Hodowle komórkowe

Zwierząt

Wskazanie wirusów na podstawie następujących zjawisk

Opóźnienie rozwoju

śmierć, zmiana

błony zarodkowe, RGA

CPP, tworzenie się płytki nazębnej, RIF, RGads, interferencja

Choroba, śmierć,

zmiany histologiczne

w tkankach, inkluzje

Miareczkowanie wyizolowanego wirusa; wybór dawki roboczej.

Miano wirusa- maksymalne rozcieńczenie materiału zawierającego wirusa, przy którym nadal obserwuje się oczekiwany efekt (CPE, RGA, śmierć zwierzęcia).

Identyfikacja izolowanego wirusa w reakcjach neutralizacji, RTGads, RSC, supresji tworzenia się płytki nazębnej itp. za pomocą surowic diagnostycznych. Typ (typ) wirusa określa się poprzez neutralizację specyficznego działania wirusa za pomocą odpowiedniej surowicy odpornościowej.

Uwaga: Miareczkowanie i identyfikacja wirusa przeprowadzane są przy użyciu tego samego zjawiska.

Hodowla wirusa

Praca na kursie

„Metody wirusologii klinicznej”

Wstęp

Diagnostykę laboratoryjną infekcji wirusowych przeprowadza się głównie z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej, wrażliwych hodowli komórkowych oraz metod immunologicznych. Z reguły wybiera się jedną metodę diagnozy w zależności od stadium infekcji wirusowej. Na przykład wszystkie trzy podejścia mogą być przydatne w diagnozowaniu ospy wietrznej, ale skuteczne zastosowanie technik mikroskopowych i hodowli komórkowych zależy od możliwości pobrania zadowalających próbek na stosunkowo wczesnym etapie choroby.

W dużej mierze sukces diagnostyka wirusowa zależy od jakości otrzymanych próbek. Z tego powodu personel laboratorium musi być bezpośrednio zaangażowany w pobieranie niezbędnych próbek. Charakterystykę próbek oraz sposoby ich dostarczenia do laboratorium opisują Lennett, Schmidt, Christ i in.

Większość odczynników i instrumentów stosowanych w diagnostyce laboratoryjnej można kupić w różnych firmach. W większości przypadków ten sam odczynnik jest produkowany jednocześnie przez kilka firm. Z tego powodu nie wskazaliśmy poszczególnych firm, chyba że odczynnik dostarcza tylko jedna firma. We wszystkich pozostałych przypadkach należy zapoznać się z ogólną listą dostawców wskazaną w tabeli. 1.

Naszym celem nie było przedstawienie kompleksowego opisu wszystkich obecnie dostępnych metod diagnozowania ludzkich infekcji wirusowych. Przede wszystkim scharakteryzowaliśmy główne metody. W miarę zdobywania doświadczenia niezależna praca te podstawowe techniki można wykorzystać do rozwiązywania bardziej złożonych problemów.

1. Mikroskopia elektronowa

Do diagnostyki infekcji wirusowych pod mikroskopem elektronowym można zastosować cienkie skrawki dotkniętej tkanki. Najpopularniejszym materiałem używanym w mikroskopii elektronowej jest kał lub płyn.

Tabela 1. Lista firm dostarczających odczynniki i sprzęt

pęcherzyki charakterystyczne dla niektórych chorób, np ospa wietrzna. Analizując taki materiał, wirusy można wykryć za pomocą barwienia ujemnego, w wyniku czego powstaje materiał o dużej gęstości elektronowej wyznaczający składniki wirionu. Metoda jest skuteczna, gdy stężenie wirusa w badanych próbkach, np. w kale lub płynie pęcherzykowym, jest wysokie. W przypadkach, gdy zawartość cząstek wirusa w próbkach jest niska, prawdopodobieństwo wykrycia wirusa można zwiększyć poprzez zatężenie wirusa poprzez ultrawirowanie lub agregację go ze specyficznymi przeciwciałami. Ta ostatnia metoda jest również wygodna do identyfikacji wirusów. Tutaj opisujemy metodę diagnostyczną mikroskopu elektronowego zakażenie rotawirusem oraz metodę mikroskopii immunoelektronowej na przykładzie wykrywania swoistych przeciwciał przeciwko parwowirusom. Metody mikroskopii elektronowej są opisane bardziej szczegółowo przez Fielda.

2.1 Bezpośrednie badanie kału pod mikroskopem elektronowym

1. Zanurz końcówkę pipety Pasteura w kale i pobierz wystarczającą ilość materiału, aby uzyskać rozmaz o średnicy 1 cm.

2. Zawiesić rozmaz kału w barwniku z ujemnym kontrastem mikroskopu elektronowego, aż do uzyskania półprzezroczystej zawiesiny. Ujemny barwnik kontrastowy to 2% roztwór kwasu fosforowolframowego w wodzie destylowanej.

3. W celu uzyskania próbki z mikroskopu elektronowego kroplę zawiesiny umieszcza się na siatce mikroskopu elektronowego pokrytej warstwą węgla i formywaru. Podczas tej operacji siatkę przytrzymuje się za pomocą cienkiej pęsety.

4. Lek pozostawia się w powietrzu przez 30 s.

5. Nadmiar płynu usuwa się dotykając krawędzi szkła bibułą filtracyjną.

6. Lek suszy się na powietrzu.

7. W razie potrzeby inaktywuje się żywego wirusa poprzez naświetlanie obu stron siatki światłem ultrafioletowym o natężeniu 440 000 μW-s/cm2. W tym przypadku stosuje się fale krótkie lampa ultrafioletowa z filtrem. Lampa powinna znajdować się w odległości 15 cm od siatki; Czas naświetlania dla każdej strony wynosi 5 minut.

8. Wiriony rotawirusa można scharakteryzować poprzez transmisję mikroskop elektronowy ze wzrostem z 30 000 do 50 000.

2.2 Mikroskopia immunoelektronowa

Opisana poniżej metoda mikroskopii immunoelektronowej jest tylko jedną z wielu podobnych metod immunologicznych. Do badania przeciwciał swoistych dla wirusa stosuje się dodatkowo metodę polegającą na wiązaniu się z mikroskopijną siecią białka A. Stężenie robocze przeciwciał przeciwwirusowych ustala się metodą prób i błędów w zakresie od 1/10 do 1/1000. Wskazane przez nas stężenie jest zwykle stosowane w rutynowej pracy. Aby uzyskać optymalne wyniki interakcji przeciwciał z wirusem, w ten sam sposób miareczkuje się surowicę zawierającą parwowirusa.

1. 10 µl surowicy odpornościowej przeciwko ludzkiemu parwowirusowi rozcieńcza się 100 razy PBS. Roztwór ogrzewa się w łaźni wodnej do 56°C.

2. Rozpuścić w zwykły sposób 10 ml 2% agarozy w PBS i ochłodzić do 56°C w łaźni wodnej.

3. W temperaturze 56°C zmieszać 1 ml rozcieńczonej surowicy odpornościowej z 1 ml 2% agarozy.

4. Przenieść 200 µl powstałej mieszaniny do dwóch dołków 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.

5. Agarozę pozostawia się do zestalenia w temperaturze pokojowej. Tabletkę można przechowywać w temperaturze 4°C przez kilka tygodni, jeśli jest zabezpieczona taśmą klejącą.

6. Dodać 10 µl surowicy zawierającej parwowirusa do dołka zawierającego mieszaninę agarozy i surowicy odpornościowej.

7. Siatkę mikroskopu elektronowego z przygotowaną powłoką węglowo-formwarową umieszcza się po mniej błyszczącej stronie na kropli surowicy.

8. Siatkę przechowuje się przez 2 godziny w temperaturze 37°C w wilgotnej komorze.

9. Za pomocą cienkiej pęsety wyjmij siatkę i nałóż kroplę 2% kwasu fosforowolframowego na powierzchnię siatki, która miała kontakt z serum.

10. Po 30 s zmywa się nadmiar farby, suszy preparat i inaktywuje wirusa.

Zagregowane cząstki wirusa bada się pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym przy powiększeniu od 30 000 do 50 000.

3. Identyfikacja antygenów wirusowych

Wirusy znajdujące się w tkankach lub płynach tkankowych można zidentyfikować na podstawie białek specyficznych dla wirusa, stosując reakcję antygen-przeciwciało. Produkt reakcji antygen-przeciwciało bada się przy użyciu znacznika wprowadzanego bezpośrednio do przeciwciał przeciwwirusowych lub do przeciwciał skierowanych przeciwko przeciwciałom specyficznym dla wirusa. Przeciwciała można znakować fluoresceiną, radioaktywnym jodem lub enzymem rozszczepiającym substrat, powodując zmianę koloru. Ponadto do identyfikacji wirusa wykorzystuje się reakcję hemaglutynacji. W codziennej praktyce opisane metody stosowane są głównie do wykrywania antygenów wirusa zapalenia wątroby typu B we krwi oraz poszukiwania antygenów różnych wirusów wywołujących różne choroby układu oddechowego.

Obecnie wiele firm zajmuje się diagnostyką erytrocytową, radioaktywną i enzymatyczną, w tym do wykrywania wirusa zapalenia wątroby typu B. Nie uważamy za wskazane opisywanie metod pracy z tą diagnostyką: wystarczy postępować zgodnie z załączoną instrukcją. Poniżej skupimy się na metodzie immunofluorescencyjnej służącej do identyfikacji syncytialnego wirusa oddechowego w wydzielinie nosowo-gardłowej.

3.1 Identyfikacja syncytialnego wirusa oddechowego w wydzielinie nosowo-gardłowej metodą immunofluorescencji

Metodę otrzymywania preparatów wydzieliny nosowo-gardłowej opisali Gardner i McQuillin. W warunkach laboratoryjnych operację tę przeprowadza się dwuetapowo. Najpierw na szklanym szkiełku przygotowuje się rozmaz śluzu nosowo-gardłowego. Powstałe rozmazy można przechowywać w temperaturze -20°C przez wiele miesięcy. W drugim etapie rozmazy są barwione w celu wykrycia antygenu syncytialnego wirusa oddechowego. W tym celu wykorzystuje się metodę immunofluorescencji pośredniej.

3.1.1 Przygotowanie preparatów wydzieliny nosowo-gardłowej

1. Śluz ze specjalnych kleszczyków zmywa się 1-2 ml PBS i przenosi do probówki wirówkowej.

2. Wiruj przez 10 minut przy 1500 obr/min w wirówce stołowej.

3. Supernatant odsącza się.

4. Osad komórkowy ostrożnie zawiesza się w 2-3 ml PBS, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Aby to zrobić, użyj pipety Pasteura z szeroką szyjką.

5. Powstałą zawiesinę przenosi się do probówki.

6. Do zawiesiny dodać kolejne 2-4 ml PBS i wymieszać poprzez pipetowanie. Duże skrzepy śluzu są usuwane.

7. Wiruj przez 10 minut przy 1500 obr/min w wirówce stołowej.

8. Supernatant odrzuca się, osad ponownie zawiesza w takiej objętości PBS, aby powstałą zawiesinę łatwo było oddzielić od ścianek probówki.

9. Powstałą zawiesinę nanosi się na oznaczone szkiełko.

10. Szkło suszy się na powietrzu.

Utrwalić w acetonie przez 10 minut w temperaturze 4°C.

12. Po utrwaleniu szkło ponownie suszy się na powietrzu.

13. Powstałe preparaty natychmiast barwi się lub przechowuje w temperaturze -20°C.

3.1.2. Technika barwienia

1. Wydrukuj i rozcieńcz komercyjną antysurowicę RSV w PBS do zalecanego stężenia roboczego.

2. Pipetą Pasteura nanieść na przygotowany preparat jedną kroplę antysurowicy.

3. Lek umieszcza się w wilgotnej komorze.

4. Lek inkubuje się przez 30 minut w temperaturze 37°C.

5. Próbki dokładnie przemywa się PBS w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał w specjalnym zbiorniku.

6. Próbki przemywa się PBS na trzy zmiany po 10 minut każda.

7. Wysuszyć próbki, usunąć nadmiar PBS bibułą filtracyjną i wysuszyć na powietrzu.

Metody badań wirusologicznych— metody badania biologii wirusów i ich identyfikacji. W wirusologii szeroko stosowane są metody biologii molekularnej, za pomocą których udało się ustalić strukturę molekularną cząstek wirusa, metody ich przenikania do komórki i cechy reprodukcji wirusa, pierwotną strukturę wirusowych kwasów nukleinowych i białek. Trwają prace nad metodami określania sekwencji elementów składowych wirusowych kwasów nukleinowych i aminokwasów białkowych. Możliwe staje się powiązanie funkcji kwasów nukleinowych i kodowanych przez nie białek z sekwencją nukleotydów oraz ustalenie przyczyn procesów wewnątrzkomórkowych, które odgrywają rolę w ważna rola w patogenezie infekcji wirusowych.

Metody badań wirusologicznych opierają się również na procesach immunologicznych (oddziaływanie antygenu z przeciwciałami), właściwościach biologicznych wirusa (zdolność do hemaglutynacji, hemolizy, aktywność enzymatyczna), cechach interakcji wirusa z komórką gospodarza (charakter efektu cytopatycznego , tworzenie wtrętów wewnątrzkomórkowych itp.).

W diagnostyce infekcji wirusowych, w hodowli, izolacji i identyfikacji wirusów, a także w produkcji preparatów szczepionkowych, szeroko stosuje się metodę hodowli tkankowej i komórkowej. Stosuje się pierwotne, wtórne, stabilne, ciągłe i diploidalne hodowle komórkowe. Hodowle pierwotne uzyskuje się poprzez zdyspergowanie tkanki za pomocą enzymów proteolitycznych (trypsyna, kolagenaza). Źródłem komórek mogą być tkanki i narządy (najczęściej nerki) zarodków ludzkich i zwierzęcych. Zawiesinę komórek w pożywce umieszcza się w tzw. materacykach, butelkach lub szalkach Petriego, gdzie po przyczepieniu do powierzchni naczynia komórki zaczynają się namnażać. W przypadku infekcji wirusowej zwykle stosuje się monowarstwę komórkową. Pożywkę odsącza się, dodaje się zawiesinę wirusa w określonych rozcieńczeniach, a po kontakcie z komórkami dodaje się świeżą pożywkę, zwykle bez surowicy.

Komórki większości kultur pierwotnych można hodować wtórnie; taką hodowlę nazywa się kulturą wtórną. Wraz z dalszym pasażem komórek powstaje populacja komórek podobnych do fibroblastów, zdolna do szybkiej reprodukcji, z których większość zachowuje oryginalny zestaw chromosomów. Są to tak zwane komórki diploidalne. Przez seryjną hodowlę komórek uzyskuje się stabilne, ciągłe hodowle komórkowe. Podczas pasaży pojawiają się szybko dzielące się jednorodne komórki z heteroploidalnym zestawem chromosomów. Stabilne linie komórkowe mogą być jednowarstwowe lub zawieszone. Kultury jednowarstwowe rosną w postaci ciągłej warstwy na powierzchni szkła, natomiast kultury zawiesinowe rosną w postaci zawiesin w różnych naczyniach za pomocą urządzeń mieszających. Istnieje ponad 400 linii komórkowych pochodzących z 40 różne rodzaje zwierzęta (w tym naczelne, ptaki, gady, płazy, ryby, owady) i ludzie.

Kawałki można hodować na sztucznych pożywkach poszczególne narządy i tkanki (hodowle narządów). Hodowle tego typu zachowują strukturę tkanki, co jest szczególnie ważne w przypadku izolacji i pasażu wirusów, które nie rozmnażają się w niezróżnicowanych kulturach tkankowych (na przykład koronawirusów).

W zakażonych hodowlach komórkowych wirusy można wykryć na podstawie zmian w morfologii komórek, efektów cytopatycznych, które mogą być specyficzne, pojawienia się wtrąceń, poprzez oznaczenie antygenów wirusowych w komórce i płynie hodowlanym; ustalanie właściwości biologicznych potomstwa wirusa w płynie hodowlanym i miareczkowanie wirusów w hodowli tkankowej, zarodkach kurzych lub wrażliwych zwierzętach; poprzez identyfikację poszczególnych wirusowych kwasów nukleinowych w komórkach poprzez hybrydyzację molekularną lub akumulację kwasów nukleinowych metodą cytochemiczną z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Izolowanie wirusów jest procesem pracochłonnym i czasochłonnym. Przeprowadza się go w celu określenia rodzaju lub wariantu wirusa krążącego w populacji (na przykład w celu identyfikacji serowarianta wirusa grypy, dzikiego lub szczepionkowego szczepu wirusa polio itp.); w przypadkach, gdy konieczne jest podjęcie pilnych działań epidemiologicznych; kiedy pojawiają się nowe typy lub warianty wirusów; w razie potrzeby potwierdź wstępną diagnozę; do wskazywania wirusów w obiektach środowisko. Izolując wirusy, bierze się pod uwagę możliwość ich utrzymywania się w organizmie człowieka, a także wystąpienie infekcji mieszanej wywołanej przez dwa lub więcej wirusów. Genetycznie jednorodna populacja wirusa uzyskana z jednego wirionu nazywana jest klonem wirusa, a proces jej uzyskiwania nazywa się klonowaniem.

Do izolacji wirusów stosuje się infekcję podatnych zwierząt laboratoryjnych i zarodków kurzych, ale najczęściej stosuje się hodowlę tkankową. Obecność wirusa zwykle określa się na podstawie specyficznej degeneracji komórek (efekt cytopatyczny), tworzenia symplastów i syncytii, wykrywania wtrętów wewnątrzkomórkowych, a także specyficznego antygenu wykrywanego za pomocą immunofluorescencji, hemadsorpcji, hemaglutynacji (w przypadku wirusów hemaglutynujących) itp. . Objawy te można wykryć dopiero po 2-3 pasażach wirusa.

Zarodki kurze służą do izolowania wielu wirusów, takich jak wirusy grypy, a nowonarodzone myszy służą do izolowania niektórych wirusów Coxsackie i szeregu arbowirusów. Identyfikację izolowanych wirusów przeprowadza się za pomocą reakcje serologiczne i inne metody.

Podczas pracy z wirusami określa się ich miano. Miareczkowanie wirusów zwykle przeprowadza się w hodowli tkankowej, określając najwyższe rozcieńczenie cieczy zawierającej wirusa, przy którym następuje degeneracja tkanki, powstają wtrącenia i antygeny specyficzne dla wirusa. Metodę łysinkową można zastosować do miareczkowania wielu wirusów. Płytki lub negatywne kolonie wirusów to ogniska komórek zniszczonych przez wirusa w jednowarstwowej hodowli tkankowej pod powłoką agarową. Liczenie kolonii umożliwia ilościową analizę aktywności zakaźnej wirusów na podstawie założenia, że ​​jedna zakaźna cząsteczka wirusa tworzy jedną łysinkę. Płytki wykrywa się poprzez barwienie hodowli barwnikami dożylnymi, zwykle neutralną czerwienią; płytki nie adsorbują barwnika i dlatego są widoczne jako jasne plamki na tle wybarwionych żywych komórek. Miano wirusa wyraża się jako liczbę jednostek tworzących łysinki na 1 ml.

Oczyszczanie i zagęszczanie wirusów zwykle przeprowadza się poprzez ultrawirowanie różnicowe, a następnie wirowanie w gradiencie stężenia lub gęstości. Do oczyszczania wirusów stosuje się metody immunologiczne, chromatografię jonowymienną, immunosorbenty itp.

Diagnostyka laboratoryjna infekcji wirusowych obejmuje wykrycie patogenu lub jego składników w materiale klinicznym; izolowanie wirusa z tego materiału; serodiagnoza. Wybór metody diagnostyki laboratoryjnej w każdym indywidualnym przypadku zależy od charakteru choroby, okresu choroby i możliwości laboratorium. Nowoczesna diagnostyka infekcji wirusowych opiera się na metodach ekspresowych, które pozwalają uzyskać odpowiedź już w kilka godzin po pobraniu materiału klinicznego wczesne daty po chorobie, Należą do nich mikroskopia elektronowa i immunologiczna, a także immunofluorescencja, metoda hybrydyzacji molekularnej, wykrywanie przeciwciał klasy IgM itp.

Mikroskopia elektronowa wirusów wybarwionych ujemnie umożliwia różnicowanie wirusów i określenie ich stężenia. Zastosowanie mikroskopii elektronowej w diagnostyce infekcji wirusowych ogranicza się do przypadków, w których stężenie cząstek wirusa w materiale klinicznym jest dość wysokie (10 5 w 1 ml i wyżej). Wadą tej metody jest brak możliwości rozróżnienia wirusów należących do tej samej grupy taksonomicznej. Niedobór ten można przezwyciężyć poprzez zastosowanie immunologicznej mikroskopii elektronowej. Metoda polega na tworzeniu kompleksów immunologicznych poprzez dodanie specyficznej surowicy do cząstek wirusa, przy jednoczesnym zagęszczeniu cząstek wirusa, co pozwala na ich identyfikację. Metodę tę stosuje się także do wykrywania przeciwciał. W celu wyraźnej diagnostyki przeprowadza się badanie mikroskopem elektronowym ekstraktów tkankowych, kału, płynu z pęcherzyków i wydzieliny z nosogardzieli. Mikroskopia elektronowa szeroko stosowany do badania morfogenezy wirusa, jego możliwości są rozszerzane dzięki zastosowaniu znakowanych przeciwciał.

Metoda hybrydyzacji molekularnej, oparta na wykrywaniu specyficznych dla wirusa kwasów nukleinowych, umożliwia wykrywanie pojedynczych kopii genów i nie ma sobie równych pod względem czułości. Reakcja polega na hybrydyzacji komplementarnych nici DNA lub RNA (sondach) i utworzeniu struktur dwuniciowych. Najtańszą sondą jest sklonowany rekombinowany DNA. Sonda jest znakowana prekursorami radioaktywnymi (najczęściej radioaktywnym fosforem). Obiecujące jest zastosowanie reakcji kolorymetrycznych. Istnieje kilka opcji hybrydyzacji molekularnej: hybrydyzacja punktowa, hybrydyzacja blot, hybrydyzacja kanapkowa, hybrydyzacja in situ itp.

Przeciwciała klasy IgM pojawiają się wcześniej niż przeciwciała klasy G (w 3-5 dniu choroby) i znikają po kilku tygodniach, zatem ich wykrycie wskazuje na świeżą infekcję. Przeciwciała klasy IgM wykrywa się metodą immunofluorescencji lub testu immunoenzymatycznego z użyciem surowic anty-m (surowice przeciwko łańcuchom ciężkim IgM).

Metody serologiczne w wirusologii opierają się na klasycznych reakcjach immunologicznych (patrz. Metody badań immunologicznych ): reakcje wiązania dopełniacza, hamowanie hemaglutynacji, neutralizacja biologiczna, immunodyfuzja, hemaglutynacja pośrednia, hemoliza promieniowa, immunofluorescencja, test immunologiczny enzymatyczny, test radioimmunologiczny. Opracowano mikrometody wielu reakcji, a ich techniki są stale udoskonalane. Metody te służą do identyfikacji wirusów przy pomocy zestawu znanych surowic oraz do serodiagnostyki w celu określenia wzrostu przeciwciał w drugiej surowicy w porównaniu do pierwszej (pierwszą surowicę pobiera się w pierwszych dniach po chorobie, drugą - po 2- 3 tygodnie). Wartość diagnostyczną stanowi nie mniej niż czterokrotny wzrost przeciwciał w drugiej surowicy. Jeśli wykrycie przeciwciał klasy IgM wskazuje na niedawną infekcję, wówczas przeciwciała klasy IgC utrzymują się przez kilka lat, a czasem przez całe życie.

Aby zidentyfikować poszczególne antygeny wirusów i przeciwciała przeciwko nim w złożonych mieszaninach bez wstępnego oczyszczania białek, stosuje się immunoblotting. Metoda łączy frakcjonowanie białek metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z późniejszą immunoindykacją białek metodą enzymatyczną. Separacja białek zmniejsza zapotrzebowanie na białko czystość chemiczna antygenu i pozwala na identyfikację poszczególnych par antygen-przeciwciało. Zadanie to ma znaczenie np. w serodiagnostyce zakażenia wirusem HIV, gdzie fałszywie dodatnie reakcje w testach immunoenzymatycznych są spowodowane obecnością przeciwciał przeciwko antygenom komórkowym, które powstają w wyniku niedostatecznego oczyszczenia białek wirusowych. Identyfikacja przeciwciał w surowicy pacjentów przeciwko wewnętrznym i zewnętrznym antygenom wirusowym pozwala określić stopień zaawansowania choroby, a w przypadku analizy populacji zmienność białek wirusowych. Immunoblotting w przypadku zakażenia wirusem HIV służy jako test potwierdzający w celu identyfikacji poszczególnych antygenów wirusowych i przeciwciał przeciwko nim. Analizując populacje, metodę stosuje się do określenia zmienności białek wirusowych. Ogromną wartością metody jest możliwość analizy antygenów syntetyzowanych przy użyciu technologii rekombinacji DNA, ustalenia ich wielkości oraz obecności determinant antygenowych.

Badania wirusologiczne obejmują dwa główne etapy: izolację wirusów i ich identyfikację. Materiałem do badań wirusologicznych może być krew, inne płyny biologiczne i patologiczne, biopsje narządów i tkanek.

W celu zdiagnozowania infekcji arbowirusowych często wykonuje się wirusologiczne badania krwi. Wirusy wścieklizny można znaleźć w ślinie, świnka, opryszczka zwykła Wymazy z nosogardzieli służą do izolacji patogenów grypy i innych ostrych infekcji wirusowych dróg oddechowych, odry. Adenowirusy można znaleźć w wymazach ze spojówek. Z kału izolowane są różne entero-, adno-, pso-, nora- i rotawirusy.

Do izolacji wirusów wykorzystuje się hodowle komórkowe, zarodki kurze, a czasami zwierzęta laboratoryjne.

Większość wirusów chorobotwórczych wyróżnia się obecnością specyficzności tkankowej i typu; na przykład wirus polio rozmnaża się tylko w komórkach naczelnych, dlatego do wyizolowania konkretnego wirusa stosuje się odpowiednią hodowlę tkankową. Aby wyizolować nieznany patogen, zaleca się jednoczesne zakażenie 3-4 hodowli komórkowych, zakładając, że któraś z nich może być wrażliwa. O obecności wirusa w zakażonych hodowlach komórkowych decyduje rozwój specyficznej degeneracji komórek, tj. działanie cytopatogenów, wykrywanie wtrętów wewnątrzkomórkowych, a także na podstawie wykrywania określonego antygenu metodą immunofluorescencji, dodatnich reakcji hemadsorpcji i hemaglutynacji.

Zarodki ptasie ze słabo zróżnicowanymi tkankami nadają się do hodowli wielu wirusów. W większości przypadków wykorzystuje się zarodki kurze. Wirusy namnażające się w zarodkach mogą powodować ich śmierć (arbowirusy), pojawienie się zmian w błonie kosmówkowo-omoczniowej (wirusy ospy) lub w organizmie zarodka, nagromadzenie glutenu w płynach embrionalnych (wirusy grypy, świnki ) i antygen wirusowy wiążący dopełniacz .

Identyfikacja wirusów odbywa się metodami immunologicznymi: reakcja hamowania hemaglutynacji, wiązanie dopełniacza, neutralizacja, wytrącanie żelu, immunofluorescencja.

Więcej na ten temat Metoda wirusologiczna:

1. Ocena podstawowych danych antropometrycznych metodą parametryczną (metoda sigma)
2. Leczenie metodą wygaszenia komunikacji warunkowej i metodą treningu wymuszonego
3. 2. Porównawcza metoda prawna – prywatna metoda naukowa nauk prawnych
4. NOWOCZESNE METODY DIAGNOSTYKI I WYBORU METOD LECZENIA PODśluzOWEGO MIĘŚNIAKA MACICY
5. 5.4. Pojęcie i struktura ogólnej metody badawczej jako metody działania praktycznego
6. Temat 8. MIKROBIOLOGICZNE METODY BADANIA ZMIENNOŚCI I MECHANIZMÓW PRZEKAZYWANIA INFORMACJI DZIEDZICZNEJ. ZASTOSOWANIE METOD GENETYCZNYCH DO TWORZENIA NOWYCH LEKÓW
7. Temat 15. PATOGENICZNOŚĆ I WIRULENCJA MIKROORGANIZMÓW. CZYNNIKI WIRULENCJI. METODY ZAKAŻANIA ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH. ANTYGENY, METODY ICH UZYSKIWANIA. PRZECIWCIAŁA. REAKCJE ODPORNOŚCIOWE I ICH PRAKTYCZNE ZASTOSOWANIE. FAGOCYTOZA

Metody badań wirusologicznych- metody badania biologii wirusów i ich identyfikacji. W wirusologii szeroko stosowane są metody biologii molekularnej, za pomocą których udało się ustalić strukturę molekularną cząstek wirusa, metody ich przenikania do komórki i cechy reprodukcji wirusa, pierwotną strukturę wirusowych kwasów nukleinowych i białek. Trwają prace nad metodami określania sekwencji elementów składowych wirusowych kwasów nukleinowych i aminokwasów białkowych. Możliwe staje się powiązanie funkcji kwasów nukleinowych i kodowanych przez nie białek z sekwencją nukleotydów oraz ustalenie przyczyn procesów wewnątrzkomórkowych odgrywających ważną rolę w patogenezie infekcji wirusowej.

Metody badań wirusologicznych opierają się również na procesach immunologicznych (oddziaływanie antygenu z przeciwciałami), właściwościach biologicznych wirusa (zdolność do hemaglutynacji, hemolizy, aktywność enzymatyczna), cechach interakcji wirusa z komórką gospodarza (charakter efektu cytopatycznego , tworzenie wtrętów wewnątrzkomórkowych itp.).

W diagnostyce infekcji wirusowych, w hodowli, izolacji i identyfikacji wirusów, a także w produkcji preparatów szczepionkowych, szeroko stosuje się metodę hodowli tkankowej i komórkowej. Stosuje się pierwotne, wtórne, stabilne, ciągłe i diploidalne hodowle komórkowe. Hodowle pierwotne uzyskuje się poprzez zdyspergowanie tkanki za pomocą enzymów proteolitycznych (trypsyna, kolagenaza). Źródłem komórek mogą być tkanki i narządy (najczęściej nerki) zarodków ludzkich i zwierzęcych. Zawiesinę komórek w pożywce umieszcza się w tzw. materacykach, butelkach lub szalkach Petriego, gdzie po przyczepieniu do powierzchni naczynia komórki zaczynają się namnażać. W przypadku infekcji wirusowej zwykle stosuje się monowarstwę komórkową. Pożywkę odsącza się, dodaje się zawiesinę wirusa w określonych rozcieńczeniach, a po kontakcie z komórkami dodaje się świeżą pożywkę, zwykle bez surowicy.

Komórki większości kultur pierwotnych można hodować wtórnie; taką hodowlę nazywa się kulturą wtórną. Wraz z dalszym pasażem komórek powstaje populacja komórek podobnych do fibroblastów, zdolna do szybkiej reprodukcji, z których większość zachowuje oryginalny zestaw chromosomów. Są to tak zwane komórki diploidalne. Przez seryjną hodowlę komórek uzyskuje się stabilne, ciągłe hodowle komórkowe. Podczas pasaży pojawiają się szybko dzielące się jednorodne komórki z heteroploidalnym zestawem chromosomów. Stabilne linie komórkowe mogą być jednowarstwowe lub zawieszone. Kultury jednowarstwowe rosną w postaci ciągłej warstwy na powierzchni szkła, natomiast kultury zawiesinowe rosną w postaci zawiesin w różnych naczyniach za pomocą urządzeń mieszających. Istnieje ponad 400 linii komórkowych pochodzących od 40 różnych gatunków zwierząt (w tym naczelnych, ptaków, gadów, płazów, ryb, owadów) i ludzi.

Fragmenty poszczególnych narządów i tkanek (hodowle narządów) można hodować w sztucznych pożywkach. Hodowle tego typu zachowują strukturę tkanki, co jest szczególnie ważne w przypadku izolacji i pasażu wirusów, które nie rozmnażają się w niezróżnicowanych kulturach tkankowych (na przykład koronawirusów).

W zakażonych hodowlach komórkowych wirusy można wykryć na podstawie zmian w morfologii komórek, efektów cytopatycznych, które mogą być specyficzne, pojawienia się wtrąceń, poprzez oznaczenie antygenów wirusowych w komórce i płynie hodowlanym; ustalanie właściwości biologicznych potomstwa wirusa w płynie hodowlanym i miareczkowanie wirusów w hodowli tkankowej, zarodkach kurzych lub wrażliwych zwierzętach; poprzez identyfikację poszczególnych wirusowych kwasów nukleinowych w komórkach poprzez hybrydyzację molekularną lub akumulację kwasów nukleinowych metodą cytochemiczną z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Izolowanie wirusów jest procesem pracochłonnym i czasochłonnym. Przeprowadza się go w celu określenia rodzaju lub wariantu wirusa krążącego w populacji (na przykład w celu identyfikacji serowarianta wirusa grypy, dzikiego lub szczepionkowego szczepu wirusa polio itp.); w przypadkach, gdy konieczne jest podjęcie pilnych działań epidemiologicznych; kiedy pojawiają się nowe typy lub warianty wirusów; w razie potrzeby potwierdź wstępną diagnozę; do wykrywania wirusów w obiektach środowiskowych. Izolując wirusy, bierze się pod uwagę możliwość ich utrzymywania się w organizmie człowieka, a także wystąpienie infekcji mieszanej wywołanej przez dwa lub więcej wirusów. Genetycznie jednorodna populacja wirusa uzyskana z jednego wirionu nazywana jest klonem wirusa, a proces jej uzyskiwania nazywa się klonowaniem.

Do izolacji wirusów stosuje się infekcję podatnych zwierząt laboratoryjnych i zarodków kurzych, ale najczęściej stosuje się hodowlę tkankową. Obecność wirusa zwykle określa się na podstawie specyficznej degeneracji komórek (efekt cytopatyczny), tworzenia symplastów i syncytii, wykrywania wtrętów wewnątrzkomórkowych, a także specyficznego antygenu wykrywanego za pomocą immunofluorescencji, hemadsorpcji, hemaglutynacji (w przypadku wirusów hemaglutynujących) itp. . Objawy te można wykryć dopiero po 2-3 pasażach wirusa.

Do wyizolowania szeregu wirusów, takich jak wirusy grypy, stosuje się zarodki kurze, a do izolowania niektórych wirusów Coxsackie i szeregu arbowirusów wykorzystuje się nowonarodzone myszy. Identyfikację wyizolowanych wirusów przeprowadza się za pomocą reakcji serologicznych i innych metod.

Podczas pracy z wirusami określa się ich miano. Miareczkowanie wirusów zwykle przeprowadza się w hodowli tkankowej, określając najwyższe rozcieńczenie cieczy zawierającej wirusa, przy którym następuje degeneracja tkanki, powstają wtrącenia i antygeny specyficzne dla wirusa. Metodę łysinkową można zastosować do miareczkowania wielu wirusów. Płytki lub negatywne kolonie wirusów to ogniska komórek zniszczonych przez wirusa w jednowarstwowej hodowli tkankowej pod powłoką agarową. Liczenie kolonii umożliwia ilościową analizę aktywności zakaźnej wirusów na podstawie założenia, że ​​jedna zakaźna cząsteczka wirusa tworzy jedną łysinkę. Płytki wykrywa się poprzez barwienie hodowli barwnikami dożylnymi, zwykle neutralną czerwienią; płytki nie adsorbują barwnika i dlatego są widoczne jako jasne plamki na tle wybarwionych żywych komórek. Miano wirusa wyraża się jako liczbę jednostek tworzących łysinki na 1 ml.

Oczyszczanie i zagęszczanie wirusów zwykle przeprowadza się poprzez ultrawirowanie różnicowe, a następnie wirowanie w gradiencie stężenia lub gęstości. Do oczyszczania wirusów stosuje się metody immunologiczne, chromatografię jonowymienną, immunosorbenty itp.

Diagnostyka laboratoryjna infekcji wirusowych obejmuje wykrycie patogenu lub jego składników w materiale klinicznym; izolowanie wirusa z tego materiału; serodiagnoza. Wybór metody diagnostyki laboratoryjnej w każdym indywidualnym przypadku zależy od charakteru choroby, okresu choroby i możliwości laboratorium. Współczesna diagnostyka infekcji wirusowych opiera się na metodach ekspresowych, które pozwalają uzyskać odpowiedź już kilka godzin po pobraniu materiału klinicznego we wczesnych stadiach po chorobie. Należą do nich mikroskopia elektronowa i immunoelektronowa, a także immunofluorescencja, czyli metoda hybrydyzacji molekularnej , wykrywanie przeciwciał klasy IgM itp.

Mikroskopia elektronowa wirusów wybarwionych ujemnie umożliwia różnicowanie wirusów i określenie ich stężenia. Zastosowanie mikroskopii elektronowej w diagnostyce infekcji wirusowych ogranicza się do przypadków, w których stężenie cząstek wirusa w materiale klinicznym jest dość wysokie (10 5 w 1 ml i wyżej). Wadą tej metody jest brak możliwości rozróżnienia wirusów należących do tej samej grupy taksonomicznej. Niedobór ten można przezwyciężyć poprzez zastosowanie immunologicznej mikroskopii elektronowej. Metoda polega na tworzeniu kompleksów immunologicznych poprzez dodanie specyficznej surowicy do cząstek wirusa, przy jednoczesnym zagęszczeniu cząstek wirusa, co pozwala na ich identyfikację. Metodę tę stosuje się także do wykrywania przeciwciał. W celu wyraźnej diagnostyki przeprowadza się badanie mikroskopem elektronowym ekstraktów tkankowych, kału, płynu z pęcherzyków i wydzieliny z nosogardzieli. Mikroskopia elektronowa jest szeroko stosowana do badania morfogenezy wirusa; jej możliwości są rozszerzane dzięki zastosowaniu znakowanych przeciwciał.

Metoda hybrydyzacji molekularnej, oparta na wykrywaniu specyficznych dla wirusa kwasów nukleinowych, umożliwia wykrywanie pojedynczych kopii genów i nie ma sobie równych pod względem czułości. Reakcja polega na hybrydyzacji komplementarnych nici DNA lub RNA (sondach) i utworzeniu struktur dwuniciowych. Najtańszą sondą jest sklonowany rekombinowany DNA. Sonda jest znakowana prekursorami radioaktywnymi (najczęściej radioaktywnym fosforem). Obiecujące jest zastosowanie reakcji kolorymetrycznych. Istnieje kilka opcji hybrydyzacji molekularnej: hybrydyzacja punktowa, hybrydyzacja blot, hybrydyzacja kanapkowa, hybrydyzacja in situ itp.

Przeciwciała klasy IgM pojawiają się wcześniej niż przeciwciała klasy G (w 3-5 dniu choroby) i znikają po kilku tygodniach, zatem ich wykrycie wskazuje na świeżą infekcję. Przeciwciała klasy IgM wykrywa się metodą immunofluorescencji lub testu immunoenzymatycznego z użyciem surowic anty-m (surowice przeciwko łańcuchom ciężkim IgM).

Metody serologiczne w wirusologii opierają się na klasycznych reakcjach immunologicznych (patrz. Metody badań immunologicznych ): reakcje wiązania dopełniacza, hamowanie hemaglutynacji, neutralizacja biologiczna, immunodyfuzja, hemaglutynacja pośrednia, hemoliza promieniowa, immunofluorescencja, test immunologiczny enzymatyczny, test radioimmunologiczny. Opracowano mikrometody wielu reakcji, a ich techniki są stale udoskonalane. Metody te służą do identyfikacji wirusów przy pomocy zestawu znanych surowic oraz do serodiagnostyki w celu określenia wzrostu przeciwciał w drugiej surowicy w porównaniu do pierwszej (pierwszą surowicę pobiera się w pierwszych dniach po chorobie, drugą - po 2- 3 tygodnie). Wartość diagnostyczną stanowi nie mniej niż czterokrotny wzrost przeciwciał w drugiej surowicy. Jeśli wykrycie przeciwciał klasy IgM wskazuje na niedawną infekcję, wówczas przeciwciała klasy IgC utrzymują się przez kilka lat, a czasem przez całe życie.

Aby zidentyfikować poszczególne antygeny wirusów i przeciwciała przeciwko nim w złożonych mieszaninach bez wstępnego oczyszczania białek, stosuje się immunoblotting. Metoda łączy frakcjonowanie białek metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z późniejszą immunoindykacją białek metodą enzymatyczną. Separacja białek zmniejsza wymagania dotyczące czystości chemicznej antygenu i umożliwia identyfikację poszczególnych par antygen-przeciwciało. Zadanie to ma znaczenie np. w serodiagnostyce zakażenia wirusem HIV, gdzie fałszywie dodatnie reakcje w testach immunoenzymatycznych są spowodowane obecnością przeciwciał przeciwko antygenom komórkowym, które powstają w wyniku niedostatecznego oczyszczenia białek wirusowych. Identyfikacja przeciwciał w surowicy pacjentów przeciwko wewnętrznym i zewnętrznym antygenom wirusowym pozwala określić stopień zaawansowania choroby, a w przypadku analizy populacji zmienność białek wirusowych. Immunoblotting w przypadku zakażenia wirusem HIV służy jako test potwierdzający w celu identyfikacji poszczególnych antygenów wirusowych i przeciwciał przeciwko nim. Analizując populacje, metodę stosuje się do określenia zmienności białek wirusowych. Ogromną wartością metody jest możliwość analizy antygenów syntetyzowanych przy użyciu technologii rekombinacji DNA, ustalenia ich wielkości oraz obecności determinant antygenowych.

Bibliografia: Bukrinskaya A.G. Wirusologia, M., 1986; Wirusologia, Metody, wyd. B. Meikhi, tłum. z języka angielskiego, M., 1988; Podręcznik metod badań mikrobiologicznych i wirusologicznych, wyd. MO Birgera, M., 1982.