DNT polimeraza reaksiyası müsbətdir. PCR analizi: bu nədir? PCR testini necə aparmaq olar. PCR gizli infeksiyaları aşkar etmək üçün əsas üsuldur

Polimeraza zəncirvari reaksiya (PCR)- molekulyar biologiyada DNT fraqmentlərinin bir və ya bir neçə nüsxəsini bir neçə dərəcə artırmaq məqsədi ilə həyata keçirilən, müəyyən bir DNT ardıcıllığının bir neçə mindən milyonlarla nüsxəsini yaratmağa imkan verən biokimyəvi texnologiya üsuludur.

1983-cü ildə Cary Mullis tərəfindən hazırlanmış PCR metodu hazırda bir çox müxtəlif tətbiqlər üçün tibbi və bioloji tədqiqat laboratoriyalarında istifadə edilən ümumi və tez-tez əvəzolunmaz üsuldur. Bunlara ardıcıllıq üçün DNT klonlaşdırılması, DNT əsaslı filogeniya və ya genlərin funksional analizi; irsi xəstəliklərin diaqnozu; genetik barmaq izlərinin identifikasiyası (məhkəmə ekspertizasının sahələrində və atalığın müəyyən edilməsində istifadə olunur), həmçinin yoluxucu xəstəliklərin aşkarlanması və diaqnostikası. 1993-cü ildə Mullis PCR üzərində işlərinə görə Michael Smith ilə birlikdə Kimya üzrə Nobel mükafatına layiq görüldü.

Metod DNT-nin fermentlər tərəfindən denatürasiyası və replikasiyası üçün qızdırma və soyutma reaksiyalarının təkrar dövrlərindən ibarət olan istilik dövrünə əsaslanır. DNT polimeraza ilə birlikdə hədəf ərazini tamamlayan ardıcıllıqları ehtiva edən primerlər (qısa DNT parçaları) seçmə və yenidən gücləndirmə üçün əsas komponentlərdir. PCR prosesində sintez edilmiş DNT-nin özü replikasiya üçün şablon kimi istifadə olunur, şablon DNT-nin eksponent olaraq gücləndirildiyi zəncirvari reaksiyanı hərəkətə gətirir. Geniş spektrli genetik manipulyasiyaları yerinə yetirmək üçün PCR əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirilə bilər.

Demək olar ki, bütün PCR tətbiqləri əvvəlcə bakteriyalardan təcrid olunmuş bir ferment olan Taq polimeraza kimi termostabil DNT polimerazadan istifadə edir. Termusaquaticus. Bu DNT polimeraza fermentativ şəkildə DNT-nin tikinti bloklarından - nukleotidlərdən yeni DNT zəncirini yığır, bir zəncirli DNT-dən şablon kimi istifadə edir və DNT sintezini başlatmaq üçün lazım olan DNT oliqonukleotidlərindən (həmçinin DNT primerləri adlanır) istifadə edir. PCR üsullarının böyük əksəriyyəti istilik dövriyyəsindən, yəni müəyyən bir sıra temperatur addımları üzərində PCR nümunəsinin alternativ qızdırılması və soyudulmasından istifadə edir. DNT denaturasiyası adlanan prosesdə yüksək temperaturda DNT cüt spiralının iki zəncirini fiziki olaraq ayırmaq üçün ilk növbədə bu istilik dövriyyəsi addımları tələb olunur. Daha aşağı temperaturda, hər bir zəncir hədəf DNT bölgəsini seçici şəkildə gücləndirmək üçün DNT polimeraza tərəfindən DNT sintezində şablon kimi istifadə ediləcək. Müəyyən istilik dövriyyəsi şəraitində gücləndirmə üçün hədəf DNT bölgəsinə tamamlayıcı olan primerlərdən istifadə edərək PCR nəticələrinin seçiciliyi.

PCR diaqnostikasının prinsipləri

PCR bir DNT zəncirinin (hədəf DNT) müəyyən bir hissəsini gücləndirmək üçün istifadə olunur. Əksər PCR üsulları adətən DNT fraqmentlərini ~ 10.000 baza cütü (kb) qədər gücləndirir, baxmayaraq ki, bəzi üsullar fraqmentləri 40 kb-a qədər ölçməyə imkan verir. Reaksiya məhdud miqdarda son gücləndirilmiş məhsul istehsal edir ki, bu da reaksiya məhsullarının reaksiyasında və əks əlaqədə olan mövcud reagentlər tərəfindən idarə olunur.

Əsas PCR dəsti bir neçə komponent və reagent tələb edir. Bunlara daxildir:

• DNT şablonu, gücləndiriləcək hədəf DNT bölgəsini ehtiva edir.
• iki primer, hədəf DNT-nin hiss və antisens zəncirlərinin hər birinin 3' uclarını tamamlayır.
• Taq polimeraza və ya təxminən 70°C optimal temperaturda işləyən başqa bir DNT polimerazı.
• Deoksinukleozid trifosfatlar(dNTPs; tərkibində nukleotidlər olan trifosfat qrupları), DNT polimerazanın yeni DNT zəncirini sintez etdiyi tikinti blokları.
• tampon həlli, DNT polimerazanın optimal fəaliyyəti və sabitliyi üçün uyğun kimyəvi şəraitin təmin edilməsi.
• ikivalentli kationlar, maqnezium və ya manqan ionları; Mg2+ tez-tez istifadə olunur, lakin Mn2+ həm də PCR vasitəsi ilə DNT mutagenezi üçün istifadə edilə bilər, çünki daha yüksək Mn2+ konsentrasiyası DNT sintezi zamanı xəta dərəcəsini artırır.
• Monovalent kationlar kalium ionları.

PCR adətən 10-200 µl reaksiya həcmində kiçik reaksiya borularında (həcmi 0,2-0,5 ml) termal siklator-gücləndiricidə aparılır. Reaksiyanın hər bir mərhələsi üçün tələb olunan temperatura nail olmaq üçün siklator reaksiya borularını qızdırır və soyuyur. Bir çox müasir velosipedçilər Peltier effektindən istifadə edirlər ki, bu da sadəcə elektrik cərəyanının istiqamətini tərsinə çevirməklə PCR boru qurğusunu qızdırmağa və soyutmağa imkan verir. Nazik divarlı reaksiya boruları sürətli istilik tarazlığını təmin etmək üçün əlverişli istilik keçiriciliyinə kömək edir. Qızdırılmış qapağı olmayan köhnə dövranlar, reaksiya qarışığının səthində yağ təbəqəsi və ya bir flakonda bir mum muncuq tələb edir.

Prosedur qaydası

Tipik olaraq, PCR, dövr adlanan 20-40 təkrarlanan temperatur dəyişikliyindən ibarətdir və hər bir dövr adətən 2-3 diskret temperatur addımından, adətən üçdən ibarətdir. Velosiped tez-tez bir temperatur addımı ilə başlayır və bitir (sözdə intizar) məhsulun son genişlənməsi və ya qısa müddətə saxlanması üçün yüksək temperaturda (> 90 ° C). İstifadə olunan temperaturlar və onların hər bir dövrədə tətbiq müddəti bir çox parametrlərdən asılıdır. Bunlara DNT sintezi üçün istifadə olunan ferment, reaksiyada ikivalentli ionların və dNTP-lərin konsentrasiyası və primerlərin ərimə nöqtəsi (Tm) daxildir.

• Başlanğıc mərhələsi: Bu addım reaksiyanın 94-96°C temperatura (və ya yüksək istilik davamlı polimerazalardan istifadə olunarsa 98°C) qədər qızdırılmasından ibarətdir ki, bu da 1-9 dəqiqə ərzində aparılır. Addım yalnız isti başlanğıc PCR adlanan istilik aktivləşdirilməsini tələb edən DNT polimerazları üçün tələb olunur.
• Denatürasiya mərhələsi: Bu, ilk müntəzəm termal velosiped hadisəsidir və reaksiyanın 20-30 saniyə ərzində 94-98°C-ə qədər qızdırılmasından ibarətdir. Bu, tamamlayıcı əsaslar arasında hidrogen bağlarının məhv edilməsi və tək zəncirli DNT molekullarının meydana gəlməsi ilə DNT şablonunun parçalanmasına səbəb olur.
• Təmizləmə mərhələsi: Reaksiya temperaturu 20-40 saniyə ərzində 50-65°C-ə endirilir ki, bu da primerlərin tək zəncirli DNT şablonuna bağlanmasına imkan verir. Tipik olaraq yumşalma temperaturu istifadə olunan primerlərin Tm-dən təxminən 3-5 dərəcə aşağıdır. Stabil DNT-DNT hidrogen bağları yalnız primer ardıcıllığı ardıcıllıq şablonu ilə daha sıx uyğunlaşdıqda yaranır. Polimeraza primer-şablon hibridinə bağlanır və DNT sintezini başlayır.
• Genişlənmə / uzanma mərhələsi: Bu addım zamanı temperatur istifadə olunan DNT polimerazından asılıdır; Taq polimeraza 75-80°C-də optimal aktivlik temperaturuna malikdir; Bu ferment üçün adətən 72°C temperaturdan istifadə edilir. Bu mərhələdə DNT polimeraza 5"-3" istiqamətində şablona tamamlayıcı olan dNTP-ləri əlavə edərək, dNTP-nin 5"-fosfat qrupunu 3"- ilə birləşdirərək, DNT şablon zəncirini tamamlayan yeni DNT zəncirini sintez edir. meydana gələn (genişləyən) DNT-nin sonunda hidroksil qrupu. Genişlənmə müddəti həm istifadə olunan DNT polimerazından, həm də gücləndiriləcək DNT fraqmentinin uzunluğundan asılıdır. Tipik olaraq, optimal temperaturda DNT polimeraza dəqiqədə min əsası polimerləşdirir. Optimal şəraitdə, yəni. məhdudlaşdırıcı substratlara və ya reagentlərə görə məhdudiyyətlər olmadıqda, hər genişlənmə mərhələsində hədəf DNT-nin miqdarı ikiqat artır və nəticədə DNT fraqmentinin eksponensial (həndəsi) gücləndirilməsi baş verir.
• Son uzadılması: Bu, qalan tək zəncirli DNT-nin tam uzanmasını təmin etmək üçün son PCR dövründən sonra bəzən 70-74°C-də 5-15 dəqiqə ərzində həyata keçirilən yeganə addımdır.
• Son gözlənti: 4-15 °C-də olan bu addım, reaksiyanı qısa saxlamaq üçün qeyri-müəyyən müddətə istifadə edilə bilər. PCR-in gözlənilən DNT fraqmentini (bəzən "amplimer" və ya "amplikon" kimi də adlandırılır) sintez edib-etmədiyini yoxlamaq üçün PCR məhsullarını ölçüsünə görə ayırmaq üçün agaroz gel elektroforezi istifadə olunur. PCR məhsullarının ölçüsü, PCR məhsulları ilə birlikdə bir gel üzərində aparılan məlum ölçülü DNT fraqmentlərini ehtiva edən DNT nərdivanı (molekulyar çəki markeri) ilə müqayisə edilərək müəyyən edilir.

Polimeraza zəncirvari reaksiyasının mərhələləri

PCR prosesini üç mərhələyə bölmək olar:

1. Eksponensial gücləndirmə: Hər dövr ərzində məhsulun miqdarı iki dəfə artırılır (100% reaksiya səmərəliliyi nəzərə alınmaqla). Reaksiya çox həssasdır: yalnız az miqdarda DNT lazımdır.
2. Düzləşdirmə mərhələsi: reaksiya yavaşlayır, çünki DNT polimeraz fəaliyyətini itirir və dNTP və primerlər kimi reagentlərin istehlakı onların məhdudlaşdırıcı olmasına səbəb olur. .
3. Yayla: Reagentlərin və fermentlərin tükənməsi səbəbindən məhsul artıq yığılmır.

PCR optimallaşdırılması

Təcrübədə PCR müxtəlif səbəblərdən, xüsusən də DNT-nin əlavə məhsullarının gücləndirilməsinə səbəb olan çirklənməyə həssaslığına görə uğursuz ola bilər. Bununla əlaqədar olaraq, PCR şərtlərini optimallaşdırmaq üçün bir sıra texnika və prosedurlar hazırlanmışdır. Xarici DNT çirklənməsi laboratoriya protokolları və potensial DNT çirkləndiricilərinin PCR öncəsi qarışıqlarını təmizləyən prosedurlarla idarə olunur. Bu, adətən, PCR dəstlərinin PCR məhsullarının analiz və ya təmizlənmə sahələrindən ayrılması, birdəfəlik plastik qablardan istifadə edilməsi və reaksiya mərhələləri arasında iş səthinin hərtərəfli təmizlənməsini əhatə edir. Primer dizayn üsulları PCR məhsullarının izolyasiyasının yaxşılaşdırılmasında və əlavə məhsulların əmələ gəlməsinin qarşısını almaqda mühüm rol oynayır və alternativ tampon komponentlərinin və ya polimeraza fermentlərinin istifadəsi uzun və ya başqa problemli DNT bölgələrini gücləndirməyə kömək edə bilər. Bufer sistemlərinə formamid kimi reagentlərin əlavə edilməsi PZR-in spesifikliyini və bərpasını artıra bilər. Nəzəri PCR nəticələrinin kompüter simulyasiyası (elektron PCR) primer dizaynına kömək etmək üçün həyata keçirilə bilər.

PCR tətbiqi

Selektiv DNT izolyasiyası

PCR, müəyyən bir DNT bölgəsinin seçici gücləndirilməsi ilə DNT fraqmentlərinin genomik DNT-dən təcrid olunmasına imkan verir. PCR-nin bu tətbiqi, DNT-nin müəyyən bir bölgəsini təmsil edən böyük miqdarda DNT tələb edən Cənubi və ya Şimal blotlama və DNT klonlama üsulları üçün hibridləşdirmə zondlarının yaradılması kimi bir çox metodları tamamlayır. PCR bu üsulları yüksək miqdarda təmiz DNT ilə təmin edir ki, bu da az miqdarda başlanğıc materialla belə DNT nümunələrinin təhlilinə imkan verir.

PCR-nin digər tətbiqlərinə naməlum PCR ilə gücləndirilmiş ardıcıllıqları müəyyən etmək üçün DNT ardıcıllığı daxildir, burada gücləndirici primerlərdən biri Sanger ardıcıllığında istifadə edilə bilər, DNT ardıcıllığının plazmid və ya genetik materiala daxil edilməsini əhatə edən rekombinant DNT texnologiyalarını sürətləndirmək üçün DNT ardıcıllığının təcrid edilməsi. başqa bir orqanizmin. Bakteriya koloniyaları (E. coli) vektor DNT dizaynını düzəltmək üçün PCR ilə sürətlə yoxlanıla bilər. PCR genetik barmaq izi üçün də istifadə edilə bilər; müxtəlif PCR üsullarından istifadə edərək eksperimental DNT-ni müqayisə edərək bir insanı və ya orqanizmi müəyyən etmək üçün məhkəmə tibbdə istifadə olunan texnika.

Bəzi "barmaq izi" PCR üsulları yüksək ayrı-seçkilik gücünə malikdir və valideyn-uşaq və ya bacı-qardaş kimi fərdlər arasında genetik əlaqələri müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər və atalıq testində istifadə olunur. Bu texnika orqanizmlər arasındakı təkamül əlaqələrini müəyyən etmək üçün də tətbiq oluna bilər.

DNT amplifikasiyası və kəmiyyəti

PCR hədəf DNT bölgələrinin nüsxə sayını artırdığından, PCR çox az miqdarda nümunəni təhlil etmək üçün istifadə edilə bilər. Bu, çox vaxt sübut kimi yalnız iz miqdarda DNT-nin mövcud olduğu məhkəmə-tibbi araşdırmalar üçün vacibdir. PCR həm də on minlərlə il yaşı olan qədim DNT-ni təhlil etmək üçün istifadə edilə bilər. Bu PCR üsulları 40.000 illik mamont kimi heyvanlarda, eləcə də insan DNT-sində Misir mumiyalarının təhlilindən tutmuş rus çarının şəxsiyyətinin müəyyən edilməsinə qədər müxtəlif tətbiqlərdə uğurla istifadə edilmişdir.

Kəmiyyət PCR üsulları nümunədə mövcud olan müəyyən ardıcıllığın miqdarını təxmin edir, bu üsul tez-tez gen ifadə səviyyəsini ölçmək üçün istifadə olunur. Real-time PCR, hər bir PCR gücləndirilməsi dövründən sonra məhsul DNT-nin yığılmasını ölçən müəyyən edilmiş DNT kəmiyyət alətidir.

Xəstəliklərin diaqnostikasında PCR

PCR leykemiya və limfoma kimi bədxassəli xəstəliklərin erkən diaqnostikasına imkan verir ki, bu da hal-hazırda xərçəng tədqiqatlarında yüksək səviyyədə inkişaf etmiş və artıq müntəzəm olaraq istifadə olunur. Digər üsullardan ən azı 10 000 dəfə yüksək həssaslığa malik translokasiyaya xas olan bədxassəli hüceyrələri aşkar etmək üçün birbaşa genomik DNT nümunələri üzərində PCR həyata keçirilə bilər.

PCR həmçinin toxuma mədəniyyətindən və heyvan modellərindən mikobakteriyalar, anaerob bakteriyalar və viruslar kimi becərilməyən və ya yavaş böyüyən orqanizmlərin aşkarlanmasına imkan verir. Mikrobiologiya sahəsində PCR diaqnostik tətbiqləri üçün əsas yoluxucu agentlərin identifikasiyası və spesifik genlərə görə patogen olmayan ştammların patogen olanlardan fərqləndirilməsidir.

Viral DNT də PCR ilə aşkar edilə bilər. Primerlər virusun hədəf DNT ardıcıllığına xas olmalıdır və PCR diaqnostik DNT testləri və ya viral genomun ardıcıllığı üçün istifadə edilə bilər. PCR-nin yüksək həssaslığı virusları infeksiyadan dərhal sonra və hətta xəstəliyin başlanğıcından əvvəl aşkar etməyə imkan verir. Virusun erkən aşkarlanması həkimlərə əhəmiyyətli müalicə variantları verə bilər. Xəstədə virusun miqdarı ("viral yük") kəmiyyət PCR-əsaslı DNT analizi ilə də müəyyən edilə bilər.

Əsas polimeraza zəncirvari reaksiya metodlarında dəyişikliklər

• Allele spesifik PCR: tək nukleotid polimorfizmlərinə (SNPs) əsaslanan diaqnostik və ya klonlama üsulu (DNT-də tək əsas fərqlər). Allellər arasındakı fərqlər də daxil olmaqla DNT ardıcıllığı haqqında qabaqcadan bilik tələb edir və 3' ucları SNP-ləri əhatə edən primerlərdən istifadə edir. Şablon və primer arasında uyğunsuzluq olduqda sərt PCR gücləndirilməsi daha az effektivdir, beləliklə SNP spesifik ilə uğurlu gücləndirmə ardıcıllıqda xüsusi SNP-lərin olması haqqında primer siqnalları.
• PCR montajı və ya polimeraza velosiped qurğusu (PCP): qısa üst-üstə düşən seqmentləri olan uzun oliqonukleotidlər hovuzunda PCR ilə uzun DNT ardıcıllığının süni sintezi. Oliqonukleotidlər mənalı və antisens zəncir istiqamətləri arasında növbələşir və üst-üstə düşən seqmentlər PCR fraqmentlərinin sırasını təyin edir və bununla da seçici şəkildə son uzun DNT məhsulunu yaradır.
• Asimmetrik PCR: ikiqat zəncirli DNT şablonunda bir DNT zəncirini üstünlüklə gücləndirir. İki tamamlayıcı teldən yalnız birinin gücləndirilməsinin tələb olunduğu yerlərdə ardıcıllıq və hibridləşmə zondlamasında istifadə olunur. PCR adi qaydada aparılır, lakin gücləndirmə üçün nəzərdə tutulmuş zəncir üçün primerlərin çoxluğu ilə. Məhdudlaşdırıcı primerdən istifadə edildikdən sonra reaksiyanın sonunda yavaş (arifmetik irəliləyiş) gücləndirilməsi səbəbindən əlavə PCR dövrləri tələb olunur. Bu prosesin "LATE-PCR" (eksponensial fazadan sonrakı xətti - PCR) kimi tanınan ən son modifikasiyası, məhdudlaşdırıcı primerin konsentrasiyası azaldığından reaksiyanın effektivliyini qorumaq üçün primerin artıqlığından daha yüksək ərimə nöqtəsi (Tm) olan məhdudlaşdırıcı primerdən istifadə edir. reaksiyanın ortasında.
• Dial-out PCR: gen sintezi üçün dəqiq DNT molekulları əldə etmək üçün yüksək paralel üsul. DNT molekullarının kompleks hovuzu unikal cinah etiketləri ilə kütləvi paralel ardıcıllığa dəyişdirilir. Etiket yönümlü primerlər daha sonra PCR ilə ardıcıl molekulları təmin edir.
• Helikazdan asılı gücləndirmə:ənənəvi PCR-ə bənzəyir, lakin denatürasiya və tavlama/genişləmə dövrləri vasitəsilə dövriyyədən daha sabit temperatur tələb edir. İstilik denatürasiyası yerinə DNT-ni açan bir ferment olan DNT helikazı istifadə olunur.
• İsti başlanğıc PCR: PCR addımlarının ilkin qurulması zamanı qeyri-spesifik gücləndirməni azaldan texnika. Polimeraza əlavə etməzdən əvvəl reaksiya komponentlərini denatürasiya temperaturuna (məsələn, 95 °C) qızdırmaqla əl ilə edilə bilər. Otaq temperaturunda polimeraza aktivliyini ya anticisimlərin bağlanması yolu ilə, ya da yalnız yüksək temperaturda aktivləşdirmə mərhələsindən sonra dissosiasiya olunan kovalent bağlı inhibitorların iştirakı ilə maneə törədən xüsusi ferment sistemləri hazırlanmışdır. İsti başlanğıc/soyuq bitirmə PCR ətraf mühitin temperaturunda qeyri-aktiv olan və uzanma temperaturunda dərhal aktivləşən yeni hibrid polimerazlarla əldə edilir.
• Mikrosatellitlərarası ardıcıllığa spesifik PCR (ISSR): Gücləndirilmiş fraqment uzunluğundan unikal barmaq izini əldə etmək üçün sadə təkrar ardıcıllıqlar arasında bölgələrin surətinin sayını artıran PCR DNT barmaq izi üsulu.
• Ters çevrilmiş PCR genomik əlavələr ətrafında ardıcıllıq bölgələrini təyin etmək üçün geniş istifadə olunur. Bu, naməlum ardıcıllığın hər iki ucunda məlum ardıcıllıqla nəticələnən bir sıra DNT parçalanmalarını və özünü bağlamanı əhatə edir.
• Bağlama ilə vasitəçilik edilən PCR: Maraqlanan DNT ilə əlaqəli kiçik DNT bağlayıcılarından və DNT bağlayıcıları ilə əlaqəli bir neçə primerdən istifadə edir; DNT ardıcıllığı, genom gəzintisi və DNT izi üçün istifadə olunur.
• Metilasiyaya spesifik PCR(MSP): Johns Hopkins Tibb Məktəbində Stephen Bailin və Jim Herman tərəfindən hazırlanmışdır, genomik DNT-də CpG adalarının metilasyonunu aşkar etmək üçün istifadə olunur. DNT əvvəlcə metillənməmiş sitozin əsaslarını PCR primerləri tərəfindən timin kimi tanınan urasilə çevirən natrium bisulfitlə müalicə olunur. Daha sonra primer ardıcıllığında hər hansı CpG adası istisna olmaqla, eyni primerlər dəstlərindən istifadə etməklə dəyişdirilmiş DNT-də iki PCR həyata keçirilir. Bu nöqtələrdə primerlərin bir dəsti metilləşdirilmiş DNT-nin surət sayını artırmaq üçün sitozinlərlə DNT-ni tanıyır və bir dəst metilləşməmiş DNT-ni gücləndirmək üçün urasil və ya timin ilə DNT-ni tanıyır. qPCR-dən istifadə edərək MSP də metilləşmə haqqında keyfiyyət deyil, kəmiyyət məlumatı əldə etmək üçün həyata keçirilə bilər.
• Miniprimer - PCR: 9 və ya 10 nukleotid sayı olan qısa primerlərdən ("smalliqos") uzana bilən termostabil polimerazlar (S-Tbr) istifadə olunur. Bu texnika PCR-ə daha kiçik primerlərlə əlaqəli bölgələri hədəf almağa imkan verir və 16S (və ya eukaryotik 18S) rRNT geni kimi qorunmuş DNT ardıcıllığını gücləndirmək üçün istifadə olunur.
• Multipleks bağlamadan asılı zond gücləndirilməsi (MLPA): yalnız bir cüt primerlə çoxsaylı hədəflərin gücləndirilməsinə imkan verir, beləliklə, multipleks PCR-in ayırdetmə məhdudiyyətlərindən qaçır.
• Multipleks PCR müxtəlif DNT ardıcıllığı üçün spesifik olan müxtəlif ölçülü amplikonları əldə etmək üçün bir PCR qarışığında bir neçə primer dəstindən ibarətdir. Eyni zamanda bir neçə genə fokuslanmaqla, tək bir test zamanı əlavə məlumat əldə etmək mümkündür, əks halda bu, bir neçə dəfə daha çox reagent və tamamlamaq üçün daha çox vaxt tələb edir. Hər bir primer dəsti üçün yumşalma temperaturları bir reaksiya daxilində və amplikon ölçüləri ilə düzgün işləmək üçün optimallaşdırılmalıdır. Yəni, gel elektroforezi ilə vizuallaşdırıldıqda fərqli zolaqlar yaratmaq üçün onların əsas cüt uzunluğu kifayət qədər fərqli olmalıdır.
• Daxili PCR: qeyri-spesifik DNT amplifikasiyasına görə fonu azaldaraq, DNT amplifikasiyasının spesifikliyini artırır. İki ardıcıl PCR-də iki primer dəsti istifadə olunur. Birinci reaksiyada DNT məhsullarını sintez etmək üçün bir cüt primer istifadə olunur ki, bu da nəzərdə tutulan məqsəddən əlavə hələ də qeyri-spesifik gücləndirilmiş DNT fraqmentlərindən ibarət ola bilər. Məhsullar daha sonra bağlanma yerləri birinci reaksiyada istifadə olunan primerlərin hər birinin 3' uclarından tamamilə və ya qismən fərqli olan primer dəsti ilə ikinci PCR-də istifadə olunur.Yuvalanmış PCR çox vaxt uzun DNT fraqmentlərini spesifik olaraq gücləndirməkdə daha uğurlu olur. ənənəvi PCR, lakin hədəf ardıcıllığı haqqında daha ətraflı məlumat tələb edir.
• Üst-üstə düşən uzantıları olan PCR və ya üst-üstə düşən uzantılar ilə birləşdirmə(SOE): Tamamlayıcı ardıcıllığı ehtiva edən iki və ya daha çox DNT parçasını birləşdirmək üçün istifadə olunan genetik mühəndislik texnikası. Ardıcıllığı və ya mutasiyaları tənzimləyən genləri ehtiva edən DNT parçalarını birləşdirmək üçün istifadə olunur; texnika spesifik və uzun DNT konstruksiyalarının yaradılmasına imkan verir.
• Kəmiyyət PCR (QPCR): PCR məhsulunun miqdarını ölçmək üçün istifadə olunur (adətən real vaxtda). DNT, cDNA və ya RNT-nin ilkin miqdarını müəyyən edir. qPCR nümunədə DNT ardıcıllığının mövcudluğunu və nümunədəki surət nömrəsini müəyyən etmək üçün geniş istifadə olunur. Real vaxtda kəmiyyət PCR çox yüksək dəqiqliyə malikdir. QRT-PCR (və ya QF-PCR) üsulları real vaxtda gücləndirilmiş məhsulun miqdarını ölçmək üçün Sybr Green, EvaGreen kimi flüoresan boyalardan və ya TaqMan kimi florofor tərkibli DNT zondlarından istifadə edir. Bəzən RT-PCR (real-time PCR) və ya RQ-PCR kimi istinad edilir. QRT-PCR və ya RTQ-PCR daha uyğun abbreviaturalardır, çünki RT-PCR adətən qPCR ilə birlikdə tez-tez istifadə olunan tərs transkripsiya PCR-ə aiddir.
• Əks transkripsiya PCR (RT-PCR): RNT-dən DNT-nin surət sayını artırmaq. Əks transkriptaza RNT-ni cDNA-ya transkripsiya edir, sonra PCR ilə gücləndirilir. RT-PCR, gen ifadəsini aşkar etmək və ya transkripsiyanın başlanğıc və dayanma yerləri daxil olmaqla, RNT transkriptinin ardıcıllığını müəyyən etmək üçün ifadə profilində geniş istifadə olunur. Bir genin genomik DNT ardıcıllığı məlumdursa, RT-PCR gendəki ekzonların və intronların yerini xəritələşdirmək üçün istifadə edilə bilər. Bir genin 5' ucu (transkripsiyanın başlanğıc sahəsinə uyğundur) adətən RACE-PCR (cDNA uclarının sürətli gücləndirilməsi) ilə müəyyən edilir.
• bərk fazalı PCR: "Polonia Amplification" (məsələn, gel matrisində koloniyaların PCR-si hazırlanır), "Körpü PCR" (primerlər bərk dayaq səthinə kovalent bağlanır), ənənəvi bərk fazalı PZR (burada "asimmetrik PCR" sulu primerlərdən birinə uyğun gələn ardıcıllıqla möhkəm dayağı olan primerlərin və gücləndirilmiş bərk fazalı PZR-nin (burada adi bərk fazalı PCR yüksək Tm və yuvalanmış bərk dəstəkli primerlərdən istifadə etməklə təkmilləşdirilə bilər) mövcudluğunda istifadə olunur. möhkəm dəstəyi ilə primerlərin meydana gəlməsini təşviq etmək üçün termal "addım" tətbiq etmək seçimi).
• Termal Asimmetrik Interleaved PCR (TAIL-PCR): məlum ardıcıllıqdan sonra naməlum ardıcıllığı təcrid etmək üçün istifadə olunur. Məlum ardıcıllıqla, TAIL-PCR müxtəlif tavlama temperaturu ilə iç içə bir cüt primerdən istifadə edir; primer degenerat naməlum ardıcıllıqdan fərqli bir istiqamətdə gücləndirmək üçün istifadə olunur.
• Touchdown PCR (Step PCR): PCR dövrləri irəlilədikcə tavlama temperaturunu tədricən aşağı salmaqla qeyri-spesifik fonu azaltmağa yönəlmiş PCR variantı. İlkin dövrlərdə yumşalma temperaturu adətən istifadə olunan primerlərin Tm-dən bir neçə dərəcə (3-5°C) yuxarı olur, sonrakı dövrlərdə isə temperatur Tm-dən bir neçə dərəcə (3-5°C) aşağı olur. primerlər. Daha yüksək temperaturlar primerin bağlanması üçün daha çox spesifiklik verir və aşağı temperaturlar ilkin dövrlərdə yaranan xüsusi məhsullardan daha səmərəli gücləndirməyə imkan verir.
• PAN-AC: Gücləndirmə üçün izotermik şərtlərdən istifadə edir və canlı hüceyrələrə tətbiq oluna bilər.
• Genomda universal sürətli gəzinti: mexanizmə görə ənənəvi “birtərəfli” yanaşmalardan (yalnız bir gen spesifik primer və bir ümumi primerdən istifadə etməklə) daha spesifik “ikitərəfli” PCR istifadə edərək genom gəzintisi və genetik barmaq izi üçün. , o cümlədən kəmənd strukturunun formalaşması. UFW-nin sadələşdirilmiş törəmələri "Lane RAGE" (genomik DNT uclarının sürətli gücləndirilməsi üçün kəməndlə yuvalanmış PCR), "5" RACE Lane" və "3" RACE Lane-dir.
• InsilisiumPCR(rəqəmsal PCR, virtual PCR, e-PCR, e-PCR) ardıcıl genomdan və ya transkriptomdan DNT ardıcıllığını gücləndirmək üçün verilmiş primerlər dəstindən (zondlardan) istifadə edərək nəzəri polimeraza zəncirvari reaksiyasının nəticələrini hesablamaq üçün istifadə edilən hesablama vasitələrinə aiddir.

PCR tarixi

1971-ci ildə Journal of Molecular Biology məqaləsində Kleppe və başqaları ilk dəfə in vitro şəraitdə primerlərlə qısa DNT şablonunu təkrarlamaq üçün enzimatik analizdən istifadə edən metodu təsvir etmişlər. Bununla belə, PCR-nin əsas prinsipinin bu erkən təzahürü çox diqqət çəkmədi və 1983-cü ildə polimeraza zəncirvari reaksiyanın ixtirası ümumiyyətlə Keri Mullisə aiddir.

Mullis 1983-cü ildə PCR-ni inkişaf etdirərkən, o, ilk biotexnoloji şirkət olan Cetus Corporation üçün Kaliforniyanın Emeryville şəhərində işləyirdi. Orada qısa DNT zəncirlərinin sintezindən məsul idi. Mullis bir gecə öz maşını ilə Sakit okean sahili şossesi ilə hərəkət edərkən PCR-ni düşündüyünü yazdı. O, DNT polimerazanın səbəb olduğu təkrarlanan təkrar dövrlər vasitəsilə DNT-nin hər hansı bir hissəsinin surətinin sayını artırmaq üçün bir üsul icad etdiyini başa düşdükdə, DNT-dəki dəyişiklikləri (mutasiyaları) təhlil etmək üçün ağlında yeni bir üsul oynadı. Scientific American jurnalında Mullis proseduru ümumiləşdirir: “DNT genetik materialının tək bir molekulundan başlayaraq, PCR bir gündə 100 milyard belə molekul yarada bilər. Bu reaksiyanı yerinə yetirmək asandır. Bunun üçün yalnız sınaq borusu, bir neçə sadə reagent və istilik mənbəyi tələb olunur”. 1993-cü ildə ixtirasına görə kimya üzrə Nobel mükafatına layiq görüldü, yeddi il sonra o və Cetusdakı həmkarları təklifini ilk dəfə tətbiq etdikdən sonra. Bununla belə, Mullisin işinə digər alimlərin intellektual və praktik töhfələri və onun PCR prinsipinin yeganə ixtiraçısı olub-olmaması ilə bağlı bəzi mübahisələr qalmaqdadır.

PCR metodu hər replikasiya dövründən sonra DNT ikiqat sarmalında DNT-nin iki zəncirini parçalamaq üçün tələb olunan >90°C (194°F) yüksək temperaturlara tab gətirə bilən uyğun DNT polimerazanın istifadəsinə əsaslanır. Əvvəlcə in vitro eksperimentlər üçün istifadə edilən və PZR ilə proqnozlaşdırılan DNT polimerazları belə yüksək temperaturlara tab gətirə bilmədilər. Buna görə də, erkən DNT replikasiya prosedurları çox səmərəsiz və vaxt aparan idi və proses boyu böyük miqdarda DNT polimeraza və davamlı emal tələb edirdi.

1976-cı ildə termofilik bakteriyadan təcrid olunmuş DNT polimerazı olan Taq polimerazanın kəşfi, Termusaquaticus, təbii olaraq isti bulaqlar kimi isti (50 ilə 80°C (122 ilə 176°F)) mühitlərdə yaşayan, PCR metodunda dramatik təkmilləşdirməyə yol açdı. DNT polimerazadan təcrid olunmuşdur T.Aquaticus, yüksək temperaturda sabitdir və hətta DNT denaturasiyasından sonra da aktiv qalır, beləliklə, hər sikldən sonra yeni DNT polimerazalarının əlavə edilməsi ehtiyacını aradan qaldırır. Bu, termal siklator əsasında DNT-nin gücləndirilməsi prosesini avtomatlaşdırmağa imkan verdi.

Patent müharibələri

Təklif olunan PCR metodu Carey Mullis tərəfindən patentləşdirilmiş və Mullisin 1983-cü ildə texnikanı icad etdiyi zaman işlədiyi Cetus Korporasiyasına verilmişdir. Taq polimeraza fermenti də patentlərlə qorunur. Metodologiya ilə bağlı bir neçə yüksək səviyyəli məhkəmə çəkişmələri, o cümlədən DuPont tərəfindən açılmış uğursuz məhkəmə prosesi olmuşdur. Hoffmann-La Roche əczaçılıq şirkəti patentlərin hüquqlarını 1992-ci ildə əldə etdi və hazırda qorunan patentlərə sahibdir.

Roche və Promega arasında dünyanın bəzi yurisdiksiyalarında Taq polimeraza fermenti üzərində oxşar patent döyüşü hələ də davam edir. Hüquqi arqumentlər 28 mart 2005-ci ildə bitmiş orijinal PCR və Taq polimeraza patentlərinin şərtlərindən kənara çıxdı.

Polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) irsi patologiyaların, infeksiyaların, viral xəstəliklərin istənilən mərhələdə (kəskin və ya xroniki) diaqnostikası sahəsində, həmçinin - erkən mərhələdə - patogenləri müəyyən etməklə xəstəliyin aşkar təzahürlərindən əvvəl diaqnostika sahəsində yüksək dəqiqlikli bir üsuldur. Xəstədən alınan nümunələrdə genetik material olan DNT, RNT əsasında. Və bu gün biz polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) üsullarının mahiyyəti, diaqnostik mərhələləri və prinsipləri, eləcə də onun dəyəri haqqında danışacağıq.

Polimeraza zəncirvari reaksiya nədir

Təhlilin əsasını gücləndirmə (ikiqat) - insanın genetik kompleksini təmsil edən DNT-nin (dezoksiribonuklein turşusu) qısa bir hissəsindən çoxlu nüsxələrin yaradılmasıdır. Tədqiqat üçün çox az miqdarda fizioloji maddələr (bəlğəm, nəcis, epiteliya qırıntıları, prostat şirəsi, qan, sperma, amniotik maye, selik, plasenta toxuması, sidik, tüpürcək, plevral maye, serebrospinal maye) tələb olunur. Belə olan halda, məsələn, xəstənin sidik-cinsiyyət sistemində hətta tək bir zərərli mikrob aşkarlana bilər.

PCR texnikası (polimeraza zəncirvari reaksiya) 1993-cü ildə Nobel mükafatı almış amerikalı alim K. Mullis tərəfindən hazırlanmışdır.

Aktiv istifadə olunur:

• infeksiyaların erkən diaqnozunda, genetik,;
• tədqiqat üçün son dərəcə az miqdarda DNT olduqda məhkəmə tibbi ekspertizasında;
• baytarlıq, əczaçılıq, biologiya, molekulyar genetika;
• şəxsin DNT ilə eyniləşdirilməsi, atalığın təsdiqi üçün;
• paleontologiya, antropologiya, ekologiya (məhsulların keyfiyyətini, ətraf mühit amillərini izləyərkən).

Bu video sizə polimeraza zəncirvari reaksiyasının nə olduğunu izah edəcək:

Kimə tapşırılıb

Yoluxucu xəstəliklərin diaqnostikasında polimeraza zəncirvari reaksiya yüksək dəqiqlik və etibarlılığın ən etibarlı üsullarından biridir. Məsələn, xlamidiya və bir çox digər patogenlər üçün PCR analizinin etibarlılığı 100% (mütləq) yaxınlaşır. Çox vaxt polimeraza zəncirvari reaksiya proseduru diaqnoz qoyarkən müəyyən bir patogeni müəyyən etməkdə çətinlik çəkən xəstələrə təyin edilir.

Laborator PCR testindən istifadə olunur:

• sidik və cinsiyyət orqanlarının infeksiyasına səbəb olan, bitkilərdən və ya immunoloji üsullardan istifadə etməklə müəyyən edilməsi çətin olan patogenləri aşkar etmək;
• ilkin təhlilin müsbət, lakin şübhəli nəticəsi olduqda (məsələn, QİÇS-ə yoluxmuş valideynlərdən yeni doğulmuş uşaqlarda) ilkin mərhələdə HİV-in yenidən diaqnozu üçün;
• erkən mərhələdə onkoloji xəstəliyin müəyyən edilməsi (onkogen mutasiyaların öyrənilməsi) və müəyyən bir xəstə üçün müalicə rejiminin fərdi korreksiyası;
• irsi patologiyaların erkən aşkarlanması və potensial müalicəsi məqsədi ilə.

Beləliklə, gələcək valideynlər genetik patologiyanın daşıyıcısı olub-olmadığını öyrənmək üçün sınaqdan keçirilir, uşaqlarda PCR irsi xəstəliyə məruz qalma ehtimalını müəyyən edir.

• hamiləliyin erkən mərhələsində fetal patologiyaları aşkar etmək (böyüyən bir embrionun fərdi hüceyrələri mümkün mutasiyalar üçün araşdırılır);
• orqan transplantasiyasına qədər xəstələrdə - "toxuma tipləşdirilməsi" üçün (toxuma uyğunluğunun müəyyən edilməsi);
• donor qanda təhlükəli patogen orqanizmləri aşkar etmək;
• yeni doğulmuş körpələrdə - gizli infeksiyaları aşkar etmək üçün;
• antiviral və antimikrobiyal müalicənin nəticələrini qiymətləndirmək.

Niyə bu prosedurdan keçir?

PCR, demək olar ki, 100% nəticə verən yüksək effektiv diaqnostik üsul olduğundan, prosedurdan istifadə olunur:

• son diaqnozu təsdiqləmək və ya istisna etmək;
• terapiyanın effektivliyinin sürətli qiymətləndirilməsi.

Bir çox hallarda, digər bakterioloji, immunoloji və virusoloji diaqnostika üsulları faydasız olduqda, inkişaf etməkdə olan xəstəliyi aşkar etmək üçün PCR yeganə mümkün testdir.

• Viruslar infeksiyadan dərhal sonra və xəstəlik əlamətləri görünməzdən əvvəl PCR ilə aşkar edilir. Virusun erkən aşkarlanması vaxtında müalicəyə imkan verir.
• Sözdə "viral yük" (və ya bədəndəki virusların sayı) kəmiyyət DNT analizi ilə də müəyyən edilir.
• Spesifik patogenlər (məsələn, Koch vərəm çöpü) çətin və çox uzun müddət yetişdirilir. PCR təhlili tədqiqat üçün əlverişli olan nümunələrdə patogenlərin minimum sayını (canlı və ölü) tez müəyyən etməyə imkan verir.

Ətraflı patogen DNT analizi istifadə olunur:

• dərhal müalicəyə başlamağa imkan verən xüsusi növ antibiotiklərə həssaslığını müəyyən etmək;
• ev, vəhşi heyvanlar arasında epidemiyaların yayılmasına nəzarət etmək;
• əvvəlki epidemiyaları gücləndirmiş yeni yoluxucu mikrob növlərini və patogen alt növlərini müəyyən etmək və izləmək.

Diaqnostika növləri

Standart Metod

Polimeraza zəncirvari reaksiyasının təhlili xüsusi primer fermentlərdən istifadə edərək xüsusi DNT və RNT fraqmentinin çoxsaylı gücləndirilməsi (ikiqat) əsasında həyata keçirilir. Kopyalama zənciri nəticəsində tədqiqat üçün kifayət qədər miqdarda material alınır.

Prosedur zamanı nümunədə həqiqətən mövcud olsa belə, yalnız istədiyiniz fraqment kopyalanır (müəyyən edilmiş xüsusi şərtlərə uyğundur).

Faydalı diaqramları olan bu ətraflı video PCR-nin necə işlədiyini izah edir:

Digər üsullar

• Real vaxtda PCR. Bu tip tədqiqatlarda verilmiş DNT fraqmentinin identifikasiyası prosesi 30-40 sikldən ibarət bütün zəncir tamamlandıqdan sonra deyil, hər sikldən sonra başlayır. Bu tip tədqiqat orqanizmdə patogenin (virus və ya mikrobun) miqdarı haqqında məlumat əldə etməyə, yəni kəmiyyət təhlilini aparmağa imkan verir.
• RT-PCR (əks transkripsiya rejimi). Bu analiz genetik bazası RNT olan virusları (məsələn, hepatit C virusu, immun çatışmazlığı virusu) aşkar etmək üçün tək zəncirli RNT tapmaq üçün istifadə olunur. Belə bir araşdırmada xüsusi bir ferment istifadə olunur - əks transkriptaza və müəyyən bir primer və RNT əsasında tək zəncirli DNT qurulur. Sonra bu zəncirdən ikinci DNT zəncirinin bərpası aparılır və standart prosedur yerinə yetirilir.

Tutma üçün göstərişlər

PCR proseduru yoluxucu xəstəliklər, neonatologiya, mamalıq, pediatriya, urologiya, ginekologiya, venerologiya, nevrologiya, nefrologiya, oftalmologiya klinikalarında istifadə olunur.

Təhlilin məqsədi üçün göstərişlər:

• irsi patologiyaların olma ehtimalı olan bir uşaqda genetik anormallıqların inkişaf riskinin aydınlaşdırılması;
• hamiləliyin planlaşdırılması zamanı hər iki valideynə və ya davam edən hamiləlik zamanı ananın ciddi vəziyyətinin diaqnozu;
• konsepsiya ilə bağlı çətinliklər, sonsuzluğun səbəblərini müəyyən etmək;
• kəskin mərhələdə cinsi infeksiyalara şübhə və onların xroniki hala keçmə əlamətləri ilə;
• qeyri-müəyyən mənşəli iltihablı proseslərin səbəblərini aşkar etmək;
• qorunmayan təsadüfi və daimi cinsi əlaqə;
• patogen mikroorqanizmin spesifik antibiotiklərə həssaslığının müəyyən edilməsi;
• aşkar simptomlar inkişaf etməzdən əvvəl patogenləri aşkar etmək üçün gizli infeksiya şübhəsi olan xəstələr (klinikadan əvvəlki diaqnoz);
• xəstələrin xəstəlikdən sonra sağalmasını təsdiqləmək üçün (retrospektiv diaqnoz);

Diaqnostika aşağıdakı patogenləri dəqiq müəyyən etmək lazım olduqda da istifadə olunur:

• hepatit virusları (A B C G), insanın immun çatışmazlığı, sitomeqalovirus;
• vibrio vəba;
• herpes simplex virusu, herpetiform növlər;
• retro - adeno - və rinoviruslar;
• məxmərək virusları, Epstein-Barr, suçiçəyi (Zoster - virus);
• parvo və pikornaviruslar;
• Helicobacter pylori bakteriyası;
• legionella, Escherichia coli-nin patogen növləri;
• staphylococcus aureus;
• patogen;
• Clostridia, difteria və Haemophilus influenzae;

O, həmçinin infeksiyaları müəyyən etmək üçün istifadə olunur:

• yoluxucu mononükleoz;
• borrelioz, listerioz, gənə ensefaliti;
• Candida göbələklərinin səbəb olduğu kandidoz;
• cinsi infeksiyalar - trichomoniasis, ureaplasmosis, solğun treponema, gardnerellosis, gonoreya, mikoplazmoz, xlamidiya;
• vərəm.

Tutma üçün əks göstərişlər

Prosedura xəstə ilə deyil, bədənə heç bir təsir göstərmədən, lakin tədqiqat üçün götürülmüş bioloji materialla aparıldığından, potensial təhlükə olmadığı üçün PCR üçün heç bir əks göstəriş yoxdur.

Bununla belə, kolposkopiya prosedurundan sonra uterusun servikal kanalından biomaterial nümunəsi aparılmır. Smearların, analiz üçün qırıntıların çatdırılmasına menstruasiya bitdikdən və axıdmanın tamamilə dayandırılmasından yalnız 4-6 gün sonra icazə verilir.

Metod təhlükəsizdir

Laboratoriyada onun biomaterialının təcrid olunmuş tədqiqatında xəstəyə heç bir mənfi təsir mümkün deyil.

Prosedur üçün hazırlıq (analiz üçün bioloji maddələrin çatdırılması)

Xarici patogenin DNT-sinin aşkar edildiyi PCR analizi üçün nümunə olaraq hər hansı bioloji maye, toxuma, bədən sekresiyaları istifadə olunur. Test maddəsinin nümunəsi damardan qan götürmək, qırtlaqdan, burun boşluğundan, uretradan, plevra boşluğundan, serviksdən qaşınma şəklində həyata keçirilir.

Diaqnostik prosedurdan əvvəl həkim xəstəyə hansı materialın alınacağını izah edir:

1. Cinsi infeksiyalar üçün müayinə zamanı cinsiyyət orqanlarından ifrazat, sidik və sidik kanalından yaxma götürülür.
2. Herpetik infeksiyalar, sitomeqalovirus, mononükleoz üçün analiz edərkən - sidik, analiz üçün boğaz tamponu, hepatit, toksoplazmoz üçün - damardan qan götürürlər.
3. Müxtəlif növlərə diaqnoz qoymaq üçün onurğa beyni mayesi alınır.
4. Pulmonologiyada analiz üçün nümunələr bəlğəm və plevral mayedir.
5. Hamiləlik dövründə mümkün intrauterin infeksiyaların öyrənilməsi zamanı analiz üçün amniotik maye və plasental hüceyrələr istifadə olunur.

Təhlilin etibarlılığı və dəqiqliyi materialı götürərkən şəraitin sterilliyindən asılıdır. PCR testi yüksək həssas olduğundan, test maddənin hər hansı çirklənməsi nəticəni təhrif edə bilər.

Biomaterialın çatdırılması üçün səlahiyyətli hazırlıq xəstələr üçün heç bir çətinlik yaratmır. Müəyyən tövsiyələr var:

• cinsi infeksiyalar üçün analiz edərkən:
  • materialın çatdırılmasından 72 saat əvvəl intim əlaqələri istisna edin;
  • 3 gün ərzində hər hansı bir vaginal məhsuldan istifadə etməyi dayandırın;
  • əvvəlki günün axşam saatlarından etibarən tədqiq olunan ərazinin gigiyenasını həyata keçirməyin;
  • uretradan nümunə götürərkən 3-4 saat ərzində sidik ifrazını istisna edin;
• infeksiyalar üçün testdən bir ay əvvəl antibiotik qəbul etməyi dayandırın;
• səhər yeməkdən və içmədən əvvəl qan vermək;
• sidiyin ilk səhər hissəsinin toplanması hərtərəfli intim tualetdən sonra steril bir qabda aparılır.

Polimeraza zəncirvari reaksiya metodundan istifadə edərək diaqnostikanın necə aparıldığı haqqında daha çox oxuyun.

Prosedur necədir

Reaktorda (gücləndirici və ya istilik dövrəçi) dəfələrlə PCR tədqiqatı apararkən müəyyən dövrlər təkrarlanır:

1. İlk addım denatürasiyadır. Patogenin DNT (və ya RNT) olması şübhə doğuran tüpürcək, qan, biopsiya, ginekoloji nümunələr, bəlğəm gücləndiriciyə yerləşdirilir, burada material qızdırılır və DNT iki ayrı zəncirə bölünür.
2. İkinci addım materialın tavlanması və ya bir qədər soyudulmasıdır. və ona DNT molekulunda arzu olunan bölmələri tanıyan və onlara bağlana bilən primerlərin əlavə edilməsi.
3. Üçüncü addım uzanmadır- DNT zəncirlərinin hər birinə 2 primer əlavə edildikdən sonra baş verir. Proses zamanı patogenin DNT fraqmenti tamamlanır və onun surəti əmələ gəlir.

Bu dövrlər "zəncirvari reaksiya" kimi təkrarlanır, hər dəfə konkret DNT fraqmentinin (məsələn, müəyyən virusun proqramlaşdırıldığı seqment) nüsxələrinin ikiqat artmasına gətirib çıxarır. Bir neçə saat ərzində DNT fraqmentinin çoxlu nüsxəsi əmələ gəlir və onların nümunədə olması aşkarlanır. Bundan sonra, infeksiyanın növünü müəyyən etmək üçün nəticələr təhlil edilir və müxtəlif növ patogenlərin məlumat bazası ilə müqayisə edilir.

Nəticələrin təfsiri və PCR reaksiyasına əsaslanan nəticə haqqında aşağıda oxuyun.

Nəticələrin deşifr edilməsi

Tədqiqatın yekun nəticəsi bioloji materialın çatdırılmasından 1-2 gün sonra verilir. Tez-tez - artıq analizdən sonra ilk gündə.

Keyfiyyət təhlili

• Mənfi nəticə o deməkdir ki, tədqiqat üçün təqdim edilən maddədə yoluxucu agentlərin izləri aşkar edilməyib.
• Müsbət nəticə təqdim zamanı çox yüksək dəqiqliklə bioloji nümunədə patogen virusların və ya bakteriyaların aşkar edilməsi deməkdir.

Nəticə müsbət olarsa, lakin infeksiyanın aktivləşməsi əlamətləri yoxdursa, bədənin bu vəziyyəti asimptomatik "sağlam daşıma" adlanır. Ən tez-tez viral xəstəliklərdə müəyyən bir yerdən (servikal kanal, uretra, ağız boşluğu) biomaterial qəbul edərkən müşahidə olunur. Bu vəziyyətdə müalicə tələb olunmur, lakin daimi tibbi nəzarət lazımdır, çünki bir ehtimal var:

• virusun daşıyıcılardan yayılması və sağlam insanların yoluxması;
• prosesin aktivləşdirilməsi və xəstəliyin xroniki formaya keçməsi.

Ancaq qan testi müsbət olarsa, bu, infeksiyanın bədənə təsir etdiyini göstərir və bu, artıq bir daşıyıcı dövlət deyil, dərhal xüsusi terapiya tələb edən bir patoloji.

Kəmiyyət təhlili

Kəmiyyət nəticəsi, xüsusi bir infeksiya növü üçün mütəxəssis tərəfindən müəyyən edilir. Onun əsasında xəstəliyin inkişaf dərəcəsini, mərhələsini qiymətləndirmək mümkündür ki, bu da vaxtında düzgün müalicəni təyin etməyə imkan verir.

orta qiymət

Polimeraza zəncirvari reaksiyanın aparılması üçün qiymətlər aşağıdakılarla müəyyən edilir: tədqiqat növü, patogenin müəyyən edilməsinin mürəkkəbliyi, bioloji materialın toplanmasının çətinliyi, analiz növü (keyfiyyət və ya kəmiyyət), laboratoriyada qiymət səviyyəsi.

Digər tərəfdən, PCR-nin tədqiqində, bir növ materialı analiz üçün götürərkən bir anda bir neçə patogen aşkar edilə bilər. Bu, digər laboratoriya testlərinə qənaət edir.

Təxminən, rublla PCR analizinin dəyəri:

• gonococcus, gardnerella, trichomonas vaginalis - 180-dən
• chlamydia trachomatis - 190-dan
• papillomavirus - 380-dən 500-ə qədər
• qadınlarda sidik-cinsiyyət traktının biosenozu (mikrofloranın kəmiyyət və keyfiyyətcə qiymətləndirilməsi) - 800-dən.

PCR tədqiqatı ilə bağlı daha faydalı məlumat üçün aşağıdakı videoya baxın:

Nobel mükafatı aldı.

Metoddan istifadənin başlanğıcında, hər qızdırma-soyutma dövründən sonra DNT polimeraza reaksiya qarışığına əlavə edilməli idi, çünki DNT sarmalının zəncirlərini ayırmaq üçün lazım olan yüksək temperaturda təsirsiz hala gətirildi. Reaksiya proseduru nisbətən səmərəsiz idi, çox vaxt və ferment tələb edirdi. 1986-cı ildə polimeraza zəncirvari reaksiya metodu əhəmiyyətli dərəcədə təkmilləşdirilmişdir. Termofil bakteriyaların DNT polimerazalarından istifadə etmək təklif edilmişdir. Bu fermentlər termostabil olduqlarını sübut etdilər və bir çox reaksiya dövrlərinə tab gətirə bildilər. Onların istifadəsi PCR-ni sadələşdirməyə və avtomatlaşdırmağa imkan verdi. İlk termostabil DNT polimerazalarından biri bakteriyalardan təcrid edilmişdir Termus aquaticus və adlandırıldı Taq-polimeraza. Bu polimerazın dezavantajı, səhv bir nukleotidin daxil olma ehtimalının kifayət qədər yüksək olmasıdır, çünki bu fermentdə səhvləri düzəltmə mexanizmləri yoxdur (3" → 5" ekzonükleaz aktivliyi). Polimerazlar pfu və Pwo, arxeylərdən təcrid olunmuş, belə bir mexanizmə malikdir, onların istifadəsi DNT-də mutasiyaların sayını əhəmiyyətli dərəcədə azaldır, lakin onların iş sürəti (prosessuallığı) daha aşağıdır. Taq. Hazırda qarışıqlardan istifadə olunur Taq və pfu həm yüksək polimerləşmə sürətinə, həm də yüksək surət dəqiqliyinə nail olmaq.

Metodun ixtirası zamanı Keri Mullis PCR metodunu patentləşdirən Cetus Korporasiyasında sintetik kimyaçı (o, oliqonukleotidləri sintez etdi, daha sonra genomik DNT ilə hibridləşmə yolu ilə nöqtə mutasiyalarını aşkar etmək üçün istifadə edildi) kimi çalışdı. 1992-ci ildə Cetus metod və istifadə üçün patent hüquqlarını satdı Taq polimeraz şirkəti Hoffman-La Roche 300 milyon dollara. Lakin məlum oldu ki Taq-polimeraza 1980-ci ildə sovet biokimyaçıları A.Kaledin, A.Slyusarenko və S.Qorodetski, həmçinin bu sovet nəşrindən 4 il əvvəl, yəni 1976-cı ildə amerikalı biokimyaçılar Alice Chien, David B. Edqar və Con M. Trela. Bununla əlaqədar Promega (Promega) şirkəti məhkəmədə Roche-ni bu fermentə müstəsna hüquqlardan imtina etməyə məcbur etməyə çalışdı. PCR metodu üçün Amerika patentinin müddəti 2005-ci ilin martında başa çatdı.

PCR aparılması

Metod, süni şəraitdə fermentlərin köməyi ilə müəyyən bir DNT bölgəsinin çoxsaylı seçmə surətinin çıxarılmasına əsaslanır ( in vitro). Bu halda, yalnız göstərilən şərtlərə cavab verən sahə və yalnız tədqiq olunan nümunədə mövcud olduqda kopyalanır. Canlı orqanizmlərdə DNT amplifikasiyasından (replikasiyadan) fərqli olaraq, DNT-nin nisbətən qısa hissələri PCR vasitəsilə gücləndirilir. Adi PCR prosesində replikasiya edilmiş DNT bölgələrinin uzunluğu 3000 baza cütündən (3 kbp) çox deyil. Müxtəlif polimerazaların qarışığının köməyi ilə, əlavələrin istifadəsi ilə və müəyyən şərtlərdə PZR fraqmentinin uzunluğu 20-40 min əsas cütə çata bilər. Bu, hələ də eukaryotik hüceyrənin xromosom DNT-sinin uzunluğundan çox azdır. Məsələn, insan genomu təxminən 3 milyard baza cütü uzunluğundadır.

Reaksiya komponentləri

PCR üçün, ən sadə halda, aşağıdakı komponentlər tələb olunur:

• DNT şablonu, gücləndirilməsi lazım olan DNT bölməsini ehtiva edir.
• İki primer, istənilən DNT fraqmentinin müxtəlif zəncirlərinin əks uclarına tamamlayıcıdır.
• termostabil DNT polimeraza DNT-nin polimerləşməsini kataliz edən fermentdir. PCR-də istifadə üçün polimeraza yüksək temperaturda uzun müddət aktiv qalmalıdır, buna görə də termofillərdən təcrid olunmuş fermentlər istifadə olunur - Termus aquaticus(Taq polimeraza), Pyrococcus furiosus(Pfu polimeraza), Pyrococcus woesei(Pwo-polimeraza) və s.
• Deoksiribonukleozid trifosfatlar(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Polimerazanın işləməsi üçün lazım olan Mg 2+ ionları.
• tampon həlli, lazımi reaksiya şəraitini təmin etmək - pH, məhlulun ion gücü. Tərkibində duzlar, iribuynuzlu serum albumin var.

Reaksiya qarışığının buxarlanmasının qarşısını almaq üçün sınaq borusuna yüksək qaynar yağ, məsələn, vazelin əlavə edilir. Qızdırılan qapaq dövrə cihazı istifadə edilərsə, bu tələb olunmur.

Pirofosfatazanın əlavə edilməsi PCR reaksiyasının məhsuldarlığını artıra bilər. Bu ferment artan DNT zəncirinə nukleotid trifosfatların əlavə məhsulu olan pirofosfatın ortofosfata hidrolizini kataliz edir. Pirofosfat PCR reaksiyasını maneə törədə bilər.

Astarlar

PZR-in spesifikliyi şablon və primerlər, 18-30 əsas uzunluğunda qısa sintetik oliqonukleotidlər arasında tamamlayıcı komplekslərin əmələ gəlməsinə əsaslanır. Astarların hər biri ikiqat zəncirli şablonun zəncirlərindən birinə tamamlayıcıdır və gücləndirilmiş bölgənin başlanğıcını və sonunu məhdudlaşdırır.

Şablonun primerlə hibridləşməsindən (tavlama) sonra, sonuncu şablonun tamamlayıcı zəncirinin sintezində DNT polimeraza üçün primer kimi xidmət edir (bax).

Primerlərin ən mühüm xarakteristikası primer-matris kompleksinin ərimə nöqtəsidir (Tm).

T m, DNT şablonlarının yarısının oliqonukleotid primeri ilə kompleks əmələ gətirdiyi temperaturdur. K + ionlarının və DMSO konsentrasiyasını nəzərə alaraq qısa bir oliqonukleotid (və uzun DNT fraqmentləri üçün) üçün T m hesablanması üçün orta düstur:

burada L primerdəki nukleotidlərin sayı, K + kalium ionlarının molyar konsentrasiyası, G+C bütün guaninlərin və sitozinlərin cəmidir.

Astarın uzunluğu və nukleotid tərkibi və ya yumşalma temperaturu səhv seçilərsə, şablon DNT-nin digər bölgələri ilə qismən tamamlayıcı komplekslərin meydana gəlməsi mümkündür, bu da qeyri-spesifik məhsulların görünüşünə səbəb ola bilər. Ərimə temperaturunun yuxarı həddi 80 °C-dən yuxarı temperaturda aktivliyi azalan polimerazanın optimal təsir temperaturu ilə məhdudlaşır.

Astarları seçərkən aşağıdakı meyarlara riayət etmək arzu edilir:

gücləndirici

düyü. bir: PCR dövranı

PCR gücləndiricidə aparılır - test borularının dövri soyudulması və istiləşməsini təmin edən bir cihaz, adətən ən azı 0,1 ° C dəqiqliklə. Müasir dövranlar kompleks proqramları, o cümlədən "isti başlanğıc", Touchdown PCR (aşağıya bax) və gücləndirilmiş molekulların 4 °C-də sonrakı saxlanmasını təyin etməyə imkan verir. Real vaxt rejimində PCR üçün flüoresan detektorla təchiz edilmiş cihazlar istehsal olunur. Alətlər həmçinin avtomatik qapaq və mikroplata bölməsi ilə mövcuddur ki, bu da onları avtomatlaşdırılmış sistemlərə inteqrasiya etməyə imkan verir.

Reaksiya irəliləyişi

Marker DNT (ilk və son yuvalar) və PCR məhsullarından ibarət gelin fotoşəkili

Adətən, PCR zamanı hər biri üç mərhələdən ibarət olan 20-35 dövr həyata keçirilir (şəkil 2).

Denatürasiya

DNT zəncirlərinin ayrılmasına imkan vermək üçün ikiqat zəncirli DNT şablonu 0,5-2 dəqiqə ərzində 94-96°C-yə (və ya xüsusilə termostabil polimerazadan istifadə olunarsa 98°C) qədər qızdırılır. Bu mərhələ adlanır denaturasiyaçünki DNT-nin iki zəncirindəki hidrogen bağları qırılır. Bəzən, birinci dövrədən əvvəl (polimeraza əlavə etməzdən əvvəl) şablon və primerləri tamamilə denatürasiya etmək üçün reaksiya qarışığı 2-3 dəqiqə əvvəlcədən qızdırılır. Belə bir yanaşma deyilir isti başlanğıc, qeyri-spesifik reaksiya məhsullarının miqdarını azaltmağa imkan verir.

Qızartma

Tellər ayrıldıqda, astarların tək telli şablona bağlanmasına imkan vermək üçün temperatur aşağı salınır. Bu mərhələ adlanır tavlama. Yuvlama temperaturu primerlərin tərkibindən asılıdır və adətən primerlərin ərimə temperaturuna bərabər seçilir. Yanma temperaturunun səhv seçilməsi ya primerlərin şablona zəif bağlanmasına (yüksək temperaturda) və ya yanlış yerdə bağlanmasına və qeyri-spesifik məhsulların (aşağı temperaturda) görünməsinə gətirib çıxarır. Yuyulma mərhələsinin vaxtı 30 saniyədir, eyni zamanda, bu müddət ərzində polimerazın artıq bir neçə yüz nukleotidi sintez etməyə vaxtı var. Buna görə də, ərimə nöqtəsi 60 ° C-dən yuxarı olan primerləri seçmək və eyni zamanda, 60-72 ° C-də tavlama və uzanma aparmaq tövsiyə olunur.

Uzatma

DNT polimeraza primer kimi primerdən istifadə edərək şablon zəncirini təkrarlayır. Bu səhnədir uzanma. Polimeraza ikinci zəncirinin sintezinə şablona bağlanmış primerin 3" ucundan başlayır və şablon boyunca hərəkət edərək 5"-dən 3" ucuna doğru istiqamətdə yeni zəncir sintez edir. 72°C. Uzatma müddəti həm DNT polimerazanın növündən, həm də gücləndirilmiş fraqmentin uzunluğundan asılıdır. Tipik olaraq, uzanma müddəti hər min baza cütü üçün bir dəqiqə götürülür. Bütün dövrlərdən sonra tez-tez əlavə addım həyata keçirilir. son uzanma bütün tək telli fraqmentləri tamamlamaq üçün. Bu mərhələ 7-10 dəqiqə davam edir.

düyü. 2: İlk PCR dövrünün sxematik təsviri. (1) 94-96°C-də denatürasiya. (2) 68°C-də tavlama (məsələn). (3) 72°C-də uzanma (P=polimeraza). (4) Birinci dövr tamamlandı. Yaranan iki DNT zənciri növbəti dövr üçün şablon rolunu oynayır, buna görə də hər bir dövr ərzində şablon DNT-nin miqdarı ikiqat artır.

Xüsusi reaksiya məhsulunun miqdarı (primerlərlə məhdudlaşır) nəzəri olaraq 2n - 2n nisbətində artır, burada n reaksiya dövrlərinin sayıdır. Əslində, hər bir dövrün səmərəliliyi 100% -dən az ola bilər, buna görə də reallıqda P ~ (1+E) n , burada P məhsulun miqdarıdır, E dövrün orta səmərəliliyidir.

"Uzun" DNT nüsxələrinin sayı da artır, lakin xətti olaraq, reaksiya məhsullarında xüsusi bir fraqment üstünlük təşkil edir.

Tələb olunan məhsulun artımı reagentlərin miqdarı, inhibitorların olması və əlavə məhsulların əmələ gəlməsi ilə eksponent olaraq məhdudlaşdırılır. Reaksiyanın son dövrlərində böyümə yavaşlayır, buna "yayla effekti" deyilir.

PCR növləri

• Daxili PCR(Nested PCR (ing.) ) - reaksiyanın əlavə məhsullarının sayını azaltmaq üçün istifadə olunur. İki cüt primerdən istifadə edin və ardıcıl iki reaksiya aparın. İkinci primer cütü birinci reaksiyanın məhsulu daxilində DNT bölgəsini gücləndirir.
• Ters PCR(Ters PCR (İngilis dili) ) - istədiyiniz ardıcıllıq daxilində yalnız kiçik bir sahə məlum olduqda istifadə olunur. Bu üsul, DNT-nin genomuna daxil edildikdən sonra qonşu ardıcıllığı müəyyən etmək lazım olduqda xüsusilə faydalıdır. Tərs edilmiş PCR-nin həyata keçirilməsi üçün məhdudlaşdırıcı fermentlərlə DNT-nin bir sıra kəsikləri aparılır, sonra fraqmentlərin bağlanması (ligation) aparılır. Nəticədə, məlum fraqmentlər naməlum bölgənin hər iki ucundadır, bundan sonra PCR həmişəki kimi həyata keçirilə bilər.
• əks transkripsiya PCR(Reverse Transscription PCR, RT-PCR (İngilis dili)) - RNT kitabxanasından məlum ardıcıllığı gücləndirmək, təcrid etmək və ya müəyyən etmək üçün istifadə olunur. Ənənəvi PCR-dən əvvəl reversetaza istifadə edərək mRNA şablonunda tək zəncirli DNT molekulu sintez edilir və PCR üçün şablon kimi istifadə edilən tək zəncirli cDNA alınır. Bu üsul tez-tez bu genlərin harada və nə vaxt ifadə edildiyini müəyyənləşdirir.
• Asimmetrik PCR(İngilis dili) Asimmetrik PCR) - orijinal DNT-nin zəncirlərindən əsasən birini gücləndirmək lazım olduqda həyata keçirilir. Bəzi ardıcıllıq və hibridləşdirmə analiz üsullarında istifadə olunur. PZR adi qaydada aparılır, istisna olmaqla, primerlərdən biri çox miqdarda alınır. Bu metodun modifikasiyası ingilis dilidir. L yaxın- A sonra- T o- E xponensial-PCR (LATE-PCR), müxtəlif konsentrasiyalı primerlərdən istifadə edir və aşağı konsentrasiyalı primer yüksək konsentrasiyalı primerdən daha yüksək (ərimə nöqtəsi) ilə seçilir. PCR yüksək tavlama temperaturunda aparılır və bununla da bütün dövrlərdə reaksiyanın effektivliyini qoruyur.
• Kəmiyyət PCR(Kəmiyyət PCR, Q-PCR) və ya real vaxt PCR- hər bir reaksiya dövründə spesifik PCR məhsulunun miqdarının ölçülməsinə birbaşa nəzarət etmək üçün istifadə olunur. Bu üsul, reaksiya məhsulunun yığılması zamanı onun miqdarını dəqiq ölçmək üçün floresan etiketli primerlərdən və ya DNT zondlarından istifadə edir; və ya flüoresan interkallaşdırıcı boya istifadə olunur Sybr Green I iki zəncirli DNT-yə bağlanır. Sybr Green I spesifik flüoresan zondlara və ya primerlərə ehtiyac olmadan PCR məhsullarının real vaxt rejimində aşkarlanması və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün sadə və sərfəli variant təqdim edir. Gücləndirmə zamanı boya SYBR Yaşıl I PZR məhsullarının DNT-nin kiçik yivinə inteqrasiya edir və mavi lazerlə şüalandıqda bağlanmamış boyadan daha güclü flüoresan siqnal verir. SYBR Yaşıl I hazırda məlum olan bütün real vaxt PCR alətləri ilə uyğun gəlir. üçün maksimum udma SYBR Yaşıl I 494 nm dalğa uzunluğundadır. Əsasdan əlavə, boya spektrində iki kiçik əlavə udma maksimumu var - 290 nm və 380 nm. üçün maksimum emissiya SYBR Yaşıl I 521 nm (yaşıl) dalğa uzunluğundadır.
• Mərhələli PCR(Touchdown PCR (İngilis dili) ) - bu yanaşmadan istifadə edərək primerlərin qeyri-spesifik bağlanmasının təsiri azalır. İlk dövrələr optimal yumşalma temperaturundan yuxarı temperaturda aparılır, sonra hər bir neçə dövrədə yumşalma temperaturu tədricən optimal səviyyəyə endirilir. Bu, primerin bütün uzunluğu boyunca tamamlayıcı ipə hibridləşməsini təmin etməkdir; optimal yumşalma temperaturunda isə primer tamamlayıcı ipə qismən hibridləşir. Genomik DNT-də primerin qismən hibridləşməsi, primer üçün kifayət qədər bağlanma yerləri olduqda qeyri-spesifik amplifikasiyaya gətirib çıxarır. Əksər hallarda, ilk on PCR dövrü 72-75 ° C tavlama temperaturunda həyata keçirilə bilər və sonra dərhal optimala, məsələn, 60-65 ° C-ə endirilə bilər.
• Molekulyar koloniya üsulu(geldə PCR) Koloniya-PCR koloniyası) - akrilamid gel səthdə bütün PCR komponentləri ilə polimerləşir və PCR aparılır. Təhlil edilən DNT-nin olduğu nöqtələrdə molekulyar koloniyaların əmələ gəlməsi ilə amplifikasiya baş verir.
• cDNA-nın sürətli gücləndirilməsi ilə PCR(İngilis dili) cDNA uclarının sürətli gücləndirilməsi, RACE-PCR ).
• Uzun fraqmentlərin PCR(İngilis dili) Uzun müddətli PCR) - uzadılmış DNT seqmentlərinin (10 min və ya daha çox əsas) gücləndirilməsi üçün PCR modifikasiyası. İki polimerazın qarışığından istifadə olunur, bunlardan biri yüksək emal qabiliyyətinə malik Taq polimerazadır (yəni bir keçiddə uzun DNT zəncirini sintez etməyə qadirdir), ikincisi isə 3 "-5" ekzonukleaza aktivliyi olan DNT polimerazadır, adətən Pfu polimeraza. İkinci polimeraza birincinin buraxdığı səhvləri düzəltmək üçün lazımdır, çünki tamamlayıcı olmayan nukleotid əlavə olunarsa, Taq polimeraza DNT sintezini dayandırır. Bu tamamlayıcı olmayan nukleotid Pfu polimeraza tərəfindən çıxarılır. Polimerazaların qarışığı 50:1 və ya hətta 100:1 nisbətində alınır, burada Taq polimeraza Pfu polimeraza nisbətən 25-100 dəfə çox alınır.
• RAPD(İngilis dili) Polimorf DNT-nin təsadüfi gücləndirilməsi ), polimorf DNT-nin təsadüfi gücləndirilməsi ilə PCR - genetik ardıcıllıqla yaxın olan orqanizmləri, məsələn, mədəni bitkilərin müxtəlif sortlarını, it cinslərini və ya yaxından əlaqəli mikroorqanizmləri ayırd etmək lazım olduqda istifadə olunur. Bu üsul adətən bir kiçik primerdən (təxminən 10 bp) istifadə edir. Bu primer tədqiq olunan orqanizmlərin təsadüfi DNT bölgələrinə qismən tamamlayıcı olacaq. Şərtləri (primerin uzunluğu, primerin tərkibi, temperatur və s.) seçməklə iki orqanizm üçün PZR modelində qənaətbəxş fərqə nail olmaq mümkündür.
• Qrup spesifik PCR(İngilis dili) qrupa xas PCR) - Bu ardıcıllıqlara konservativ primerlərdən istifadə etməklə eyni və ya müxtəlif növlər arasında əlaqəli ardıcıllıqlar üçün PCR. Məsələn, ribosom üçün universal primerlərin seçilməsi 18S və 26S bir növə xas intergenik boşluqların gücləndirilməsi üçün genlər: gen ardıcıllığı 18S və 26S növlər arasında mühafizəkardır, ona görə də bu genlər arasında PCR bütün tədqiq edilən növlər üçün baş verəcəkdir. Bu metodun əksi - unikal PCR(İngilis dili) unikal PCR), burada vəzifə əlaqəli ardıcıllıqlar arasında yalnız müəyyən bir ardıcıllığı gücləndirmək üçün primerləri seçməkdir.
• İsti başlanğıc istifadə edərək PCR(İngilis dili) İsti başlanğıc PCR) - DNT polimerazadan istifadə edərək PZR-nin modifikasiyası, burada polimeraza aktivliyi Affibody kimi anticisimləri təqlid edən antikorlar və ya kiçik molekullar tərəfindən otaq temperaturunda bloklanır, yəni PCR-də ilk denaturasiyadan əvvəl reaksiya zamanı. Tipik olaraq, ilk denaturasiya 95°C-də 10 dəqiqə ərzində aparılır.
• Virtual PCR(ing. silico PCR, digital PCR, elektron PCR, e-PCR) - tədqiq olunan genomun potensial DNT gücləndirilməsini proqnozlaşdırmaq üçün primer ardıcıllıqların (və ya DNT zondlarının) siyahısından istifadə etməklə nəzəri polimeraza zəncirvari reaksiyasının kompüter analizinin riyazi metodu. , xromosom, dairəvi DNT və ya hər hansı digər DNT parçası.

Şablonun nukleotid ardıcıllığı qismən məlumdursa və ya ümumiyyətlə məlum deyilsə, istifadə edilə bilər degenerativ primerlər, ardıcıllığı hər hansı əsasları ehtiva edə bilən degenerativ mövqeləri ehtiva edir. Məsələn, primer ardıcıllığı ola bilər: …ATH…, burada N - A, T və ya C.

PCR tətbiqi

PCR bir çox sahələrdə analiz və elmi təcrübələrdə istifadə olunur.

Kriminalistika

PCR sözdə "genetik barmaq izlərini" müqayisə etmək üçün istifadə olunur. Cinayət yerindən genetik material nümunəsi lazımdır - qan, tüpürcək, sperma, saç və s.O, şübhəli şəxsin genetik materialı ilə müqayisə edilir. Çox az miqdarda DNT kifayətdir, nəzəri olaraq - bir nüsxə. DNT parçalara kəsilir, sonra PCR ilə gücləndirilir. Parçalar DNT elektroforezi ilə ayrılır. DNT zolaqlarının düzülüşü ilə bağlı ortaya çıxan şəkil deyilir genetik barmaq izi(İngilis dili) genetik barmaq izi).

Atalığın müəyyən edilməsi

düyü. 3: PCR ilə gücləndirilmiş DNT fraqmentlərinin elektroforezinin nəticələri. (1) Ata. (2) Uşaq. (3) Ana. Uşaq hər iki valideynin genetik izinin bəzi xüsusiyyətlərini miras aldı, bu da yeni, bənzərsiz bir iz verdi.

“Genetik barmaq izləri” unikal olsa da (eyni əkizlər istisna olmaqla), bir neçə belə barmaq izini çəkməklə hələ də ailə bağları qurmaq olar (şək. 3). Eyni üsul kiçik dəyişikliklərlə orqanizmlər arasında təkamül əlaqələri qurmaq üçün tətbiq oluna bilər.

Tibbi diaqnostika

PCR, irsi və viral xəstəliklərin diaqnozunu əhəmiyyətli dərəcədə sürətləndirməyə və asanlaşdırmağa imkan verir. İstənilən gen müvafiq primerlərdən istifadə etməklə PCR ilə gücləndirilir və sonra mutasiyaları müəyyən etmək üçün ardıcıllıqla aparılır. Viral infeksiyalar infeksiyadan dərhal sonra, xəstəliyin əlamətləri görünməzdən həftələr və ya aylar əvvəl aşkar edilə bilər.

Fərdi dərman

Bəzən dərmanlar bəzi xəstələr üçün zəhərli və ya allergen olur. Bunun səbəbləri qismən dərmanların və onların törəmələrinin həssaslığında və metabolizmində fərdi fərqlərdir. Bu fərqlər genetik səviyyədə müəyyən edilir. Məsələn, bir xəstədə müəyyən bir sitoxrom (xarici maddələrin mübadiləsindən məsul olan qaraciyər zülalı) daha aktiv ola bilər, digərində - daha az. Müəyyən bir xəstənin hansı növ sitokrom olduğunu müəyyən etmək üçün dərmanı istifadə etməzdən əvvəl PCR analizinin aparılması təklif olunur. Bu analiz ilkin genotipləmə adlanır. perspektiv genotipləşdirmə).

Gen klonlaması

Genlərin klonlaşdırılması (orqanizmlərin klonlaşdırılması ilə qarışdırılmamalıdır) genlərin təcrid edilməsi və gen mühəndisliyi manipulyasiyaları nəticəsində verilmiş genin çoxlu miqdarda məhsulunun alınması prosesidir. PCR geni gücləndirmək üçün istifadə olunur, sonra daxil edilir vektor- yad geni böyümək üçün əlverişli olan eyni və ya digər orqanizmə köçürən DNT parçası. Vektor kimi, məsələn, plazmidlər və ya viral DNT istifadə olunur. Genlərin xarici orqanizmə daxil edilməsi adətən bu genin məhsulunu - RNT və ya çox vaxt zülal əldə etmək üçün istifadə olunur. Bu yolla kənd təsərrüfatında, tibbdə və s. istifadə üçün sənaye miqdarda çoxlu zülallar alınır.

düyü. dörd: Plazmiddən istifadə edərək gen klonlaması.
(1) A orqanizminin xromosom DNT. (2) PCR. (3) A orqanizminin geninin çoxsaylı nüsxələri. (4) Genin plazmidə daxil edilməsi. (5) A orqanizminin geni ilə plazmid. (6) Plazmidin orqanizmə yeridilməsi B. (7) B orqanizmində A orqanizminin geninin surət nömrəsinin çoxaldılması.

DNT ardıcıllığı

Floresan etiketi və ya radioaktiv izotop ilə etiketlənmiş dideoksinukleotidlərdən istifadə edərək ardıcıllıq metodunda PCR ayrılmaz bir hissədir, çünki polimerləşmə zamanı flüoresan və ya radioaktiv etiketlə işarələnmiş nukleotidlərin törəmələri DNT zəncirinə daxil edilir. Sintez edilmiş zəncəyə dideoksinukleotidin əlavə edilməsi sintezi dayandırır və geldə ayrıldıqdan sonra xüsusi nukleotidlərin mövqeyini təyin etməyə imkan verir.

Mutagenez

Hal-hazırda, PCR mutagenez (DNT-nin nukleotid ardıcıllığında dəyişikliklərin tətbiqi) aparılması üçün əsas üsula çevrilmişdir. PCR-dən istifadə mutagenez prosedurunu sadələşdirməyə və sürətləndirməyə, həmçinin onu daha etibarlı və təkrar istehsal etməyə imkan verdi.

S.V. Pospelova, M.V. Kuznetsova

polimeraza zəncirvari reaksiya

S.V. Pospelova- Cand. bal. Elmlər, Mikrobiologiya, Virusologiya və İmmunologiya kafedrasının dosenti, M.V. Kuznetsova- Cand. biol. Elm., IEGM UB RAS əməkdaşı

Pospelova, S.V.

Tibb Akademiyasının tibb, pediatriya, müalicə-profilaktika, stomatologiya və ali tibb bacısı təhsili fakültəsi (FVSO) fakültələrinin tələbələrinin müstəqil işi üçün nəzərdə tutulmuşdur.

Rəyçi:

baş PSMA Biologiya, Ekologiya və Tibbi Genetika Bölməsi, Prof A.B. Vinoqradov

Mərkəzi koordinasiyanın qərarı ilə çap olunur
GOU VPO PGMA-nın metodik şurası
onlar. ak. E.A. Vaqner Roszdrav

UDC 616-078.33

© Pospelova S.V., Kuznetsova M.V., 2007

© GOU VPO PGMA im. ak. E.A. Vaqner Roszdrav, 2007

Klinik praktikada polimeraza zəncirvari reaksiya
mikrobioloji diaqnostika

Müasir tibb təbiət elmlərinin nailiyyətlərindən uğurla istifadə edir, xəstəliklərin diaqnostikası və müalicəsi üçün yeni texnologiyalardan intensiv şəkildə tətbiq edir. Son zamanlar infeksion xəstəliklərin laborator diaqnostikasında ənənəvi mikrobioloji və immunoloji üsullara molekulyar-genetik texnologiyaların tətbiqinə əsaslanan yeni üsullar əlavə edilmişdir. Bu üsulların təkcə elmi məqsədlər üçün deyil, həm də praktiki laboratoriya diaqnostikasında istifadəsi böyük ölçüdə 80-ci illərin ortalarında DNT-nin süni surətdə çoxaldılması prosesinin yaradılması və bu texnologiyanın daha da sürətli inkişafı sayəsində mümkün olmuşdur. hal-hazırda kimi tanınır polimeraza zəncirvari reaksiya(PCR). Mövcud olduğu 15 ildən az müddətdə PCR bir çox patogenlərin spesifik DNT ardıcıllığını təhlil etməyi rutin hala gətirdi. Çox yönlülük, yüksək həssaslıq və nisbi icra asanlığı PCR metodunu patogenlərin birbaşa aşkarlanması və identifikasiyası, patogen mikroorqanizmlərin molekulyar tipləşdirilməsi və xassələrinin öyrənilməsi, genetik ilə əlaqəli mutasiyaların təhlili kimi klinik diaqnostikanın müxtəlif problemlərinin həlli üçün əvəzolunmaz etdi. insanlarda olan xəstəliklər və insanın identifikasiyası.

PCR nədir?

polimeraza zəncirvari reaksiya(PCR) - təkrar kopyalamanın süni prosesi (gücləndiricilər) müəyyən bir DNT ardıcıllığı həyata keçirilir in vitro(şək. 1). PCR zamanı DNT-nin surətinin çıxarılması xüsusi bir ferment tərəfindən həyata keçirilir - DNT polimeraza, canlı orqanizmlərin hüceyrələrində olduğu kimi. Tək DNT zəncirində (matris) hərəkət edən DNT polimeraza onun tamamlayıcı DNT ardıcıllığını sintez edir. DNT polimerazanın DNT zəncirinin sintezinə "sıfırdan" başlaya bilməməsi vacibdir, ona nukleotidlər əlavə etməyə başlaya biləcəyi qısa bir "toxum" RNT və ya DNT zəncirinə ehtiyacı var. PCR-nin əsas prinsipi polimerləşmə reaksiyasının (monomer nukleotid vahidlərindən DNT polimer zəncirinin sintezi) spesifik reaksiyalarla başlamasıdır. primerlər("toxum" DNT-nin qısa fraqmentləri) çoxlu təkrarlanan dövrlərin hər birində. PCR-nin spesifikliyi primerlərin ciddi şəkildə müəyyən edilmiş DNT bölgəsini “tanımaq” və molekulyar prinsipə uyğun olaraq ona bağlanmaq qabiliyyəti ilə müəyyən edilir. tamamlayıcılıq.

Adi PCR reaksiyasında, DNT şablonunun əks zəncirlərinə bağlanaraq hər iki tərəfdən gücləndirilmiş bölgəni "məhdudlaşdıran" bir cüt primer istifadə olunur. Orijinal DNT-nin nüsxələrinin sayını artırmaq üçün siklik reaksiya lazımdır. Bir qayda olaraq, ardıcıl təkrarlanan PCR dövrlərinin hər biri üç mərhələdən ibarətdir:

1)denatürasiya, və ya ikiqat zəncirli DNT-nin “əriməsi”: reaksiya başlamazdan əvvəl hədəf DNT ikiqat zəncirlidir, 94-95 0 C temperaturda tamamlayıcı DNT zəncirləri ayrılır – onlar tək zəncirli vəziyyətə keçir;

2) bağlama (tavlama) primerlər: seçilmiş primerlər üçün optimal temperaturda, şablon DNT-nin tamamlayıcı bölgəsinə bağlanırlar;

3)uzanma, və ya zəncirin uzanması: DNT polimeraza, sonrakı PCR dövrlərində primerlər üçün hədəfə çevrilən yeni DNT zəncirlərini sintez edərək, primerlərə nukleotidlər əlavə edir.

Hər bir dövrün mərhələlərinin dəyişdirilməsi reaksiya qarışığının temperaturunun dəyişdirilməsi ilə həyata keçirilir (bax. Şəkil 1).

düyü. 1. PCR dövrünün əsas mərhələləri

Əvvəlcə primerlər yalnız orijinal DNT-nin müəyyən bir ardıcıllığına bağlana bilər, lakin sonrakı dövrlərdə bu ardıcıllığın əvvəlki dövrlərdə sintez edilmiş nüsxələrinə bağlanırlar. Bu halda, əsas PCR məhsulunun miqdarı (primerlərlə məhdudlaşdırılan DNT ardıcıllığının surəti) hər bir dövrədə nəzəri olaraq ikiqat artır. Əgər ilkin dövrədə tədqiq olunan materialda yalnız bir hədəf DNT var idisə, birinci sikldən sonra artıq iki nüsxə, iki sikldən sonra - 4 nüsxə olacaq, üçüncü dövrənin nəticəsi 8 nüsxə, otuz- nüsxə olacaq. beşinci - artıq 68 milyard nüsxədir (şəkil 2).

düyü. 2. Çox Kopyalama Prosesi
Ardıcıllıq zamanı hədəf DNT
dəyişən dövrlər

Gücləndirilmiş DNT-ni aşkar etmək və onun ölçüsünü təyin etmək üçün ənənəvi olaraq bir çox laboratoriyalarda istifadə olunan reaksiya məhsullarının təhlilinin əsas metodu metoddur. gel elektroforezi ardınca etidium bromid kimi DNT spesifik boya ilə boyanır (şək. 3).

Nəzarət - tərkibindəki nukleotidlərin məlum sayına malik müxtəlif DNT fraqmentləri. Məlumdur ki, müxtəlif fraqmentlər arasındakı məsafə onların ölçüsündən və kütləsindən loqarifmik asılılığa malikdir. 1-ci sətir - təxminən 1850 əsasdan ibarət PCR fraqmentləri aşkar edilmişdir. 2 və 4-cü sətirlər təxminən 800 əsas uzunluğunda fraqmentlərdir.

düyü. 3. Reaksiya məhsullarının üsulla təhlili
gel elektroforezi

Sətir 3 - istənilən fraqmentlər aşkar edilmədi, reaksiyanın mənfi nəticəsi. 5-ci sətir - primerlərin müxtəlif uzunluqlu bir neçə DNT fraqmentinə tamamlayıcı olması səbəbindən yaranan çoxsaylı xətlər: təxminən 550, 800 və 1500 əsas.

PCR texnologiyasının təkmilləşdirilməsi

Əvvəlcə, DNT denatürasiyası mərhələsində hər bir dövrədə temperaturun inaktivasiyasına məruz qalan PCR-nin aparılması üçün şərti DNT polimerazalarından istifadə edilmişdir. Polimerazı reaksiya qarışığına dəfələrlə əlavə etmək lazım idi, bu, kifayət qədər zəhmət tələb edirdi və prosesi avtomatlaşdırmağa imkan vermirdi.

Reaksiya istifadə edir termostabil Bir neçə onlarla dövr üçün PCR dövrünün bütün mərhələlərində yüksək temperaturlara davam edən DNT polimerazları. Bəzi xassələri ilə fərqlənən kommersiyada mövcud olan termostabil DNT polimerazalarının sayı kifayət qədər çoxdur. Ən çox istifadə olunur Taq polimeraza, əvvəlcə termofilik mikroorqanizmdən təcrid edilmişdir Termus aquaticus. Digər polimerazlar xüsusi PCR tətbiqləri üçün daha çox istifadə olunur. Termostabil polimerazaların müasir kommersiya preparatları, bir qayda olaraq, standart laboratoriya praktikasında PCR texnologiyasından istifadə etməyə imkan verən sabit təkrarlanan aktivliyi təmin edir.

Reaksiya qarışığının temperaturunun dəyişdirilməsinin texniki layihəsi də son illərdə sürətlə inkişaf etmişdir. Birincisi, PCR müxtəlif temperaturlara təyin edilmiş üç su banyosundan istifadə edərək həyata keçirildi: DNT denaturasiyası, primerin tavlanması və polimerləşmə üçün. Sınaq boruları bir su banyosundan digərinə "dairə şəklində" köçürüldü, buna görə dövrün müxtəlif mərhələlərində temperaturun dəyişməsi baş verdi. Reaksiya qarışığı olan sınaq borularının yerləşdiyi su banyosuna alternativ olaraq müxtəlif temperaturlu suyun verildiyi cihazların versiyaları da var idi. Bu hallarda dövrlərin dəyişdirilməsi çox vaxt apardı və prosesi avtomatlaşdırmaq çətin idi. PCR-nin həyata keçirilməsi üçün alətlər əsasən istifadə olunur (termal dövranlar), müəyyən edilmiş proqram əsasında temperaturu avtomatik dəyişən. Termal dövran cihazlarında reaksiya qarışığı olan sınaq boruları temperaturu yüksək sürətlə dəyişən metal bloka yerləşdirilir, bu da hər bir PCR dövrünün müddətini azaldır.

Müasir istilik dövrəçiləri reaksiya qarışığı üçün xüsusi nazik divarlı plastik sınaq borularından istifadə etmək üçün uyğunlaşdırılmışdır ki, bu da cihaz bloku ilə reaksiya qarışığı arasında istilik mübadiləsini sürətləndirməyə və nəticədə reaksiya müddətini daha da azaltmağa imkan verir.

Beləliklə, standart PCR 1-3 saat ərzində həyata keçirilə bilər.Bir çox qurğular PCR prosesinin xüsusi modifikasiyaları üçün zəruri olan xüsusi mürəkkəb temperatur profillərinin proqramlaşdırılmasına imkan verir.

PCR texnologiyasının təkmilləşdirilməsi ilə paralel olaraq reaksiya məhsullarının təhlili üsulları da inkişaf etmişdir. Metod gel elektroforezi ardınca etidium bromid kimi DNT-yə xas boya ilə boyanma ənənəvi olaraq gücləndirilmiş DNT-ni aşkar etmək və onun ölçüsünü təyin etmək üçün bir çox laboratoriyada istifadə olunur. İstifadəsi hibridləşmə daxili DNT zondları ilə bəzi hallarda PCR məhsullarının aşkarlanmasının həssaslığını və spesifikliyini əhəmiyyətli dərəcədə artırmağa imkan verir. Elektroforetik ayırmanın hazırlanmasına və aparılmasına ehtiyac olmadığı, çoxlu sayda nümunələrin təhlili üçün avtomatlaşdırma imkanları və qeyri-radioaktiv aşkarlama formatının istifadəsi səbəbindən bu üsul daha çox yayılır. Bəzi hallarda, xüsusi flüoresan "markerlərin" istifadəsi gücləndirmənin aparılmasına və ya PCR son məhsullarının birbaşa reaksiya borusunda aşkar edilməsinə nəzarət etməyə imkan verir.

PCR istifadə
tibbi mikrobiologiyada

Klinik diaqnostikanın bir çox müxtəlif sahələri arasında PCR texnologiyasından istifadə edən tətbiqlərin sayı və müxtəlifliyi baxımından bəlkə də tibbi mikrobiologiya aparıcı mövqe tutur. Bu metodun praktikaya tətbiqi seroloji diaqnostika ilə yanaşı, hələ də mikroorqanizmlərin süni qida mühitində və ya hüceyrə kulturasında təcrid edilməsi və becərilməsi üsullarına əsaslanan müasir klinik mikrobiologiyanın imkanlarını xeyli genişləndirmişdir.

Ənənənin imkanları və məhdudiyyətləri
becərmə üsulları

Mikrobioloji laboratoriyalar üçün ənənəvi olan mədəni diaqnostika metodu, bir qayda olaraq, antibiotiklərə həssaslıq, asanlıqla becərilən mikroorqanizmlərin virulentliyi kimi xüsusiyyətlərin aşkarlanması və öyrənilməsi üçün özünü doğruldur. Bununla belə, bəzi mikroorqanizmlər (pnevmokok, hemofil, neisseria, mikoplazma, məcburi anaeroblar və s.) klinik materialdan nümunə götürmə, daşınma və becərmə şəraitinə, xüsusi böyümə faktorlarının mövcudluğuna son dərəcə həssas ola bilər və ya çoxalma qabiliyyətinə malikdir. in vitro yalnız hüceyrə mədəniyyətində (viruslar, xlamidiyalar, rikketsiyalar).

Mikobakteriyalar və göbələklər kimi mikroorqanizmlərin süni mühitlərdə yavaş böyüməsi bu mikroorqanizmlərin diaqnostikası üçün kultura metodunun istifadəsi ilə bağlı digər təbii məhdudiyyətdir. Bundan əlavə, yalnız xüsusilə təhlükəli deyil, bəzən fürsətçi patogenlər olan təcrid olunmuş patogenlərin canlı mədəniyyətləri ilə işləmək laboratoriya işçilərinin sağlamlığı üçün təhlükə yarada bilər.

İnsan xəstəliklərinin törədiciləri arasında, məsələn, becərilməmiş bakteriyalar növləri də məlumdur Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, və bir çox virus növləri, o cümlədən insan papillomavirusları və hepatit C, hüceyrə mədəniyyətində bu günə qədər uğursuz olaraq qalmış böyümə cəhdləri. Nəhayət, uğurlu becərmə ilə belə, təcrid olunmuş mikroorqanizmlərin sonrakı identifikasiyasına ehtiyac var.

Ənənəvi mikrobioloji identifikasiya üsulları müxtəlif fenotipik testlərin istifadəsinə əsaslanır, məsələn, spesifik fermentativ aktivliyin aşkarlanması, şəkərləri metabolizə etmək qabiliyyəti və ya selektiv əlavələrlə media üzərində böyümənin dəstəklənməsi. Belə testlərin şərtlərinin standartlaşdırılmasının çətinliyi, eləcə də bir çox mikroorqanizmlərə xas olan təbii fenotipik dəyişkənlik yanlış identifikasiyaya səbəb ola bilər.

Birbaşa Diaqnoz üçün PCR-dən istifadə
və patogenlərin identifikasiyası
yoluxucu xəstəliklər

Kultura üsullarının istifadəsi problemli olduqda və ya diaqnostik effektivliyin qeyri-kafi olması ilə əlaqəli hallarda, bioloji gücləndirməni (yəni süni mühitdə böyümə) nuklein turşularının fermentativ ikiqat artması ilə əvəz etmək imkanı. ilə in vitro PCR-dən istifadə xüsusilə cəlbedicidir. Yoluxucu agentlərin diaqnostikası üçün PCR istifadəsinə müxtəlif yanaşmalar mövcuddur. Ən çox yayılmış PCR növü (xüsusi PCR) tamamlayıcı olan primerlərin istifadəsini nəzərdə tutur xüsusi ardıcıllıq Ciddi müəyyən edilmiş mikroorqanizm növü üçün DNT xarakterikdir. Məsələn, əsas xarici membran zülalını (MOMP) kodlayan genin müəyyən bir bölgəsinin PCR gücləndirilməsi. Chlamydia trachomatis, reaksiya məhsullarının aşkarlanması üçün radioaktiv olmayan hibridləşmə ilə birlikdə, tədqiq edilən nümunələrdə xlamidiya DNT-nin tək nüsxələrini aşkar etməyə imkan verir. Eyni zamanda, PCR diaqnostik effektivliyə görə becərmə və xlamidiya antigeninin birbaşa aşkarlanması üsullarından (mikroimmunofluoressensiya və ferment immunoassay) əhəmiyyətli dərəcədə üstündür, ənənəvi olaraq C. trachomatis.

Müxtəlif patogenlərin DNT-nin eyni vaxtda gücləndirilməsi üçün bir reaksiya borusunda eyni anda bir neçə cüt növə xas primerlərdən istifadə etmək imkanı da var. Bu modifikasiya çoxlu PCR adlanır. (multipleks PCR).Çoxsaylı PCR müəyyən növ xəstəliklərə səbəb olan müxtəlif mikroorqanizmlərin etioloji rolunu müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər. Məsələn, eyni vaxtda iki (C. trachomatis və N. gonorrhoeae sidik-cinsiyyət traktının xəstəlikləri ilə) və ya hətta dörd patogen (I. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis və A. otitidis xroniki irinli otit ilə).

PCR diaqnostikasına alternativ yanaşma müəyyən bir taksonomik qrupun bütün mikroorqanizmlərində mövcud olan gen fraqmentlərinin gücləndirilməsinə imkan verən universal primerlərin istifadəsi ilə əlaqələndirilir. Bu üsulla müəyyən edilə bilən növlərin sayı həm kiçik sistematik qruplar (cins, ailə) çərçivəsində, həm də sifariş, sinif, tip səviyyəsində böyük taksonlarla məhdudlaşdırıla bilər. Sonuncu halda, PCR üçün hədəf ən çox müxtəlif prokaryotik mikroorqanizmlərdə oxşar quruluşa malik olan ribosom genləridir (16S və 23S rRNA).

Bu genlərin qorunan bölgələrini tamamlayan primerlərin istifadəsi əksər bakteriya növlərinin DNT-sini gücləndirməyə imkan verir. Yaranan PCR ribosomal gen fraqmentləri daha sonra mənsub olduqları bakteriyaları müəyyən etmək üçün müxtəlif laboratoriya üsullarından istifadə etməklə təhlil edilə bilər. "Molekulyar" identifikasiyanın ən dəqiq üsulu gücləndirilmiş DNT-nin tam nukleotid ardıcıllığını (ardıcıllığını) müəyyən etmək və onu məlum növlərin müvafiq ardıcıllığı ilə müqayisə etməkdir.

Təsvir edilən identifikasiya prinsipindən istifadə edən avtomatlaşdırılmış sistemlərin mövcudluğuna baxmayaraq, praktikada adətən daha az vaxt aparan və bahalı üsullardan istifadə olunur, buna baxmayaraq, DNT fraqmentlərinin ardıcıllığında müəyyən fərqləri etibarlı şəkildə aşkar etməyə imkan verir. Ən çox yayılmışlar məhdudlaşdırıcı fermentlər tərəfindən parçalanma yerlərinin DNT-də yerləşməsinin təhlilinə əsaslanan üsullardır (RFLP metodu - məhdudlaşdırıcı fraqment uzunluğu polimorfizmi) və ya tək zəncirli formada DNT-nin elektroforetik hərəkətliliyinin təyini (SSCP-metod) tək zəncirli konformasiya polimorfizmi).

Universal primerlərdən istifadə edən PCR həm təmiz kulturada təcrid olunmuş mikroorqanizmləri müəyyən etmək, həm də birbaşa klinik nümunələrdə geniş spektrli patogenlərə birbaşa diaqnoz qoymaq üçün istifadə edilə bilər. Bununla belə, qeyd etmək lazımdır ki, "geniş spektrli" PCR-nin həssaslığı ümumiyyətlə "növlərə aid" test sistemlərindən daha aşağıdır. Bundan əlavə, universal primerlərlə PCR adətən müxtəlif növlərin DNT-sini gücləndirməklə əldə edilən reaksiya məhsullarını təhlil etmək çətinliyi səbəbindən çoxlu sayda müxtəlif mikroorqanizmləri ehtiva edə bilən nümunələri öyrənmək üçün istifadə edilmir.

Molekulyar tipləşdirmə üsulları
PCR əsasında mikroorqanizmlər

PCR yalnız diaqnostika və identifikasiya üçün deyil, həm də mikroorqanizmlərin təcrid olunmuş suşlarının genetik əlaqəsinin (klonallığının) alt növlərinin yazılması və təhlili üçün, xüsusən də epidemioloji tədqiqatlar apararkən geniş istifadə olunur. Ənənəvi fenotipik üsullarla (bio-, faq- və serotipləşdirmə) müqayisədə PCR-əsaslı genotipləmə çoxfunksiyalılığı, daha dərin differensiasiya səviyyəsi, ştammların eyniliyini qiymətləndirmək üçün kəmiyyət üsullarından istifadə etmək imkanı və yüksək təkrarlanma qabiliyyəti ilə xarakterizə olunur. PCR texnologiyasının törəmələri hesab edilə bilən bir çox genotipləmə üsulları təsvir edilmişdir.

PCR tipləmə üsullarının müxtəlifliyinə baxmayaraq, onların əksəriyyəti üçün ümumi olan hər bir fərdi ştamdan əldə edilən müxtəlif uzunluqdakı DNT fraqmentlərini ayırmaq üçün gel elektroforezindən istifadə etməkdir. Eyni zamanda, vizual və ya kompüterdən istifadə etməklə həyata keçirilən fərdi elektroforetik profillərin müqayisəli təhlili tədqiq olunan ştammların genetik əlaqə dərəcəsini qiymətləndirməyə imkan verir.

Dərmanların aşkarlanması üçün PCR-dən istifadə
mikroorqanizmlərdə müqavimət

Son zamanlarda PCR patogen mikroorqanizmlərin müxtəlif xüsusiyyətlərini öyrənmək, xüsusən də müəyyən növ patogenlərin müəyyən dərmanlara qarşı müqavimətini müəyyən etmək üçün getdikcə daha çox istifadə olunur. Bir qayda olaraq, mikroorqanizmlərin həssaslığını təyin etmək üçün PZR-dən istifadə yalnız ənənəvi fenotipik metodların tətbiq edilmədiyi və ya kifayət qədər effektiv olmadığı hallarda məqsədəuyğundur. Məsələn, həssaslığın tərifi Mycobacterium tuberculosis mədəniyyət üsullarından istifadə edərək vərəm əleyhinə dərmanlara adətən 4-8 həftə çəkir. Bundan əlavə, belə hallarda fenotipik testlərin nəticələri mikroorqanizmlərin uzun müddət becərilməsi zamanı antimikrobların aktivliyinin azalması səbəbindən təhrif edilə bilər. Dərmanlara qarşı müqavimətin molekulyar mexanizmlərinin öyrənilməsi M. vərəm və bəzi digər patogenlər müqavimətin genetik markerlərinin sürətli aşkarlanması üçün PCR əsaslı metodların işlənib hazırlanmasına imkan verdi.

Belə bir analiz üçün adətən təmiz kulturada təcrid olunmuş patogenin DNT və ya RNT-si istifadə olunur. Bununla belə, bəzi hallarda patogenin əvvəlcədən becərilməsi olmadan antibiotiklərə qarşı müqavimət üçün birbaşa PCR təhlili imkanı var. Tədqiq edilmiş klinik material nümunəsi PCR üçün hədəf DNT mənbəyi kimi istifadə olunur və kopyalanan PCR məhsulu antibiotik müqaviməti ilə əlaqəli mutasiyaları aşkar etmək üçün təhlil edilir. Məsələn, vərəmli meningitdən əziyyət çəkən xəstələrdə patogenin rifampisinə qarşı müqavimətini aşkar etmək üçün PCR-dən istifadə etməyə imkan verən bir üsul hazırlanmışdır.

Bununla belə, mikroorqanizmlərin dərmana davamlılığını qiymətləndirmək üçün genetik metodların istifadəsində təbii məhdudiyyətlər var:

Müqavimətin xüsusi genetik mexanizmləri haqqında məlumatlar mövcud olmaya bilər;

Müəyyən dərmanlara qarşı müqavimət tez-tez fenotipə müstəqil təsir göstərən müxtəlif genlərdə müxtəlif mexanizmlər və mutasiyalarla əlaqələndirilir.

Məsələn, qram-mənfi bakteriyaların aminoqlikozid antibiotiklərinə qarşı müqaviməti müxtəlif aminoqlikozidləri dəyişdirən fermentlərin istehsalı və ya hüceyrə divarının keçiriciliyindəki dəyişikliklər nəticəsində baş verə bilər. Bu halda, həmişə ciddi şəkildə müəyyən edilmiş xüsusi DNT bölgəsini xarakterizə edən PCR analizinin nəticələri bütövlükdə mikroorqanizmin həssaslığını qiymətləndirmək üçün əsas ola bilməz.

Bundan əlavə, antimikrob dərmanlara həssaslığın müəyyən edilməsi üçün PZR-dən istifadəyə dair beynəlxalq standartların və tövsiyələrin olmaması bu yanaşmanın praktiki diaqnostikada geniş tətbiqi imkanlarını məhdudlaşdıran əlavə amildir.

Bu yaxınlarda insanların müxtəlif yoluxucu xəstəliklərinin diaqnostikası üçün etibarlı, yüksək həssas və sürətli üsul işlənib hazırlanmışdır. Bu üsul "PCR analizi" adlanır. Bu nədir, onun mahiyyəti nədir, hansı mikroorqanizmləri aşkar edə bilər və onu necə düzgün qəbul etmək olar, məqaləmizdə danışacağıq.

Kəşf tarixi

Həmçinin xərçəngin diaqnostikasında PCR metodlarından istifadə edilir.

Metodun üstünlükləri

PCR diaqnostikası bir sıra üstünlüklərə malikdir:

1. Yüksək həssaslıq. Mikroorqanizm DNT-nin yalnız bir neçə molekulunun mövcudluğunda belə, PCR analizi infeksiyanın mövcudluğunu müəyyən edir. Metod xroniki və gizli şəkildə baş verən xəstəliklərə kömək edəcəkdir. Tez-tez belə hallarda, mikroorqanizm başqa mədəniyyətsizdir.
2. Tədqiqat üçün hər hansı bir material uyğun gəlir, məsələn, tüpürcək, qan, genital sekresiya, saç, epitel hüceyrələri. Ən çox görülən bir qan testi və PCR üçün ürogenital yaxmadır.

   

3. Bitkilərin uzunmüddətli becərilməsi tələb olunmur. Avtomatlaşdırılmış diaqnostika prosesi tədqiqatın nəticələrini 4-5 saatdan sonra əldə etməyə imkan verir.
4. Metod demək olar ki, 100% etibarlıdır. Yanlış-mənfi nəticələrin yalnız təcrid olunmuş halları qeydə alınıb.
5. Bir material nümunəsindən bir neçə növ patogenləri müəyyən etmək imkanı. Bu, yalnız xəstəliyin diaqnozu prosesini sürətləndirmir, həm də maddi xərcləri əhəmiyyətli dərəcədə azaldır. Tez-tez həkim hərtərəfli PCR analizini təyin edir. Altı patogenin müəyyən edilməsindən ibarət olan müayinənin qiyməti təxminən 1500 rubl təşkil edir.

PCR tədqiqatı zamanı nəticələrin etibarlı olması üçün diaqnoz üçün ilkin hazırlıq üçün tövsiyələrə əməl edərək analizdən keçmək lazımdır:

1. Tüpürcəyi bağışlamadan əvvəl, materialı qəbul etməzdən 4 saat əvvəl yeməkdən və dərman qəbul etməkdən çəkinməlisiniz. Prosedurdan dərhal əvvəl ağzınızı qaynadılmış su ilə yaxalayın.
2. Yanağın daxili səthindən nümunə götürərkən də yuxarıdakı qaydalara əməl edilməlidir. Durulamadan sonra vəzinin sirrini vurğulamaq üçün yüngül dəri masajı etmək tövsiyə olunur.
3. Sidik adətən evdə toplanır. Bunun üçün cinsiyyət orqanlarının hərtərəfli tualetini aparmaq lazımdır. Steril plastik qabda 50-60 ml sidik toplayın. Materialın təmizliyini təmin etmək üçün qadınlara vajinaya tampon daxil etmək, kişilərə isə dəri qatını mümkün qədər dartmaq tövsiyə olunur. Menstruasiya zamanı materialı götürə bilməzsiniz.
4. Sperma bağışlamaq üçün material toplamadan 3 gün əvvəl cinsi əlaqədən çəkinməlisiniz. Həkimlər həmçinin saunaya getməyi və isti vanna qəbul etməyi, spirtli içkilər və ədviyyatlı yeməkləri qəbul etməyi məsləhət görürlər. Analizdən 3 saat əvvəl sidiyə çıxmaqdan çəkinmək lazımdır.
5. Doğuş üçün, məsələn, xlamidiya üçün PCR testi aparılırsa, həm qadınlara, həm də kişilərə 3 gün cinsi istirahət etmək tövsiyə olunur. Analizdən 2 həftə əvvəl antibakterial preparatlar qəbul edilməməlidir. Bir həftə ərzində intim gellərdən, məlhəmlərdən, vaginal süpozituarlardan, duşdan istifadə etməyi dayandırmalısınız. Müayinədən 3 saat əvvəl sidiyə çıxmaqdan çəkinməlisiniz. Menstruasiya zamanı materialdan nümunə götürülmür, qan axıdılması dayandırıldıqdan yalnız 3 gün sonra ürogenital yaxma götürə bilərsiniz.

Hamiləlik zamanı PCR

Körpəni gözləyərkən bir çox cinsi yolla ötürülən infeksiyalar dölün normal inkişafı üçün son dərəcə təhlükəlidir. CYBH intrauterin inkişafın ləngiməsinə, aşağı və ya vaxtından əvvəl doğuşa, uşağın anadangəlmə qüsurlarına səbəb ola bilər. Buna görə də erkən hamiləlikdə PCR müayinəsindən keçmək son dərəcə vacibdir. Qeydiyyatdan keçərkən analizdən keçmək lazımdır - 12 həftəyə qədər.



Material xüsusi bir fırça ilə servikal kanaldan alınır. Prosedur ağrısızdır və körpə üçün təhlükə yaratmır. Adətən hamiləlik dövründə PCR üsulu ilə xlamidiya, həmçinin ureaplazmoz, mikoplazmoz, sitomeqalovirus, herpes, papillomavirus üçün analiz aparılır. Belə bir müayinə kompleksi PCR-6 adlanır.

HİV diaqnozu üçün PCR

Metodun bədəndəki dəyişikliklərə və diaqnoz şərtlərinə çox həssas olması səbəbindən bir çox amillər nəticəyə təsir göstərə bilər. Buna görə də, HİV infeksiyası üçün PCR analizi etibarlı bir üsul deyil, onun effektivliyi 96-98% -dir. Qalan 2-4% hallarda test yanlış müsbət nəticələr verir.

Ancaq bəzi hallarda HİV-in PCR diaqnostikası olmadan edə bilməzsiniz. Adətən ELISA nəticəsi yanlış mənfi olan insanlara verilir. Bu cür göstəricilər bir insanın hələ də virusa qarşı antikorları inkişaf etdirmədiyini göstərir və onların sayının dəfələrlə artması olmadan aşkar edilə bilməz. Bu, PCR metodundan istifadə edərək qan testi aparmaqla əldə edilə bilən şeydir.

Belə diaqnostika İİV-ə yoluxmuş anadan doğulan həyatın birinci ilinin uşaqları üçün də lazımdır. Metod, uşağın vəziyyətini etibarlı şəkildə müəyyən etməyin yeganə yoludur.

Hepatit diaqnozu üçün PCR

Polimeraza zəncirvari reaksiya metodu hepatit A, B, C virusunun DNT-sini infeksiyaya qarşı antikorların əmələ gəlməsindən və ya xəstəliyin simptomlarının başlamasından çox əvvəl aşkarlamağa imkan verir. Hepatit C üçün PCR təhlili xüsusilə təsirlidir, çünki 85% hallarda bu xəstəlik asemptomatikdir və vaxtında müalicə edilmədən xroniki mərhələyə keçir.



Patogenin vaxtında aşkarlanması ağırlaşmalardan və uzunmüddətli müalicədən qaçınmağa kömək edəcəkdir.

Kompleks PCR müayinəsi

Kompleks PCR analizi: polimer zəncirvari reaksiya metodu ilə müayinə, eyni zamanda bir neçə növ infeksiyanın təyinini əhatə edir: mikoplazma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, sitomeqalovirus, herpes tip 1 və 2, gonoreya, papilloma virusu. Belə diaqnostikanın qiyməti 2000 ilə 3500 rubl arasında dəyişir. klinikadan, istifadə olunan materiallardan və avadanlıqdan, həmçinin analizin növündən asılı olaraq: keyfiyyət və ya kəmiyyət. Sizin vəziyyətinizdə nə lazımdır - həkim qərar verəcək. Bəzi hallarda patogenin varlığını müəyyən etmək kifayətdir, digərlərində, məsələn, HİV infeksiyası ilə kəmiyyət titri mühüm rol oynayır. Yuxarıda göstərilən patogenlərin hamısı diaqnoz qoyulduqda, müayinə "PCR-12 analizi" adlanır.

Təhlil nəticələrinin deşifr edilməsi

PCR analizini deşifrə etmək çətin deyil. Göstəricinin yalnız 2 şkalası var - "müsbət nəticə" və "mənfi nəticə". Patogen aşkar edildikdə, həkimlər xəstəliyin varlığını 99% əminliklə təsdiqləyə və xəstəni müalicə etməyə başlaya bilərlər. İnfeksiyanın müəyyən edilməsi üçün kəmiyyət üsulu ilə müvafiq sütun aşkar edilmiş bakteriyaların ədədi göstəricisini göstərəcəkdir. Yalnız bir həkim xəstəliyin dərəcəsini təyin edə və lazımi müalicəni təyin edə bilər.



Bəzi hallarda, məsələn, İİV infeksiyasını PCR ilə müəyyən edərkən, mənfi nəticə ilə, əldə edilmiş göstəriciləri təsdiqləmək üçün əlavə müayinələr aparmaq lazım gəlir.

Analizi hara aparmaq olar?

PCR analizini harada aparmaq lazımdır: dövlət klinikasında və ya özəl laboratoriyada? Təəssüf ki, bələdiyyə tibb müəssisələrində avadanlıq və üsullar çox vaxt köhnəlib. Ona görə də müasir avadanlıqlara və yüksək ixtisaslı kadrlara malik özəl laboratoriyalara üstünlük vermək daha yaxşıdır. Bundan əlavə, özəl klinikada nəticəni çox daha sürətli əldə edəcəksiniz.

Moskvada bir çox özəl laboratoriya müxtəlif infeksiyalar üçün PCR analizini təklif edir. Məsələn, Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro, PCR kimi klinikalarda analizlər aparılır. İmtahanın qiyməti 200 rubldan başlayır. tək bir patogenin müəyyən edilməsi üçün.

Belə nəticəyə gəlmək olar ki, yoluxucu xəstəliklərin PCR ilə diaqnostikası əksər hallarda infeksiyanın ilkin mərhələsində orqanizmdə patogenin aşkarlanmasının sürətli və etibarlı üsuludur. Ancaq yenə də müəyyən hallarda digər diaqnostik üsulları seçməyə dəyər. Yalnız bir mütəxəssis belə bir araşdırmaya ehtiyacı müəyyən edə bilər. PCR analizinin deşifrə edilməsi də peşəkar yanaşma tələb edir. Həkiminizin göstərişlərinə əməl edin və ehtiyacınız olmayan testlər aparmayın.