bersyon ng mga aparato, kung saan ang tubig ng iba't ibang temperatura ay halili na ibinibigay sa paliguan ng tubig, kung saan matatagpuan ang mga test tube na may pinaghalong reaksyon. Ang pagpapalit ng mga cycle sa mga kasong ito ay tumagal ng mahabang panahon, at ang proseso ay mahirap i-automate. Para sa pagpapatupad ng PCR, pangunahing ginagamit ang mga instrumento (mga thermal cyclers), na awtomatikong nagbabago ng temperatura batay sa nakatakdang programa. Sa mga thermal cyclers, ang mga test tube na may pinaghalong reaksyon ay inilalagay sa isang metal block, ang temperatura kung saan nagbabago sa isang mataas na rate, na binabawasan ang tagal ng bawat PCR cycle.

Ang mga modernong thermal cyclers ay iniangkop upang gumamit ng mga espesyal na manipis na pader na plastik na mga test tube para sa pinaghalong reaksyon, na ginagawang posible upang mapabilis ang pagpapalitan ng init sa pagitan ng bloke ng aparato at ang pinaghalong reaksyon at, sa huli, higit pang bawasan ang oras ng reaksyon.

Kaya, ang isang karaniwang PCR ay maaaring isagawa sa loob ng 1-3 na oras.

Kaayon ng pagpapabuti ng teknolohiya ng PCR, binuo din ang mga pamamaraan para sa pagsusuri ng mga produkto ng reaksyon. Pamamaraan gel electrophoresis na sinusundan ng paglamlam ng isang DNA-specific na tina, tulad ng ethidium bromide, ay tradisyonal na ginagamit sa maraming laboratoryo upang makita ang amplified DNA at matukoy ang laki nito. Paggamit hybridization na may panloob na DNA probes ay nagbibigay-daan sa ilang mga kaso na makabuluhang taasan ang sensitivity at specificity ng pagtuklas ng mga produkto ng PCR. Dahil sa kawalan ng pangangailangan na maghanda at magsagawa ng electrophoretic separation, ang posibilidad ng automation para sa pagsusuri ng isang malaking bilang ng mga sample, at ang paggamit ng isang non-radioactive detection format, ang pamamaraang ito ay nagiging mas karaniwan. Sa ilang mga kaso, ang paggamit ng mga espesyal na fluorescent na "marker" ay nagpapahintulot sa iyo na kontrolin ang pagsasagawa ng amplification o ang pagtuklas ng mga produkto ng pagtatapos ng PCR nang direkta sa tubo ng reaksyon.

Gamit ang PCR
sa medikal na mikrobiyolohiya

Kabilang sa maraming iba't ibang mga lugar ng mga klinikal na diagnostic, ang medikal na microbiology ay sumasakop marahil sa nangungunang posisyon sa mga tuntunin ng bilang at iba't ibang mga aplikasyon gamit ang teknolohiya ng PCR. Ang pagpapakilala ng pamamaraang ito sa pagsasanay, kasama ang serological diagnostics, ay makabuluhang pinalawak ang mga posibilidad ng modernong clinical microbiology, na batay pa rin sa mga pamamaraan para sa paghihiwalay at paglinang ng mga microorganism sa artipisyal na nutrient media o sa cell culture.

Mga pagkakataon at limitasyon ng tradisyonal
pamamaraan ng paglilinang

Tradisyonal para sa mga microbiological laboratories, ang kultural na pamamaraan ng mga diagnostic, bilang panuntunan, ay nagbibigay-katwiran sa sarili nito para sa pagtuklas at pag-aaral ng mga katangian tulad ng pagiging sensitibo sa antibiotics, virulence ng madaling nilinang microorganisms. Gayunpaman, ang ilang mga microorganism (pneumococcus, hemophilus, neisseria, mycoplasma, obligate anaerobes, atbp.) ay maaaring maging lubhang sensitibo sa mga kondisyon ng klinikal na materyal sampling, transportasyon at paglilinang, ang pagkakaroon ng mga espesyal na kadahilanan ng paglago o may kakayahang magparami. sa vitro lamang sa cell culture (mga virus, chlamydia, rickettsiae).

Ang mabagal na paglaki sa artipisyal na media ng mga microorganism tulad ng mycobacteria at fungi ay isa pang natural na limitasyon na nauugnay sa paggamit ng isang pamamaraan ng kultura para sa diagnosis ng mga microorganism na ito. Bilang karagdagan, ang pakikipagtulungan sa mga live na kultura ng mga nakahiwalay na pathogen, hindi lamang lalo na mapanganib, ngunit kung minsan ay mga oportunistikong pathogen, ay maaaring magdulot ng banta sa kalusugan ng mga tauhan ng laboratoryo.

Kabilang sa mga causative agent ng mga sakit ng tao, ang hindi nalilinang na mga species ng bakterya ay kilala rin, halimbawa Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, at maraming uri ng mga virus, kabilang ang mga human papillomavirus at hepatitis C, ay sumusubok na lumaki na sa kultura ng cell hanggang ngayon ay nanatiling hindi matagumpay. Sa wakas, kahit na may matagumpay na paglilinang, may pangangailangan para sa kasunod na pagkakakilanlan ng mga nakahiwalay na microorganism.

Ang mga tradisyunal na pamamaraan ng microbiological identification ay batay sa paggamit ng iba't ibang phenotypic na pagsubok, tulad ng pagtuklas ng partikular na aktibidad ng enzymatic, ang kakayahang mag-metabolize ng mga asukal, o suportahan ang paglaki sa media na may mga piling additives. Ang kahirapan sa pag-standardize ng mga kundisyon ng naturang mga pagsubok, pati na rin ang natural na phenotypic variability na likas sa maraming microorganism, ay maaaring maging sanhi ng maling pagkilala.

Paggamit ng PCR para sa Direktang Diagnosis
at pagkakakilanlan ng mga pathogens
Nakakahawang sakit

Sa mga kaso kung saan ang paggamit ng mga pamamaraan ng kultura ay may problema o nauugnay sa hindi sapat na diagnostic na kahusayan, ang posibilidad ng pagpapalit ng biological amplification (i.e. paglaki sa artipisyal na media) ng enzymatic na pagdodoble ng mga nucleic acid sa vitro na may ang paggamit ng PCR ay partikular na kaakit-akit. Mayroong iba't ibang mga diskarte sa paggamit ng PCR para sa pagsusuri ng mga nakakahawang ahente. Ang pinakakaraniwang uri ng PCR (tiyak na PCR) nagsasangkot ng paggamit ng mga panimulang aklat na pantulong tiyak na pagkakasunod-sunod Katangian ng DNA ng isang mahigpit na tinukoy na uri ng mikroorganismo. Halimbawa, ang PCR amplification ng isang partikular na rehiyon ng gene na nag-encode ng major outer membrane protein (MOMP) Chlamydia trachomatis, sa kumbinasyon ng non-radioactive hybridization para sa pagtuklas ng mga produkto ng reaksyon, ginagawang posible na makita ang mga solong kopya ng chlamydial DNA sa mga pinag-aralan na sample. Kasabay nito, ang PCR ay higit na nakahihigit sa diagnostic na kahusayan sa paglilinang at mga pamamaraan ng direktang pagtuklas ng chlamydial antigen (microimmunofluorescence at enzyme immunoassay), na tradisyonal na ginagamit upang makita ang C. trachomatis.

Mayroon ding posibilidad na gumamit ng ilang pares ng mga primer na partikular sa species nang sabay-sabay sa isang tubo ng reaksyon para sa sabay-sabay na pagpapalakas ng DNA ng iba't ibang mga pathogen. Ang pagbabagong ito ay tinatawag na multiple PCR. (multiplex PCR). Maaaring gamitin ang maramihang PCR upang matukoy ang etiological na papel ng iba't ibang microorganism na nagdudulot ng ilang uri ng sakit. Halimbawa, ang mga opsyon para sa paggamit ng maramihang PCR para sa sabay-sabay na pagtuklas ng dalawa (C. trachomatis at N. gonorrhoeae na may mga sakit ng urogenital tract) o kahit na apat na pathogens (I. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis at A. otitidis na may talamak na suppurative otitis).

Ang isang alternatibong diskarte sa mga diagnostic ng PCR ay nauugnay sa paggamit ng mga unibersal na primer na nagbibigay-daan sa pagpapalakas ng mga fragment ng gene na naroroon sa lahat ng mga microorganism ng isang partikular na pangkat ng taxonomic. Ang bilang ng mga species na maaaring makilala gamit ang pamamaraang ito ay maaaring limitado sa parehong balangkas ng mga maliliit na sistematikong grupo (genus, pamilya) at malalaking taxa sa antas ng pagkakasunud-sunod, klase, uri. Sa huling kaso, ang target para sa PCR ay kadalasang ribosomal genes (16S at 23S rRNA), na may katulad na istraktura sa iba't ibang prokaryotic microorganism.

Ang paggamit ng mga panimulang aklat na pantulong sa mga conserved na rehiyon ng mga gene na ito ay ginagawang posible na palakihin ang DNA ng karamihan sa mga bacterial species. Ang mga resultang PCR ribosomal gene fragment ay maaaring masuri gamit ang iba't ibang mga pamamaraan ng laboratoryo upang makilala ang bakterya kung saan sila nabibilang. Ang pinakatumpak na paraan ng "molecular" identification ay upang matukoy ang kumpletong nucleotide sequence (sequencing) ng amplified DNA at ihambing ito sa mga kaukulang sequence ng mga kilalang species.

Sa kabila ng pagkakaroon ng mga automated system na gumagamit ng inilarawang prinsipyo ng pagkakakilanlan, ang mas kaunting oras at mamahaling pamamaraan ay kadalasang ginagamit sa pagsasanay, na, gayunpaman, ay nagpapahintulot sa ilang mga pagkakaiba sa pagkakasunud-sunod ng mga fragment ng DNA na mapagkakatiwalaang matukoy. Ang pinakakaraniwan ay mga pamamaraan batay sa pagsusuri ng lokasyon sa DNA ng mga cleavage site sa pamamagitan ng mga restriction enzymes (paraan ng RFLP - polymorphism haba ng fragment ng paghihigpit), o sa pagpapasiya ng electrophoretic mobility ng DNA sa single-stranded form (SSCP-method single strand conformational polymorphism).

Ang PCR gamit ang mga unibersal na panimulang aklat ay maaaring magamit kapwa upang tukuyin ang mga microorganism na nakahiwalay sa purong kultura at upang direktang masuri ang isang malawak na hanay ng mga pathogen nang direkta sa mga klinikal na sample. Dapat tandaan, gayunpaman, na ang sensitivity ng "broad-spectrum" PCR ay karaniwang mas mababa kaysa sa "species-specific" na mga sistema ng pagsubok. Bilang karagdagan, ang PCR na may mga unibersal na panimulang aklat ay kadalasang hindi ginagamit upang pag-aralan ang mga sample na maaaring naglalaman ng malaking bilang ng iba't ibang microorganism, dahil sa kahirapan sa pagsusuri ng mga produkto ng reaksyon na nakuha sa pamamagitan ng pagpapalakas ng DNA ng iba't ibang species.

Mga paraan ng pag-type ng molekular
mga mikroorganismo batay sa PCR

Ang PCR ay malawakang ginagamit hindi lamang para sa diagnosis at pagkilala, kundi pati na rin para sa mga subspecies na pag-type at pagsusuri ng genetic na relasyon (clonality) ng mga nakahiwalay na strain ng mga microorganism, lalo na kapag nagsasagawa ng epidemiological studies. Kung ikukumpara sa mga tradisyunal na pamamaraan ng phenotypic (bio-, phage- at serotyping), ang genotyping na nakabase sa PCR ay nailalarawan sa pamamagitan ng versatility, isang mas malalim na antas ng pagkita ng kaibahan, ang posibilidad ng paggamit ng mga quantitative na pamamaraan upang masuri ang pagkakakilanlan ng mga strain, at mataas na reproducibility. Maraming mga pamamaraan ng genotyping ang inilarawan na maaaring ituring na mga derivatives ng teknolohiya ng PCR.

Sa kabila ng iba't ibang mga paraan ng pag-type ng PCR, ang karaniwang bagay para sa karamihan sa kanila ay ang paggamit ng gel electrophoresis upang paghiwalayin ang mga fragment ng DNA na may iba't ibang haba na nakuha mula sa bawat indibidwal na strain. Kasabay nito, ang isang comparative analysis ng mga indibidwal na electrophoretic profile, na isinasagawa nang biswal o gamit ang isang computer, ay ginagawang posible upang masuri ang antas ng genetic na relasyon ng mga pinag-aralan na mga strain.

Ang paggamit ng PCR para sa pagtuklas ng droga
paglaban sa mga mikroorganismo

Kamakailan lamang, ang PCR ay lalong ginagamit upang pag-aralan ang iba't ibang mga katangian ng mga pathogenic microorganism, sa partikular, upang matukoy ang paglaban ng ilang mga uri ng pathogens sa ilang mga gamot. Bilang isang patakaran, ang paggamit ng PCR upang matukoy ang sensitivity ng mga microorganism ay angkop lamang sa mga kaso kung saan ang mga tradisyonal na phenotypic na pamamaraan ay hindi naaangkop o hindi sapat na epektibo. Halimbawa, ang kahulugan ng sensitivity Mycobacterium tuberculosis sa mga gamot na anti-tuberculosis gamit ang mga pamamaraan ng kultura ay karaniwang tumatagal ng 4 hanggang 8 na linggo. Bilang karagdagan, ang mga resulta ng mga phenotypic na pagsubok sa mga ganitong kaso ay maaaring masira dahil sa pagbaba sa aktibidad ng mga antimicrobial sa panahon ng pangmatagalang paglilinang ng mga microorganism. Pag-aaral ng mga molekular na mekanismo ng paglaban sa droga M. tuberkulosis at ilang iba pang mga pathogens ay pinahintulutan ang pagbuo ng mga pamamaraan na nakabatay sa PCR para sa mabilis na pagtuklas ng mga genetic marker ng paglaban.

Para sa naturang pagsusuri, kadalasang ginagamit ang DNA o RNA ng pathogen na nakahiwalay sa purong kultura. Gayunpaman, sa ilang mga kaso mayroong posibilidad ng direktang pagsusuri ng PCR para sa paglaban sa antibiotic nang walang paunang paglilinang ng pathogen. Ang pinag-aralan na sample ng klinikal na materyal ay ginagamit bilang pinagmumulan ng target na DNA para sa PCR, at ang kinopyang produkto ng PCR ay sinusuri upang makita ang mga mutasyon na nauugnay sa paglaban sa antibiotic. Halimbawa, ang isang paraan ay binuo na nagbibigay-daan sa paggamit ng PCR upang makita sa mga pasyente na dumaranas ng tuberculous meningitis ang paglaban ng pathogen sa rifampicin.

Gayunpaman, mayroong mga likas na limitasyon sa paggamit ng mga genetic na pamamaraan para sa pagtatasa ng paglaban sa gamot ng mga microorganism:

Maaaring hindi magagamit ang data sa mga partikular na genetic na mekanismo ng paglaban;

Ang paglaban sa ilang mga gamot ay madalas na nauugnay sa iba't ibang mga mekanismo at mutasyon sa iba't ibang mga gene na nakapag-iisa na nakakaimpluwensya sa phenotype.

Halimbawa, ang paglaban ng Gram-negative bacteria sa aminoglycoside antibiotic ay maaaring sanhi ng paggawa ng iba't ibang aminoglycoside-modifying enzymes o ng mga pagbabago sa cell wall permeability. Sa kasong ito, ang mga resulta ng pagsusuri ng PCR, na palaging nagpapakilala sa isang mahigpit na tinukoy na tiyak na rehiyon ng DNA, ay hindi maaaring magsilbing batayan para sa pagtatasa ng sensitivity ng microorganism sa kabuuan.

Bilang karagdagan, ang kakulangan ng mga internasyonal na pamantayan at rekomendasyon para sa paggamit ng PCR upang matukoy ang pagiging sensitibo sa mga antimicrobial na gamot ay isang karagdagang kadahilanan na naglilimita sa posibilidad ng isang malawak na aplikasyon ng diskarteng ito sa mga praktikal na diagnostic.

Kamakailan lamang, isang maaasahan, lubos na sensitibo at mabilis na pamamaraan para sa pag-diagnose ng iba't ibang mga nakakahawang sakit ng tao ay binuo. Ang pamamaraang ito ay tinatawag na "PCR analysis". Ano ito, ano ang kakanyahan nito, kung anong mga mikroorganismo ang maihahayag nito at kung paano dalhin ito nang tama, sasabihin namin sa aming artikulo.

Kasaysayan ng pagtuklas

Gayundin, ang mga pamamaraan ng PCR ay ginagamit sa pagsusuri ng kanser.

Mga kalamangan ng pamamaraan

Ang mga diagnostic ng PCR ay may ilang mga pakinabang:

Mataas na sensitivity. Kahit na sa pagkakaroon lamang ng ilang mga molekula ng microorganism DNA, tinutukoy ng pagsusuri ng PCR ang pagkakaroon ng impeksyon. Ang pamamaraan ay makakatulong sa mga talamak at latently na nagaganap na mga sakit. Kadalasan sa ganitong mga kaso, ang microorganism ay kung hindi man ay hindi kultura.
Ang anumang materyal ay angkop para sa pananaliksik, halimbawa, laway, dugo, genital secretions, buhok, epithelial cells. Ang pinakakaraniwan ay isang pagsusuri sa dugo at isang urogenital smear para sa PCR.
Ang pangmatagalang pagtatanim ng mga pananim ay hindi kinakailangan. Pinapayagan ka ng awtomatikong proseso ng diagnostic na makuha ang mga resulta ng pag-aaral pagkatapos ng 4-5 na oras.
Ang pamamaraan ay halos 100% maaasahan. Tanging mga nakahiwalay na kaso ng mga false-negative na resulta ang naitala.
Posibilidad na makilala ang ilang uri ng pathogens mula sa isang sample ng materyal. Ito ay hindi lamang nagpapabilis sa proseso ng pag-diagnose ng sakit, ngunit makabuluhang binabawasan ang mga gastos sa materyal. Kadalasan ang doktor ay nagrereseta ng isang komprehensibong pagsusuri sa PCR. Ang presyo ng pagsusuri, na binubuo ng pagpapasiya ng anim na pathogens, ay humigit-kumulang 1,500 rubles.

Upang ang mga resulta ay maging maaasahan sa panahon ng pag-aaral ng PCR, kinakailangan na ipasa ang pagsusuri, kasunod ng mga rekomendasyon para sa paunang paghahanda para sa pagsusuri:

Bago mag-donate ng laway, dapat mong pigilin ang pagkain at pag-inom ng mga gamot 4 na oras bago kunin ang materyal. Kaagad bago ang pamamaraan, banlawan ang iyong bibig ng pinakuluang tubig.
Ang mga tuntunin sa itaas ay dapat ding sundin kapag kumukuha ng sample mula sa panloob na ibabaw ng pisngi. Pagkatapos ng banlawan, inirerekumenda na magsagawa ng isang magaan na masahe sa balat upang i-highlight ang lihim ng glandula.
Karaniwang kinokolekta ang ihi sa bahay. Upang gawin ito, kailangan mong magsagawa ng masusing toilet ng mga maselang bahagi ng katawan. Kolektahin ang 50-60 ML ng ihi sa isang sterile plastic container. Upang matiyak ang kadalisayan ng materyal, inirerekomenda para sa mga kababaihan na magpasok ng isang tampon sa puki, at para sa mga lalaki na hilahin ang fold ng balat hangga't maaari. Hindi mo maaaring kunin ang materyal sa panahon ng daloy ng regla.
Upang mag-abuloy ng tamud, dapat mong iwasan ang pakikipagtalik sa loob ng 3 araw bago kolektahin ang materyal. Pinapayuhan din ng mga doktor na huwag bumisita sa sauna at maligo ng mainit, uminom ng alak at maanghang na pagkain. 3 oras bago ang pagsusuri, kailangan mong pigilin ang pag-ihi.
Para sa paghahatid, halimbawa, kung ang isang PCR test ay ginawa para sa chlamydia, parehong babae at lalaki ay inirerekomenda na magkaroon ng sekswal na pahinga sa loob ng 3 araw. Ang mga antibacterial na gamot ay hindi dapat inumin 2 linggo bago ang pagsusuri. Para sa isang linggo, kailangan mong ihinto ang paggamit ng mga intimate gels, ointment, vaginal suppositories, douching. 3 oras bago ang pagsusuri, dapat mong pigilin ang pag-ihi. Sa panahon ng regla, ang sampling ng materyal ay hindi isinasagawa, 3 araw lamang pagkatapos ng pagtigil ng paglabas ng dugo, maaari kang kumuha ng urogenital smear.

PCR sa panahon ng pagbubuntis

Habang naghihintay ng isang sanggol, maraming mga impeksiyon na nakukuha sa pakikipagtalik ay lubhang mapanganib para sa normal na pag-unlad ng fetus. Ang mga STD ay maaaring makapukaw ng intrauterine growth retardation, miscarriage o premature birth, congenital malformations ng bata. Samakatuwid, napakahalaga na sumailalim sa pagsusuri sa PCR sa maagang pagbubuntis. Kinakailangang ipasa ang pagsusuri kapag nagrerehistro - hanggang 12 linggo.

Ang materyal ay kinuha mula sa cervical canal gamit ang isang espesyal na brush. Ang pamamaraan ay walang sakit at hindi nagdudulot ng panganib sa sanggol. Karaniwan sa panahon ng pagbubuntis, ang isang pagsusuri ay isinasagawa para sa chlamydia sa pamamagitan ng paraan ng PCR, pati na rin para sa ureaplasmosis, mycoplasmosis, cytomegalovirus, herpes, papillomavirus. Ang ganitong kumplikadong mga pagsusuri ay tinatawag na PCR-6.

PCR para sa diagnosis ng HIV

Dahil sa ang katunayan na ang pamamaraan ay napaka-sensitibo sa mga pagbabago sa katawan at ang mga kondisyon ng diagnosis, maraming mga kadahilanan ang maaaring makaapekto sa resulta. Samakatuwid, ang pagsusuri ng PCR para sa impeksyon sa HIV ay hindi isang maaasahang paraan, ang kahusayan nito ay 96-98%. Sa natitirang 2-4% ng mga kaso, ang pagsusuri ay nagbibigay ng mga maling positibong resulta.

Ngunit sa ilang mga sitwasyon, hindi magagawa ng isang tao nang walang PCR diagnostics ng HIV. Karaniwan itong ibinibigay sa mga taong may false-negative na resulta ng ELISA. Ang ganitong mga tagapagpahiwatig ay nagpapahiwatig na ang isang tao ay hindi pa nakakabuo ng mga antibodies sa virus at hindi sila maaaring makita nang walang maraming pagtaas sa bilang. Ito ay eksakto kung ano ang maaaring makamit sa pamamagitan ng pagsasagawa ng pagsusuri sa dugo gamit ang paraan ng PCR.

Ang ganitong mga diagnostic ay kinakailangan din para sa mga bata sa unang taon ng buhay na ipinanganak mula sa isang ina na may HIV. Ang pamamaraan ay ang tanging paraan upang mapagkakatiwalaang matukoy ang katayuan ng isang bata.

PCR para sa diagnosis ng hepatitis

Ginagawang posible ng polymerase chain reaction na paraan upang matukoy ang DNA ng hepatitis A, B, C virus bago pa ang pagbuo ng mga antibodies sa impeksyon o ang simula ng mga sintomas ng sakit. Ang pagsusuri ng PCR para sa hepatitis C ay lalong epektibo, dahil sa 85% ng mga kaso ang sakit na ito ay asymptomatic at, nang walang napapanahong paggamot, ay pumasa sa talamak na yugto.

Ang napapanahong pagtuklas ng pathogen ay makakatulong upang maiwasan ang mga komplikasyon at pangmatagalang paggamot.

Komprehensibong pagsusuri sa PCR

Comprehensive PCR analysis: pagsusuri sa pamamagitan ng polymeric chain reaction method, na kinabibilangan ng pagtukoy ng ilang uri ng impeksyon nang sabay-sabay: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, cytomegalovirus, herpes type 1 at 2, gonorrhea, papillomavirus. Ang presyo ng naturang mga diagnostic ay mula 2000 hanggang 3500 rubles. depende sa klinika, mga materyales at kagamitan na ginamit, pati na rin sa uri ng pagsusuri: husay o dami. Ano ang kinakailangan sa iyong kaso - ang doktor ang magpapasya. Sa ilang mga kaso, sapat na upang matukoy ang pagkakaroon ng pathogen, sa iba, halimbawa, na may impeksyon sa HIV, ang isang quantitative titer ay gumaganap ng isang mahalagang papel. Kapag sinusuri ang lahat ng mga pathogens sa itaas, ang pagsusuri ay tinatawag na "PCR-12 analysis".

Pag-decipher ng mga resulta ng pagsusuri

Ang pag-decipher sa pagsusuri ng PCR ay hindi mahirap. Mayroon lamang 2 mga kaliskis ng tagapagpahiwatig - "positibong resulta" at "negatibong resulta". Kapag may nakitang pathogen, maaaring kumpirmahin ng mga doktor ang pagkakaroon ng sakit na may 99% na katiyakan at simulan ang paggamot sa pasyente. Sa pamamagitan ng isang quantitative na paraan para sa pagtukoy ng impeksyon, ang kaukulang column ay magsasaad ng numerical indicator ng nakitang bacteria. Ang isang doktor lamang ang maaaring matukoy ang antas ng sakit at magreseta ng kinakailangang paggamot.

Sa ilang mga kaso, halimbawa, kapag tinutukoy ang impeksyon sa HIV sa pamamagitan ng PCR, na may negatibong resulta, kinakailangan na magsagawa ng mga karagdagang pagsusuri upang kumpirmahin ang nakuha na mga tagapagpahiwatig.

Saan dadalhin ang pagsusuri?

Saan kukuha ng pagsusuri sa PCR: sa isang pampublikong klinika o sa isang pribadong laboratoryo? Sa kasamaang palad, sa mga munisipal na institusyong medikal, ang mga kagamitan at pamamaraan ay madalas na hindi napapanahon. Samakatuwid, mas mahusay na bigyan ng kagustuhan ang mga pribadong laboratoryo na may modernong kagamitan at mataas na kwalipikadong tauhan. Bilang karagdagan, sa isang pribadong klinika makakakuha ka ng mga resulta nang mas mabilis.

Sa Moscow, maraming pribadong laboratoryo ang nag-aalok ng PCR analysis para sa iba't ibang mga impeksyon. Halimbawa, sa mga naturang klinika tulad ng Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro, isinasagawa ang pagsusuri ng PCR. Ang presyo ng pagsusuri ay mula sa 200 rubles. para sa pagkakakilanlan ng isang solong pathogen.

Maaari itong tapusin na ang diagnosis ng mga nakakahawang sakit sa pamamagitan ng PCR sa karamihan ng mga kaso ay isang mabilis at maaasahang paraan upang makita ang pathogen sa katawan sa mga unang yugto ng impeksiyon. Ngunit gayon pa man, sa ilang mga kaso, ito ay nagkakahalaga ng pagpili ng iba pang mga pamamaraan ng diagnostic. Ang isang espesyalista lamang ang maaaring matukoy ang pangangailangan para sa naturang pag-aaral. Ang pag-decipher sa pagsusuri ng PCR ay nangangailangan din ng isang propesyonal na diskarte. Sundin ang mga tagubilin ng iyong doktor at huwag kumuha ng mga pagsusulit na hindi mo kailangan.