Genişləndirilmiş aglütinasiya reaksiyası (RA). Təxmini aglütinasiya reaksiyası (RA). Birbaşa hemaqlütinasiya reaksiyaları. Hemaqlütinasiya reaksiyası dolayı hemaqlütinasiya reaksiyasıdır

Dolayı hemaqlütinasiya reaksiyası (RIHA)

Adsorbsiya edilmiş diaqnostik preparatların istifadəsi təbiətdə daim həyata keçirilən səth strukturlarının immunoloji tanınması prinsipinə əsaslanır. Bu nöqteyi-nəzərdən, məsələn, mikrob hüceyrəsinin və ya antigenlə yüklənmiş süni daşıyıcının (antikorların) istifadəsi arasında əsaslı fərqlər yoxdur. Sorblaşdırılmış preparatların əsası kimi müxtəlif daşıyıcılardan - mikrob hüceyrələri, eritrositlər, lateks, bentonin, xolesterin, Sefadeks, dermatol, aktivləşdirilmiş karbon, göbələk sporları və s.

A.T.Kravçenkonun (1945) işindən sonra canlılıq qabiliyyətindən məhrum edilmiş və müxtəlif kimyəvi reagentlərlə fiksasiya olunmuş eritrositlər antigen və ya anticisimlərin daşıyıcısı kimi ən geniş şəkildə istifadə olunurdu. Antigenin daşıyıcısı kimi eritrositlərdən (həm yerli, həm də sabit) istifadə prinsipi əsasında dolayı (passiv) hemaqlütinasiya reaksiyası geniş yayılmışdır.

Dolayı hemaqlütinasiya reaksiyasından (İHA) diaqnostik məqsədlər üçün istifadə etmək təklifi eritrositlərin yüksək sorbsiya fəaliyyəti haqqında əvvəllər işlənmiş biliklər əsasında yaranmışdır. Antigenlərin və antikorların bir çox digər daşıyıcıları ilə müqayisədə eritrositlər dolayı hemaqlütinasiya reaksiyasında müəyyən üstünlüklərə malikdirlər. Birincisi, izotonik şoran məhlullarında onlar kifayət qədər sabit birləşmə əmələ gətirir və qısa müddətdə çökmür. İkincisi, eyni heyvan növünün qırmızı qan hüceyrələri eyni ölçüdədir. Və nəhayət, eritrositlər nisbətən asanlıqla birbaşa və ya xüsusi emal nəticəsində müxtəlif seroloji aktiv komponentləri birləşdirir.

Stabilləşdirilmiş eritrositlərdən eritrosit diaqnostikumlarının yaradılması yerli eritrositlərdən istifadə zamanı yaranan çətinlikləri aradan qaldırmağa imkan verir.

Müxtəlif fiksatorlarla müalicə olunan eritrositlərin tədqiqində onların bəzi ümumi xüsusiyyətləri müəyyən edilmişdir:

Morfologiyada onlar praktiki olaraq təzə olanlardan fərqlənmir;

Hipotonik məhlullarda, suda və dondurma-ərimədən sonra hemoliz olunmur;

Dondurulmuş qurudula bilər;

Onların səthi strukturları kimyəvi cəhətdən dəyişdirilmək qabiliyyətini (məsələn, tanin, diazo birləşmələri) saxlayır və antigenlər və antikorlarla reaksiya verir.

Sabit eritrositlərin keyfiyyətinin əsas meyarı, stabilləşdirici mayelərdə qeyri-spesifik aglütinasiya olmadıqda sensibilizasiya edilmiş preparatların alınması üçün istifadə edilməsinin mümkünlüyüdür.

Diaqnostik preparatların layihələndirilməsində antigenlər üçün sorbsiya qabiliyyətini artırmaq məqsədilə eritrositlərin səthinin hazırlanması mühüm əhəmiyyət kəsb edir. Eritrositlərin taninlə müalicəsi xüsusilə geniş yayılmışdır.

Onun təsiri altında eritrositlərin antigen xassələri (keçiricilik, çökmə sürəti) dəyişir, onların müəyyən yağ turşularının hemolitik təsirlərinə qarşı müqaviməti artır. Bununla belə, əsas şey əldə edilir - tanlaşmış eritrositlər zülalların daha yüksək sorbsiya qabiliyyətinə malikdir, bu da hazırda yüksək keyfiyyətli antigen və antikor diaqnostiklərinin istehsalında geniş istifadə olunur.

Eritrositlərin tanizasiyası ilə yanaşı, eritrosit diaqnostikumlarının istehsalı və antigen daşıyıcısının hazırlanması üçün eritrosit membranlarını dəyişdirən bromelain, triopsin və kalium periodat kimi kimyəvi reagentlərdən istifadə olunur.

Eritrositlərin səthi hazırlandıqdan sonra ən vacib proses - hemosensibilizasiya prosesi - eritrosit diaqnostikumlarının hazırlanmasında son mərhələ baş verir.

Daşıyıcı və antigen arasındakı əlaqəni gücləndirmək üçün müxtəlif konjugasiya edən maddələrdən istifadə olunur - bisdiazobenzidin, difluorodinitrobenzin, siyanür xlorid, kadmium xlorid və sirkə turşusu, brom xlorid, formaldehid, glutaraldehid, siyanogen bromid, adolvanol və s.

Birləşdirici maddələrin istifadəsi, konyuqasiya edən maddələr olmadan sensibilizasiya üçün istifadə edilən tanlaşmış eritrositlərin çatışmazlıqlarını aradan qaldırmağa kömək edir.

Ən çox istifadə edilən birləşdirici maddələr xrom xlorid, qlutaraldehid, diazol qara C və amidoldur. Xrom xlorid ilə sensibilizasiya prosesi çox tez baş verir - 4 ilə 10 dəqiqə arasında tədqiqatçıların diqqətini cəlb edir. Bu halda, 0,05-dən 2% -ə qədər xrom xlorid konsentrasiyaları istifadə olunur, pH 20-250 C reaksiya qarışığının temperaturunda 5,0-dən aşağı deyil. Xrom xlorid ilə sensibilizasiya prosesində, eritrosit membran zülallarının karboksil qrupları. aktivləşdirilir. Nəticədə eritrosit membranı ilə sensitin arasında kovalent əlaqə yaranır.

Dolayı hemaqlütinasiya reaksiyası yüksək spesifikliyə malikdir, çünki eritrositlərin aglütinasiyası antigenin eritrositlərə adsorbsiya edilmiş antikorlarla qarşılıqlı təsiri nəticəsində baş verir. Onun fərqli xüsusiyyəti yüksək həssaslıqdır: onda 0,02-0,05 μg antikor zülalı aşkar edilir. Həssaslıq baxımından immunodiffuziya, immunofluoressensiya, radial immunodiffuziya, komplementin fiksasiyası və neytrallaşdırma reaksiyalarını əhəmiyyətli dərəcədə üstələyir. RNGA radioimmunoelektroforez, immunosorbentdə radioaktiv anticisimlərin zülalının miqdarının təyini, ferment immunoassay üsullarından daha az həssasdır.

RNGA-nın üstünlüklərinə kifayət qədər yüksək reproduktivlik, icra asanlığı və xüsusilə mikrometoddan istifadə edərkən minimal miqdarda inqrediyentlərə ehtiyac daxildir.

Son illərdə RNHA yoluxucu rinotraxeit, ishal, adenovirus infeksiyası, rota- və koronavirus infeksiyası, paraqrip-3 və respirator sinsitial infeksiyanın diaqnostikasında geniş tətbiq tapmışdır.

Biz rota- və koronavirus infeksiyalarına qarşı anticisimlərin aşkarlanması üçün eritrosit diaqnostikumunun istehsalı və istifadəsi nümunəsini veririk.

RNGA-da rota- və koronavirus antigenlərinin aşkarlanması üçün antitel diaqnostikumlarının hazırlanması üsulu aşağıdakı kimidir: eritrositlərin suspenziyasının alınması; onların akroleinlərini düzəltmək; eritrositlərdə tələb olunan proteinin sabit sorbsiyasını əldə etməyə imkan verən tanlaşma; tanized eritrositlərin immunoqlobulinlərlə sensibilizasiyası; hazırlanmış diaqnostikumun spesifikliyinin müəyyən edilməsi. Eritrositlərin suspenziyasının hazırlanması kliniki cəhətdən sağlam qoçun qanını şüşə muncuqlar olan kolbaya götürməklə həyata keçirilir. Qanın defibrinasiyasından sonra eritrositlər 3-5 dəfə izotonik (0,9%) natrium xlorid məhlulu ilə 400 q-da 15-20 dəqiqə sentrifuqa edilərək yuyulmalıdır.

Qırmızı qan hüceyrələrini sabitləşdirmək üçün akrolein ilə müalicə olunur. Bildiyiniz kimi, onun hərəkəti formaldehiddən bir qədər yumşaqdır və eritrositlərin sabitliyini və daha yüksək aktivliyini təmin edir. Bunun üçün bərabər həcmdə eritrositlərin 10% suspenziyası pH 7,2 olan fosfat tampon məhlulunda (PBS) hazırlanmış 0,2% akrolein məhlulu ilə qarışdırılır. Yaranan suspenziya 30 dəqiqə 37°C-də saxlanılır, hərtərəfli qarışdırılır, ardınca xüsusi qoxu tamamilə yox olana qədər 600-800 q-da 5 dəqiqə təkrar sentrifuqalama yolu ilə akrolein buraxılır. Bu üsulla hazırlanan eritrositlərin üstünlüyü ondan ibarətdir ki, onlar gələcək üçün yığılır, hemolizə məruz qalmadan uzun müddət saxlanıla bilirlər.

Sonradan, 10% konsentrasiyada stabilləşdirilmiş eritrositlər iki ay ərzində pH 7,2 olan PBS-də 2-4 ° C-də saxlanılır.

Eritrositlərin sorbsiya qabiliyyətini və çökmə qabiliyyətini artırmaq üçün yuyulmuş eritrositlərin 10% suspenziyasının bərabər hissələrini və PBS və pH 7.2-də tanin məhlulunu 1:30.000 seyreltmə ilə qarışdırmaqla onları taniz etmək lazımdır. Qarışıq yaxşıca qarışdırılır və 370 C-də 15 dəqiqə saxlanılır, bundan sonra eritrositlər pH 7,2 olan PBS-də iki dəfə və pH 7,2-7,4 olan izotonik natrium xlorid məhlulu ilə üç dəfə tanindən yaxşıca yuyulur.

Yüksək keyfiyyətli eritrosit diaqnostikumlarının alınmasına zəmanət vermək üçün optimal vaxt onların taninlə müalicəsindən sonra 24-48 saat ərzində həssaslaşmasıdır.

Diaqnostiklərin hazırlanması prosesində həlledici və konservant kimi əvvəllər 56°C-də 30 dəqiqə ərzində inaktivləşdirilmiş və normal qoyun eritrositləri tərəfindən adsorbsiya edilmiş 0,1%-li normal dovşan və ya at serumu ilə 0,3%-li fenollaşdırılmış izotonik natrium xlorid məhlulundan istifadə olunur.37°C 30 dəq.

Qaralaşmış eritrositlərin sensibilizasiyası müvafiq olaraq iribuynuzlu rota- və koronaviruslara qarşı hiperimmun zərdab ilə aparılmalıdır (Ya.R.Kovalenko adına Ümumrusiya Tədqiqat Eksperimental Baytarlıq Təbabəti İnstitutunda istehsal edilmişdir). Eyni zamanda, antirotavirus immun zərdabının həssaslaşdırıcı dozası (protein konsentrasiyası) 280 mkq/ml, koronavirusa qarşı immun zərdabınınki isə 260 mkq/ml təşkil edir.

Həssaslaşdırma, optimal konsentrasiyada 560C-də 30 dəqiqə əvvəlcədən qızdırılan bərabər həcmdə tanlaşmış eritrositlərin və immun serumun qarışdırılması ilə həyata keçirilir. Bundan əlavə, pH 7,2 olan izotonik natrium xlorid məhlulunun 3 hissəsi və 0,1% xrom xlorid məhlulunun 5 hissəsi əlavə olunur. Qarışıq, vaxtaşırı qarışdıraraq, 5 dəqiqə otaq temperaturunda saxlanılır. Göstərilən vaxtdan sonra qarışıq pH 7,2 olan PBS istifadə edərək yaxşıca yuyulur və sonra hazırlanmış eritrosit diaqnostikləri konservantda 1% konsentrasiyaya qədər yenidən dayandırılır. Hazırlanmış diaqnostikum 4°C temperaturda saxlandıqda 8 ay ərzində öz əsas keyfiyyətlərini saxlayır.

Diaqnostiklərin istehsalının bütün mərhələlərində özünü aglütinasiyaya nəzarət edilir. Hazırlanmış diaqnostikumların spesifikliyi RNGA mərhələləri ilə müəyyən edilir, burada antigen kimi RTI viruslarının, PG-3, adenovirusların, viral ishalın, həmçinin rota- və koronavirus antigenlərinin standart diaqnostikumlarından istifadə edilmişdir.

RNHA qurarkən, tədqiq edilmiş virus tərkibli materialın ardıcıl ikiqat seyreltmələri hazırlanır (nəcis nümunələrinin 20-50% suspenziyası), sonra hər bir quyuya bərabər həcmdə eritrosit diaqnostikumu əlavə edilir. Plitələr bir neçə dəfə hərtərəfli sarsılmalı, eritrositlər nəzarətdə tamamilə yerləşənə qədər otaq temperaturunda buraxılmalıdır. Müsbət reaksiyanın göstəricisi eritrosit diaqnostikumunun 1:4 və daha yuxarı titrdə aqlütinasiya intensivliyi 2+ olan aglütinasiyasıdır.

O, eritrositlərdən və ya neytral sintetik materiallardan (məsələn, lateks hissəciklərindən) istifadə edir, onların səthində antigenlər (bakterial, viral, toxuma) və ya antikorlar adsorbsiya olunur. Onların aglütinasiyası müvafiq sera və ya antigenlər əlavə edildikdə baş verir. Antigenlərlə həssaslaşdırılan qırmızı qan hüceyrələri antigenik eritrosit diaqnostikum adlanır və antikorları aşkar etmək və titr etmək üçün istifadə olunur. Eritrositlər antikorlarla həssaslaşır. immunoqlobulin eritrosit diaqnostikumları adlanır və antigenləri aşkar etmək üçün istifadə olunur.

Passiv hemaqlütinasiya reaksiyası bakteriyaların (tif və paratif, dizenteriya, brusellyoz, vəba, vəba və s.), protozoa (malyariya) və virusların (qrip, adenovirus infeksiyaları, viral hepatit B, qızılca, gənə) törətdiyi xəstəliklərin diaqnostikasında istifadə olunur. ensefalit, Krım hemorragik qızdırması və s.), həmçinin müəyyən hormonları təyin etmək, xəstənin penisilin və insulin kimi dərmanlara və hormonlara qarşı yüksək həssaslığını müəyyən etmək.

Passiv hemaqlütinasiya reaksiyası (RPHA). Passiv hemaqlütinasiya testi həssas seroloji diaqnostika üsuludur və həm erkən, həm də retrospektiv diaqnostika, həmçinin peyvənd olunmuş insanların immunoloji vəziyyətini müəyyən etmək üçün istifadə olunur. Tulyaremiyalı xəstələrdə antikorlar adətən xəstəliyin 1-ci və ya 2-ci həftəsinin sonunda aşkar edilir, 1-1,5 aydan sonra TPHA titrləri maksimum dəyərlərə çatır (1:100,000-1:20,000, daha az tez-tez daha yüksək), bundan sonra 1:100-1:200 səviyyəsində azalmalar uzun müddət davam edir.

Peyvənd olunanlarda antikorlar da daim aşkar edilir, lakin daha aşağı titrlərdə, peyvənddən 1-1,5 ay sonra 1:2000-1:5000-dən çox deyil, 1:20-1:80 aşağı səviyyədə bir neçə il qalır.

Tulyaremiya eritrosit diaqnostikumu (antigenik) RPHA təyin etmək üçün bir antigen kimi xidmət edir. Dərman maye və quru formada mövcud olan tulyaremiya antigeni ilə sensibilizasiya edilmiş formallaşdırılmış qoç eritrositləridir. Maye preparatı - 10% konsentrasiyalı formalin həllində eritrositlərin 10% suspenziyası. Quru liyofilləşdirilmiş preparat - konservantsız eritrositlərin vakuumda qurudulmuş 10% suspenziyası. İstifadədən əvvəl etiketdəki göstərişlərə uyğun olaraq seyreltilir. Polistirol plitələrində reaksiya qurmaq üçün hər iki dərman 2,5% konsentrasiyada və mikrohəcmlərdə reaksiya qurarkən 0,5% konsentrasiyada istifadə olunur.

RPGA quraşdırma texnikası. Test zərdabları salin ilə 1:5 (1:10) ilə seyreltilir və 30 dəqiqə ərzində 56 dərəcə C-də qızdırılır. Bundan sonra qoç eritrositlərinə qarşı heterojen anticisimləri çıxarmaq üçün zərdablar rəsmiləşdirilmiş qoç eritrositlərinin 50% suspenziyası ilə müalicə olunur. Bunun üçün eritrositlər 1 ml seruma 2 damcı (0,05 ml) nisbətində əlavə edilir və çalxalanaraq yaxşıca qarışdırılır. Serum eritrositlərin tam çökməsinə qədər qalır və ya otaq temperaturunda bir saat sonra sentrifuqa edilir, bundan sonra tədqiqata hazırdır.

Seyreltmə mayesi 0,5 ml həcmdə polistirol plitəsinin bir sıra quyularına tökülür. Seraların ilkin tədqiqində, reaksiyanı lövhənin qısa cərgəsində (6 deşik) qurmaqla onları yoxlamaq məsləhətdir. Qısa serumlarda antikorlar aşkar edildikdə, serumlar uzun bir sıra seyreltmələrdə (12 quyu) yenidən yoxlanılır. Seyreltmə mayesi töküldükdən sonra hər sıranın birinci quyusuna (qısa və ya uzun) 1:5 nisbətində seyreltilmiş 0,5 ml sınaq serumu əlavə edilir. Sonra eyni həcmlərdə zərdab ikiqat seyreltmə ilə titrlənir. Beləliklə, serum seyreltmələri 1:10-dan 1:320-ə qədər qısa bir sıra, uzun bir seriyada isə 1:10-dan 1:20480-ə qədər əldə edilir. Serumların titrlənməsindən sonra hər bir quyuya bir damcı (0,05 ml) həssaslaşdırılmış eritrositlərin 2,5%-li işləyən suspenziyası əlavə edilir. Plitələrin məzmunu homojen bir süspansiyon alınana qədər hərtərəfli sarsılır. Plitələr masanın sabit səthində otaq temperaturunda qalır. Reaksiyanın ilkin qeydiyyatı 2-3 saatdan sonra aparılır, titrin yekun təyini quyularda eritrositlərin tam çökməsindən sonra aparılır. Reaksiya üçün aşağıdakı nəzarət vasitələri nəzərdə tutulmuşdur: 1) 0,5 ml həcmdə + 1 damcı 2,5%-li sensibilizasiya edilməmiş eritrositlərin suspenziyasında 1:10 nisbətində seyreltilmiş zərdabın sınaqdan keçirilməsi; 2) 0,5 ml həcmində seyreltici maye + həssas olmayan eritrositlərin 2,5% suspenziyasının 1 damcısı; 3) 0,5 ml həcmdə seyreltici maye + həssaslaşmış eritrositlərin 2,5% suspenziyasının 1 damcısı. Bütün nəzarətlər açıq şəkildə mənfi reaksiya verməlidir.

RPGA-nın uçotu və qiymətləndirilməsi. Reaksiya aşağıdakı sxem üzrə qiymətləndirilir:

1) kəskin müsbət reaksiya (++++) - eritrositlər quyunun dibinə "çətir" şəklində vahid bir təbəqədə düşür, burada tez-tez qırıq kənarlar müşahidə olunur;

2) müsbət reaksiya (+++) - eritrositlər çuxurun dibinin ən azı 2/3 hissəsini əhatə edir;

3) zəif müsbət reaksiya (++) - aglutinat kiçikdir və çuxurun tam mərkəzində yerləşir;

4) şübhəli reaksiya (+) - çuxurun tam mərkəzində eritrosit çöküntüsünün ətrafında ayrı-ayrı aglütinat dənələri var;

5) mənfi (-) - çuxurun dibində eritrositlər "düymə" və ya hamar, kəskin şəkildə müəyyən edilmiş kənarları olan kiçik bir üzük şəklində yerləşirlər.

Serum titri son zərdabın seyreltilməsinə görə nəzərə alınır ki, bu da çox aydın reaksiya verdi (ən azı üç müsbət). 1:100 və daha yüksək seyreltmə diaqnostik titr hesab olunur, lakin RA vəziyyətində olduğu kimi, onun artmasına nəzarət etmək lazımdır.

Tulyaremiyada TPHA kifayət qədər spesifikdir və yalnız brusellyoz serumları ilə bəzi çarpaz reaksiyaları aşkar edir. Diferensial diaqnoz homoloji antigenlə daha yüksək olan TPHA-da titrlərin hündürlüyü ilə mümkündür.

Mikrohəcmlərdə RPHA-nın təyin edilməsi texnikası. RPHA materialın 25 µl və 50 µl həcmində titrlənməsinə imkan verən Takachi tipli mikrotiterdən (və ya mikropipetləri olan dairəvi dibli mikrotitr lövhələrindən) istifadə edərək mikrohəcmlərdə həyata keçirilə bilər. Reaksiyaların qurulması texnikası, bütün əməliyyatların ardıcıllığı polistirol plitələrindəki tədqiqatda olduğu kimidir. Bununla belə, nəzərə almaq lazımdır ki, mikrometodun həssaslığı adətən makrometoddan bir qatılma (yəni 2 dəfə) aşağı olur.

Reaksiyanı bir damcı pipetindən istifadə edərək mikrotitrdə qurmaq üçün hər bir quyuya 50 μl həcmdə seyreltmə mayesi daxil edilir. Sonra 50 μl başlıqlı titratorlardan istifadə edərək, başı ora batıraraq sınaq serumu alınır. Mayenin titrator başlığını doldurduğundan əmin olun. Serumlu titrator birinci quyuya köçürülür və onu şaquli vəziyyətdə saxlayaraq hər iki istiqamətdə bir neçə fırlanma hərəkəti edir. Sonra titrator növbəti quyuya köçürülür və manipulyasiya təkrarlanır. Titrləmə eyni vaxtda bir neçə cərgədə aparıla bilər. Bütün sıra titrləndikdən sonra titrator fırlanma hərəkətləri ilə distillə edilmiş su ilə (2 porsiya dəyişdirilməklə) yuyulur, başdan tamponla su çıxarılır və ocaq alovunda yandırılır.

Titrləmədən sonra quyulara 25 μl eritrosit diaqnostikası əlavə edilir. Mikrohəcmlərdə RPHA üçün diaqnostik konsentrasiyası 0,5% olmalıdır (yəni eritrositlərin 2,5% suspenziyası əlavə olaraq 5 dəfə seyreltilir). Eritrositlər əlavə edildikdən sonra, homojen bir süspansiyon əldə olunana qədər plitələr yumşaq bir şəkildə sarsılmalıdır. Nəticələr artıq 1-1,5 saatdan sonra qeydə alına bilər ki, bu da mikrotitrdə RPHA-nın əhəmiyyətli üstünlüyüdür. Bundan əlavə, bu üsul reaksiyanın bütün inqrediyentlərindən və sınaq serasından az miqdarda tələb olunur.

Reaksiya aşağıdakı kimi hesablanır:

1) "+" - eritrositlərin dibinin ən azı 2/3 hissəsini tutan "çətir" şəklində vahid təbəqədə quyunun dibinə düşdüyü tam hemaqlütinasiya;

2) "+ -" - eritrositlərin kiçik ölçülü boş bir halqa şəklində dibinə düşdüyü qismən hemaqlütinasiya;

3) "-" - eritrositlər hamar kənarı olan kiçik bir düymə və ya üzük şəklində dibinə düşdükdə, hemaglütinasiyanın olmaması.

TPHA-da əldə edilən müsbət nəticənin spesifikliyi üç komponentli reaksiyadan - passiv hemaqlütinasiyanın (RPHA) inhibə reaksiyasından istifadə etməklə yoxlanıla bilər.

RTPGA quraşdırma texnikası. Bu reaksiya şübhə və ya xüsusi epidemioloji maraq doğuran zaman RPHA-nın müsbət nəticəsinin spesifikliyini təsdiqləmək üçün təyin edilir. Reaksiya mexanizmi test serumuna öldürülmüş tulyaremiya bakteriyasının bir suspenziyası əlavə edildikdə hemaqlütinasiyanın xüsusi inhibəsindən ibarətdir. Reaksiyada üç komponent qarşılıqlı əlaqədə olur: test zərdabı, spesifik tulyaremiya antigeni və antigen eritrosit diaqnostikum RTPGA adətən 7-8 quyu sırasına yerləşdirilir. RTPGA ilə paralel olaraq ikinci RPHA quraşdırmaq məsləhətdir. İki sıra quyuya 0,25 ml durulaşdırıcı maye tökülür, sonra hər iki cərgənin birinci quyularına 0,25 ml həcmdə sınaq zərdabı əlavə edilir və titrlənir.İki eyni sıra zərdab seyreltmələri alınır. İkinci cərgənin bütün quyularına 0,25 ml durulaşdırıcı maye, birinci sıranın quyularına isə 0,25 ml tulyaremiya bakteriyasının suspenziyası əlavə edilir. Tularemia diagnosticum istifadə olunur (1 ml-də 25 milyard tulyaremiya bakteriyası ehtiva edir), əvvəllər 50 dəfə seyreltilir. Belə bir suspenziya 1 ml-də 500 milyon bakteriya və ya 0,25 ml həcmdə 125 milyon bakteriya ehtiva edir. Antigen əlavə edildikdən sonra boşqab otaq temperaturunda 1 saat saxlanılır, bundan sonra hər iki cərgənin bütün quyularına bir damcı (0,05 ml) eritrosit diaqnostikum əlavə edilir, boşqab silkələnir və masanın düz səthində qalır. Mühasibat uçotu 2-3 saat ərzində aparılır.

RTPGA-nın uçotu və qiymətləndirilməsi. Əgər test zərdabında spesifik tulyaremiyaya qarşı anticisimlər varsa, onlar əlavə edilmiş antigenlə zərərsizləşdirilir və birinci cərgədə hemaqlütinasiya baş verməyəcək və ya yüksək zərdab titri ilə hemaqlütinasiya daha az (2-4) quyuda müşahidə olunacaq. TPHA ilə sıra. Bu halda nəticələrin spesifikliyi təsdiqlənir. Hər iki cərgədə hemaqlütinasiya qeyd edilərsə, yəni. RTHA və RPHA nəticələri üst-üstə düşür, bu, test zərdabında tulyaremiyaya qarşı antikorların olmadığını göstərir. Bu halda, RPHA-nın ilkin nəticəsi qeyri-spesifik hesab olunur.

Mikrohəcmlərdə RTPGA təyin etmək texnikası. RTHA, eləcə də RPHA, Takachi tipli mikrotiterdən istifadə edərək mikrohəcmlərdə həyata keçirilə bilər. Bunun üçün hər biri 7-8 quyudan ibarət iki cərgədə mikroplitələrin quyularına 0,25 μl seyreltici maye əlavə edilir. Sonra titratorun köməyi ilə 0,25 μl test zərdabı ballanır və hər iki cərgədə titrlənir. Bundan sonra birinci cərgədə hər quyuya 25 µl tulyaremiya antigeni (konsentrasiyası 1 ml-də 500 milyon tulyaremiya bakteriyasıdır), ikinci sıraya isə 25 µl seyreltici maye əlavə edilir. Plitələr otaq temperaturunda 1 saat saxlanılır, bundan sonra hər iki cərgənin bütün quyularına 25 μl antigen eritrosit diaqnostikası (0,5% konsentrasiya) əlavə edilir. Nəticələrin uçotu və qiymətləndirilməsi makrohəcmlərdəki reaksiyaya bənzər şəkildə aparılır.

Reaksiya təyin olunur:

1) polisaxaridləri, zülalları, bakteriya ekstraktlarını və digər yüksək dispersli maddələri, rikketsiyaları və aqqlütininlərlə kompleksləri şərti RA-da görünməyən virusları aşkar etmək;

2) xəstələrin zərdabında bu yüksək dispersli maddələrə və ən kiçik mikroorqanizmlərə qarşı anticisimləri aşkar etmək.

Dolayı və ya passiv aglütinasiya dedikdə, antikorların əvvəllər inert hissəciklər (lateks, sellüloza, polistirol, barium oksidi və s. və ya qoç eritrositləri, I (0) -insan qan qrupları) üzərində adsorbsiya edilmiş antigenlərlə qarşılıqlı əlaqəsi başa düşülür.

Reaksiyada passiv hemaqlütinasiya (RPHA) daşıyıcı kimi istifadə olunur eritrositlər. Antigenlə yüklənmiş eritrositlər bu antigenə qarşı spesifik anticisimlərin iştirakı ilə bir-birinə yapışır və çökür. Antigen-həssaslaşdırılmış eritrositlər RPHA-da antikorların aşkarlanması (serodiaqnoz) üçün eritrosit diaqnostikumu kimi istifadə olunur. Əgər eritrositlər antikorlarla yüklənirsə (eritrosit antikor diaqnostikası), onda antigenləri aşkar etmək üçün istifadə edilə bilər.

düyü. 3. RPGA-nın sxemi: antigenlə (3) yüklənmiş eritrositlər (1) spesifik antikorlarla bağlanır (4).

səhnələşdirmə. Polistirol tabletlərinin quyularında serumun bir sıra ardıcıl seyreltmələri hazırlanır. Sondan əvvəlki quyuda - 0,5 ml məlum müsbət serum və son 0,5 ml şoran məhlulda (nəzarət). Sonra bütün quyulara 0,1 ml seyreltilmiş eritrosit diaqnostikası əlavə edilir, çalxalanır və 2 saat ərzində termostata qoyulur.

Mühasibat uçotu. Müsbət halda eritrositlər çuxurun dibində qatlanmış və ya əyilmiş kənarı (ters çevrilmiş çətir) olan hüceyrə təbəqəsi şəklində, mənfi halda isə düymə və ya üzük şəklində yerləşirlər. .

Şəkil 4. Mühasibat Uçotu RNGA (RPGA).

Botulinum toksinini aşkar etmək üçün rnga dəstinin nəticələrinin uçotu.

Botulizmin törədicisi - Clostridium botulinum yeddi serovardan (A, B, C, D, E, F, G) toksinlər əmələ gətirir, lakin A, B, E serovarları digərlərinə nisbətən daha çox yayılmışdır.Bütün toksinlər antigen xassələri ilə fərqlənir və ola bilər. reaksiyalarda spesifik tip seralara görə fərqləndirilə bilər. Bu məqsədlə xəstənin zərdabında toksinin olması gözlənilən və A, B, E tipli antitoksik anti-botulinum zərdablarının anticisimləri ilə yüklənmiş eritrositlərlə passiv (dolayı) hemaqlütinasiya reaksiyası aparıla bilər. serum nəzarət kimi xidmət edir.

düyü. 3. RNGA-nın bəyanatı və nəticəsi.

Mühasibat uçotu. Müsbət halda eritrositlər çuxurun dibində qatlanmış və ya əyilmiş kənarı (ters çevrilmiş çətir) olan hüceyrə təbəqəsi şəklində, mənfi halda isə düymə və ya üzük şəklində yerləşirlər. .

Nəticə: Xəstənin zərdabında E tipli botulinum toksini aşkar edilmişdir.

Hemaqlütinasiya inhibə reaksiyası (hrga).

düyü. 8. Hemaqlütinasiyanın qarşısının alınması reaksiyası (RTGA) (sxem).

Reaksiya prinsipi AT-nin müxtəlif virusları bağlamaq və onları neytrallaşdırmaq qabiliyyətinə əsaslanır, bu da eritrositlərin aglütinasiyasını qeyri-mümkün edir. Vizual olaraq, bu təsir hemaglütinasiyanın "inhibisyonunda" özünü göstərir. RTHA virus infeksiyalarının diaqnostikasında spesifik antihemaqlütininləri müəyyən etmək və müxtəlif virusları Ag-nin xüsusiyyətlərini nümayiş etdirən hemaqlütininləri ilə müəyyən etmək üçün istifadə olunur.

Virusların yazılması RTGA reaksiyasında tipə xas sera dəsti ilə həyata keçirilir. Reaksiya nəticələri hemaglütinasiyanın olmaması ilə nəzərə alınır. H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 və başqaları antigenləri olan A tipli virus alt tipləri homoloji tip spesifik sera dəsti ilə RTGA-da fərqləndirilə bilər.

düyü. 9. Qrip virusunun tipləşdirilməsi zamanı RTGA-nın nəticələri

İşarələr: - hemaqlütinasiyanın inhibəsi (düymə); - hemaqlütinasiya (çətir).

Nəticələr: Test materialında H3N2 antigeni olan A tipli qrip virusu var.

Test materialında patogenlərin antigenlərini aşkar etmək üçün reaksiya ona immun zərdab əlavə etməklə həyata keçirilir. Homoloji antigenin olması halında anticisimlərin bağlanması baş verir, buna görə də antigenlə həssaslaşdırılmış eritrositlər əlavə edildikdən sonra onların aglütinasiyası baş vermir ki, bu da müsbət nəticə kimi qiymətləndirilir. Reaksiyanın daha yüksək həssaslığı üçün test materialına minimum miqdarda (2 hemaglütinasiya vahidi) xüsusi immun serum əlavə edilir. İmmun serumun titri əvvəllər RNGA istifadə edərək müəyyən edilir. Bir hemaglütinasiya vahidi üçün eritrositlərin aglütinasiyasına səbəb olan serumun məhdudlaşdırıcı seyreltilməsini qəbul edin.

Metodologiya. Polistirol plitələrin və ya aglütinasiya borularının quyularına 0,025 ml 1%-li normal dovşan zərdab məhlulu əlavə edilir və sınaq materialının ardıcıl 2 qat qatılaşdırılması aparılır. Sonra bütün quyulara 0,025 ml immun zərdab əlavə edilir, boşqab çalxalanır və 30 dəqiqə 37ºС temperaturda və ya 1 saat otaq temperaturunda saxlanılır. Bundan sonra bütün quyulara 0,025 ml antigen diaqnostikum əlavə edilir, çalxalanır və 2 saat buraxılır, bundan sonra nəticələr nəzərə alınır.

Bu reaksiyanı həyata keçirərkən RNGA üçün nəzarətə spesifik antigen, immun serum (2, 1, 0,5 hemaqlütinasiya vahidi) və sensibilizasiya olunmuş eritrositlərin suspenziyasından ibarət immun serum spesifikliyinə nəzarət əlavə edilir.

RTNGA, həmçinin xüsusi antikorları (tam və bloklayan) aşkar etmək üçün istifadə olunur, bunun üçün test serumuna dozalı miqdarda antigen əlavə edilir. Tərkibində antikor varsa, onda onlar bir antigenlə bağlanır, buna görə də antikorlarla həssaslaşdırılmış eritrositlər əlavə edildikdən sonra (RTNHA-nın 2-ci mərhələsi) eritrositlər bir-birinə yapışmır.

Minimum miqdarda antigenin (2 neytrallaşdırıcı doza) istifadəsi səbəbindən reaksiya yüksək həssasdır. Antigen preparatında neytrallaşdırıcı dozaların sayı RNGA-dan istifadə etməklə müəyyən edilir, eyni zamanda antigenin ardıcıl 2 dəfə seyreltilməsi normal dovşan zərdabının 1%-lik məhlulunda aparılır və quyulara antikor eritrosit diaqnostikumu əlavə edilir. Antigenin neytrallaşdırıcı dozası onun maksimum qatılaşdırılmasıdır ki, bu da həssaslaşmış eritrositlərin tam yapışmasını təmin edir.

Reaksiya başlamazdan əvvəl sınaq serumları 1:5-1:10 nisbətində seyreltilir və 56°C temperaturda 30 dəqiqə ərzində inaktivləşdirilir. Hemaqlütininlərin adsorbsiyası üçün 1 ml seyreltilmiş zərdab üçün 0,1 ml suspenziya nisbətində zərdablara rəsmiləşdirilmiş və ya təzə yuyulmuş qoyun eritrositlərinin 50% suspenziyası əlavə edilir. Qarışıq çalxalanır və 30 dəqiqə 37°C-də və ya 1 saat otaq temperaturunda inkubasiya edilir, bundan sonra eritrositlər sentrifuqa ilə çökdürülür. Eritrositlərin çökməsi üçün serumu ertəsi günə qədər soyuducuda saxlaya bilərsiniz.

Təcrübə zamanı test materialı mikrotitr panelinin quyularında 0,025 ml həcmdə normal dovşan zərdabının 1%-li məhlulunda seyreltilir. Sonra hər bir quyuya 0,025 ml həcmdə antigenin 2 neytrallaşdırıcı dozası əlavə edilir. Plitələr silkələnir və 30 dəqiqə 37 ° C-də və ya 1 saat otaq temperaturunda buraxılır. Sonra bütün quyulara 0,025 ml antikor eritrosit diaqnostikası əlavə edilir. Plitələr çalxalanır və otaq temperaturunda 1,5-2 saat inkubasiya edilir, bundan sonra reaksiyanın nəticələri nəzərə alınır. Mühasibat ertəsi gün də aparıla bilər. Tədqiq olunan zərdabın titri eritrositlərin bir-birinə yapışmadığı onun maksimal seyreltilməsi hesab olunur.

Təcrübə aşağıdakı nəzarət növləri ilə müşayiət olunur:

1) sensibilizasiya edilmiş eritrositlərin sabitliyi (eritrositlər + normal dovşan serumunun 1% həlli);

2) hər bir test serumunda hemaqlütininlərin tükənməsinin tamlığı (ən kiçik seyreltmədə test zərdabında + formalinləşdirilmiş eritrositlər);

3) antigenin minimum neytrallaşdırıcı dozasının təyin edilməsinin düzgünlüyü (antigenin neytrallaşdırıcı dozasının 2, 1 və 0,5-i + antikor eritrosit diaqnostikası).

Əks dolayı hemaqlütinasiya (ronq) test materiallarında bakterial və viral antigenləri göstərmək üçün, həmçinin bir sıra infeksiyaların ekspress diaqnostikası üçün istifadə olunur.

RNHA-dan fərqli olaraq, bu reaksiyada eritrositlər antigen tərəfindən deyil, antigen əlavə edildikdə aglütinasiyası baş verən antikorlar tərəfindən həssaslaşdırılır.

Eritrositlər ilkin olaraq formalin və ya qlutaraldehidlə bərkidilir, sonra isə immun seralardan təcrid olunan və digər zərdab zülallarından təmizlənən qamma-qlobulinə bağlanırlar. Qamma-qlobulinin eritrositlərin səthinə bağlanması xrom xloridin köməyi ilə baş verir. Bunun üçün 8 həcm distillə edilmiş suya 1 həcm immun zərdabdan təcrid olunmuş immunoqlobulinlər, 1 həcm formallaşdırılmış eritrositlərin 50%-li suspenziyası və 1 həcm 0,1-0,2%-li xrom xlorid məhlulu əlavə edilir. Qarışıq otaq temperaturunda 10-15 dəqiqə saxlanılır, sonra eritrositlər passiv hemaqlütinasiya reaksiyasında olduğu kimi müalicə olunur.

Antikor diaqnostikasının spesifikliyi passiv hemaqlütinasiyanın homoloji antigenlə inhibə edilməsi reaksiyasında yoxlanılır. Reaksiya homoloji antigen tərəfindən ən azı 16 dəfə inhibə edilməli və heteroloq tərəfindən inhibə edilməməlidir. Spontan hemaqlütinasiyanın olmaması üçün nəzarətdən istifadə edin.

Bu reaksiyanın köməyi ilə patogenlər ölü insanların və heyvanların orqanlarından, məsələn, beyindən, dalaqdan, ağciyərlərin qaraciyərindən alınan materialda göstərilir. Bu orqanların izotonik natrium xlorid məhlulunda 10% suspenziyasını hazırlayın, onları 10000 rpm-də 30-60 dəqiqə sentrifuqa edin və supernatantdan antigen kimi istifadə edin.

Metodologiya. Stabilləşdirici məhlulda sınaq materialının (antigenin) 2 qat qatılmalarını hazırlayın. Mikroarrayın 3 bitişik quyusuna (reaksiya 3 paralel quyu cərgəsini götürür) hər bir antigen seyreltməsindən 1 damcı edin. Birinci sıranın hər quyusuna 1 damcı stabilləşdirici məhlul, 1 damcı homoloji immun zərdab 1:10 nisbətində seyreltilmiş, ikinci sıranın quyularına 1 damcı heteroloji immun serum əlavə edilir. üçüncü sıra. İkinci və üçüncü sıralar reaksiyanın spesifikliyinə nəzarət kimi xidmət edir. Qarışıq otaq temperaturunda 20 dəqiqə buraxılır.

Həssaslaşmış eritrositlərin 1% suspenziyasından (eritrosit antikor diaqnostikum) 1 damcı bütün quyulara əlavə edin və lövhələri yaxşıca silkələyin. Reaksiya nəticələri 30-40 dəqiqədən sonra nəzərə alınır. Xüsusi bir antigen olduqda, birinci və üçüncü cərgədə hemaqlütinasiya qeyd olunur (heterolog serum ilə) və antigenin əvvəllər homolog serum ilə neytrallaşdırıldığı ikinci sırada yoxdur.

Reaksiya spontan aglütinasiya üçün həssaslaşdırılmış eritrositlərin nəzarəti ilə müşayiət olunur.

Əks dolayı hemaqlütinasiya inhibə reaksiyası (RTONGA) insan və heyvanların zərdabında anticisimlərin olmasını müəyyən etməyə imkan verir.

Metodologiya. Serumlar 10 dəfə izotonik natrium xlorid məhlulu ilə seyreltilir, qeyri-spesifik inhibitorları məhv etmək üçün 65 ° C temperaturda 20 dəqiqə qızdırılır və sonra serumların 2 qat seyreltmələri stabilləşdirici məhlulda və antigenin iş dozasında hazırlanır. 4 aglütinasiya qurğusu. Mikropanelin quyularına hər zərdabın seyreltməsindən 1 damcı əlavə edin və onlara 1 damcı antigen əlavə edin, onun seyreltilməsi işçi dozaya uyğundur. Qarışığın komponentləri otaq temperaturunda 20 dəqiqə təmasda olduqdan sonra bütün quyulara 1 damcı eritrosit antikor diaqnostikası əlavə edilir və yaxşıca çalxalanır. Otaq temperaturunda 1,5-2 saat inkubasiya edildikdən sonra reaksiyanın nəticələri hemaqlütinasiya yolu ilə nəzərə alınır. Serum titri onun dörd antigen aglütinasiya vahidi ilə hemaqlütinasiya reaksiyasını tamamilə maneə törədən ən yüksək seyreltmədir.

Reaksiya spontan aglütinasiya üçün sensibilizasiya olunmuş eritrositlərin nəzarəti ilə müşayiət olunur: a) stabilləşdirici məhlul; b) normal antigen (tərkibində virus olmayan materialdan); c) sınaq serumu. Reaksiyanın üstünlüyü onun çox yönlülüyündə və müxtəlif antigenləri aşkar etmək üçün istifadə etmək imkanındadır.

Hemaqlütinasiyanın nəticələrinin qiymətləndirilməsi. RNGA, RONGA və RTONGA nəticələri eritrositlərin aglütinasiya dərəcəsinə görə nəzərə alınır: (++++) - tam aglütinasiya; (+++) - daha az tam aglütinasiya; (++) - qismən aglütinasiya; (+) - aglütinasiya izləri; (–) – aglütinasiyanın olmaması.

Aqqlütinasiya tam (++++) və ya demək olar ki, tam (+++) olarsa, reaksiyanın hər bir komponentinin iştirakı ilə diaqnostikum kortəbii olaraq aglütinasiya olunmazsa, antigen və ya anticisim spesifikliyinə nəzarət müsbət olarsa, reaksiya müsbət hesab olunur. .

Antigenlərin əvvəlcədən adsorbsiya olunduğu eritrositlərin homoloji zərdabların (anticisimlərin) iştirakı ilə aglütinasiya qabiliyyəti əldə etməsinə əsaslanır.

Bu zaman eritrositlər spesifik determinantlara malik daşıyıcı rolunu oynayır, onların aglütinasiyası antigen + antikor reaksiyası nəticəsində baş verir.

Səthinə antigenlərin möhkəm bağlandığı eritrositlərə eritrosit antigen diaqnostikum və ya antigenlə həssaslaşan eritrositlər deyilir.

RNHA-nın başqa bir növü - antikorlar eritrositlərin səthində adsorbsiya olunur və onların sonrakı aglütinasiyası homoloji antigenin iştirakı ilə baş verir. Bu zaman belə eritrositlərə eritrosit anticisim diaqnostikum və ya anticisimlər tərəfindən həssaslaşdırılmış eritrositlər deyilir.

Bu iki fundamental metodoloji yanaşma əsasında RNGA-nın bir çox modifikasiyası hazırlanmış və istifadə olunur. Beləliklə, daşıyıcı kimi kiçik standart lateks hissəcikləri istifadə olunur. Bu halda, reaksiya lateks aglütinasiya reaksiyası (RLA) adlanır və ya qızıl stafilokok istifadə olunur - laxtalanma reaksiyası və s.. Adətən, eritrosit diaqnostikləri bioloji sənaye müəssisələrində hazırlanır və əsas RNGA təcrübəsi artıq diaqnostik laboratoriyalarda qurulur.

Eritrosit diaqnostikumunun hazırlanması aşağıdakı addımları əhatə edir:

• eritrositlərin formaldehid və ya glutar və ya akril aldehidlərlə fiksasiyası. Belə işlənmiş eritrositlər uzun müddət saxlanılır. Bu məqsədlə daha tez-tez qoyunların, insanların, toyuqların və s. eritrositləri istifadə olunur;
• sabit eritrositlərin tanin məhlulu ilə müalicəsi. Nəticədə, eritrositlər öz səthində zülalları (viruslar və antikorlar) geri dönməz şəkildə adsorbsiya edən xüsusiyyət əldə edir;
• tanlaşmış eritrositlərin viruslar və ya antikorlar tərəfindən sensibilizasiyası.

Qeyd etmək lazımdır ki, viral infeksiyalar üçün eritrosit diaqnostikumlarının hazırlanması üsulları fərqlidir.

Antikor titrini aşkar etmək və təyin etmək üçün RNHA-nın qurulması texnikası aşağıdakı kimidir:

• zərdabın ardıcıl 2 qat seyreltilməsinə bərabər dozada antigen tərəfindən həssaslaşdırılmış eritrositlər əlavə edin;
• qarışıq otaq temperaturunda 2-3 saat və ya 4 ° C-də 16-18 saat saxlanılır;
• nəticələri nəzərə alın. Serumda eritrositlərin həssaslaşdığı virusa qarşı antikorlar varsa, çarpazlarla qiymətləndirilir, hemaqlütinasiya müşahidə olunur.

Serum antikor titri hələ də ən azı iki çarpazla hemaqlütinasiyanı təmin edən zərdabın ən yüksək durulması kimi qəbul edilir.

RNGA bütün müvafiq nəzarət vasitələri ilə müşayiət olunur. Adətən mikrometodla reaksiya verirlər.

RNHA aşağıdakı diaqnostik vəzifələri həll etməyə imkan verir:

• məlum eritrosit antigen diaqnostikumundan istifadə edərək antikorları aşkar etmək və onların qan serumunda titrini təyin etmək;
• məlum eritrosit antikor diaqnostikası ilə naməlum virusu aşkar etmək və müəyyən etmək.

RNGA-nın üstünlükləri: yüksək həssaslıq, quraşdırma asanlığı və sürətli cavab. Bununla belə, qeyd etmək lazımdır ki, stabil eritrosit diaqnostikumlarının hazırlanmasında böyük çətinliklər var (istifadə olunan komponentlərin təmizliyindən böyük asılılıq, hər bir virus növü üçün eritrositlərin fiksasiya, tanlaşma və sensibilizasiya rejimini seçmək ehtiyacı). .