Reakcija na DNA polimerazo je pozitivna. PCR analiza: kaj je to? Kako narediti PCR test. PCR je glavna metoda za odkrivanje latentnih okužb

Verižna reakcija s polimerazo (PCR)- je metoda biokemijske tehnologije v molekularni biologiji, ki se izvaja z namenom povečanja ene ali več kopij fragmentov DNK za več stopinj, kar vam omogoča ustvarjanje od več tisoč do milijonov kopij določenega zaporedja DNK.

Metoda PCR, ki jo je leta 1983 razvil Cary Mullis, je danes pogosta in pogosto nepogrešljiva metoda, ki se uporablja v medicinskih in bioloških raziskovalnih laboratorijih za številne različne namene. Ti vključujejo kloniranje DNK za sekvenciranje, filogenijo na podlagi DNK ali funkcionalno analizo genov; diagnoza dednih bolezni; identifikacija genetskih prstnih odtisov (uporabljajo se v vejah forenzične znanosti in pri ugotavljanju očetovstva), kot tudi odkrivanje in diagnosticiranje nalezljivih bolezni. Leta 1993 je Mullis skupaj z Michaelom Smithom prejel Nobelovo nagrado za kemijo za njuno delo na PCR.

Metoda temelji na termičnem kroženju, sestavljenem iz ponavljajočih se ciklov reakcij segrevanja in ohlajanja za denaturacijo in replikacijo DNK z encimi. Primerji (kratki deli DNK), ki vsebujejo zaporedja, ki so komplementarna ciljnemu mestu skupaj z DNK polimerazo (po kateri je metoda dobila ime), so ključne komponente za spodbujanje selektivnega in ponovnega pomnoževanja. V postopku PCR se sama sintetizirana DNK uporabi kot matrica za replikacijo, kar sproži verižno reakcijo, v kateri se matricna DNK eksponentno pomnoži. PCR je mogoče bistveno spremeniti za izvajanje širokega spektra genetskih manipulacij.

Skoraj vse aplikacije PCR uporabljajo termostabilno polimerazo DNA, kot je polimeraza Taq, encim, ki je bil prvotno izoliran iz bakterij. Termusaquaticus. Ta DNK-polimeraza encimsko sestavi novo verigo DNK iz gradnikov DNK – nukleotidov, z uporabo enoverižne DNK kot predloge in oligonukleotidov DNK (imenovanih tudi primerji DNK), ki so potrebni za začetek sinteze DNK. Velika večina metod PCR uporablja termično kroženje, tj. izmenično segrevanje in ohlajanje vzorca PCR v določenem nizu temperaturnih korakov. Ti koraki toplotnega cikla so potrebni najprej za fizično ločitev dveh verig dvojne vijačnice DNK pri visoki temperaturi v procesu, imenovanem denaturacija DNK. Pri nižji temperaturi bo vsaka veriga uporabljena kot matrica pri sintezi DNA s pomočjo DNA polimeraze, da se selektivno pomnoži ciljna regija DNA. Selektivnost rezultatov PCR z uporabo primerjev, ki so komplementarni ciljni regiji DNA za pomnoževanje pod določenimi pogoji termičnega cikla.

Načela PCR diagnostike

PCR se uporablja za pomnoževanje določenega odseka verige DNK (tarčne DNK). Večina metod PCR običajno pomnoži fragmente DNA do ~10.000 baznih parov (kb), čeprav nekatere metode omogočajo povečanje velikosti fragmentov do 40 kb. Reakcija proizvede omejeno količino končnega pomnoženega produkta, ki je nadzorovan z razpoložljivimi reagenti v reakciji in povratno inhibicijo reakcijskih produktov.

Osnovni komplet PCR zahteva več komponent in reagentov. Tej vključujejo:

• DNK šablona, ki vsebuje ciljno regijo DNK, ki jo je treba pomnožiti.
• dva primerja, komplementarna 3' koncem vsake smiselne in protismiselne verige tarčne DNA.
• Taq polimeraza ali drugo DNA polimerazo, ki deluje pri optimalni temperaturi okoli 70 °C.
• Deoksinukleozidni trifosfati(dNTPs; trifosfatne skupine, ki vsebujejo nukleotide), gradnike, iz katerih DNA polimeraza sintetizira novo verigo DNA.
• puferska raztopina, ki zagotavlja ustrezne kemične pogoje za optimalno aktivnost in stabilnost DNA polimeraze.
• dvovalentni kationi, magnezijevi ali manganovi ioni; Običajno se uporablja Mg2+, vendar se Mn2+ lahko uporablja tudi za PCR-posredovano mutagenezo DNA, saj višje koncentracije Mn2+ povečajo stopnjo napak med sintezo DNA.
• Enovalentni kationi kalijevi ioni.

PCR se običajno izvaja v reakcijskem volumnu 10-200 µl v majhnih reakcijskih epruvetah (volumen 0,2-0,5 ml) v termičnem ciklerju-ojačevalniku. Cikel ogreva in ohlaja reakcijske cevi, da doseže temperature, potrebne za vsako stopnjo reakcije. Številni sodobni ciklerji uporabljajo Peltierjev učinek, ki omogoča ogrevanje in hlajenje sklopa cevi PCR preprosto z obračanjem smeri električnega toka. Tankostenske reakcijske cevi spodbujajo ugodno toplotno prevodnost, da se zagotovi hitro toplotno ravnovesje. Starejši ciklerji, ki nimajo ogrevanega pokrova, potrebujejo plast olja na površini reakcijske mešanice ali kroglico voska v viali.

Vrstni red postopka

Običajno je PCR sestavljen iz niza 20-40 ponavljajočih se temperaturnih sprememb, imenovanih cikli, pri čemer je vsak cikel običajno sestavljen iz 2-3 ločenih temperaturnih korakov, običajno treh. Ciklanje se pogosto začne in konča z enim samim temperaturnim korakom (ti pričakovanje) pri visoki temperaturi (> 90 °C) za končno ekspanzijo izdelka ali kratkotrajno skladiščenje. Uporabljene temperature in trajanje njihove uporabe v posameznem ciklu so odvisne od številnih parametrov. Ti vključujejo encim, ki se uporablja za sintezo DNA, koncentracijo dvovalentnih ionov in dNTP v reakciji ter tališče (Tm) začetnih oligonukleotin.

• Stopnja inicializacije: Ta korak je sestavljen iz segrevanja reakcije na temperaturo 94-96 °C (ali 98 °C, če se uporabljajo zelo toplotno stabilne polimeraze), ki se izvaja 1-9 minut. Korak je potreben samo za polimeraze DNA, ki zahtevajo toplotno aktivacijo, tako imenovani PCR z vročim zagonom.
• Korak denaturacije: To je prvi redni dogodek termičnega cikla in obsega segrevanje reakcije na 94-98 °C za 20-30 sekund. To povzroči cepitev predloge DNA z uničenjem vodikovih vezi med komplementarnimi bazami in nastanek enoverižnih molekul DNA.
• Korak žarjenja: Reakcijsko temperaturo znižamo na 50-65°C za 20-40 sekund, kar omogoči, da se primerji vežejo na predlogo enoverižne DNA. Običajno je temperatura žarjenja približno 3-5 stopinj Celzija pod Tm uporabljenih primerjev. Stabilne vodikove vezi DNA-DNA nastanejo šele, ko se zaporedje primerja bolj ujema s predlogo zaporedja. Polimeraza se veže na hibrid primer-šablone in sproži sintezo DNA.
• Stopnja ekspanzije / raztezka: Temperatura med tem korakom je odvisna od uporabljene DNA polimeraze; Polimeraza Taq ima optimalno temperaturo delovanja pri 75-80 °C; za ta encim se običajno uporablja temperatura 72 °C. Na tej stopnji DNA polimeraza sintetizira novo DNA verigo, ki je komplementarna verigi DNK predloge, tako da doda dNTP, ki so komplementarni predlogi v smeri 5" do 3", in tako poveže 5"-fosfatno skupino dNTP s 3"- hidroksilno skupino na koncu nastale (razširjajoče se) DNA. Čas ekspanzije je odvisen od uporabljene DNA polimeraze in dolžine fragmenta DNA, ki ga je treba pomnožiti. Običajno pri optimalni temperaturi polimeraza DNA polimerizira tisoč baz na minuto. V optimalnih pogojih, tj. v odsotnosti omejitev zaradi omejujočih substratov ali reagentov se pri vsakem koraku ekspanzije količina ciljne DNA podvoji, kar ima za posledico eksponentno (geometrično) pomnoževanje fragmenta DNA.
• Končna razširitev: To je edini korak, ki se včasih izvede pri 70-74 °C 5-15 minut po zadnjem ciklu PCR, da se zagotovi, da se je morebitna preostala enoverižna DNK popolnoma razširila.
• Končno pričakovanje: Ta korak pri 4–15 °C za nedoločen čas se lahko uporablja za kratkotrajno reakcijo. Za preverjanje, ali je PCR sintetiziral pričakovani fragment DNK (včasih imenovan tudi "amplimer" ali "amplikon"), se uporabi elektroforeza v agaroznem gelu za ločevanje produktov PCR po velikosti. Velikost produktov PCR je določena s primerjavo z lestvico DNA (označevalec molekulske mase), ki vsebuje fragmente DNA znane velikosti, izvedeno na gelu skupaj s produkti PCR.

Faze verižne reakcije s polimerazo

Postopek PCR lahko razdelimo na tri korake:

1. Eksponentno ojačanje: Med vsakim ciklom se količina produkta podvoji (ob predpostavki 100-odstotne učinkovitosti reakcije). Reakcija je zelo občutljiva: potrebna je le majhna količina DNK.
2. Stopnja izravnave: reakcija se upočasni, ko DNA polimeraza izgubi aktivnost in poraba reagentov, kot so dNTP in primerji, povzroči, da postanejo omejevalni .
3. Planota: Izdelek se ne kopiči več zaradi izčrpanosti reagentov in encimov.

PCR optimizacija

V praksi lahko PCR ne uspe iz različnih razlogov, zlasti zaradi njegove občutljivosti na kontaminacijo, ki povzroči pomnoževanje stranskih produktov DNK. V zvezi s tem so bile razvite številne tehnike in postopki za optimizacijo pogojev PCR. Kontaminacijo s tujo DNK obravnavajo laboratorijski protokoli in postopki, ki čistijo mešanice pred PCR potencialnih kontaminantov DNK. To običajno vključuje ločevanje kompletov PCR od območij analize ali čiščenja produktov PCR, uporabo plastičnih pripomočkov za enkratno uporabo in temeljito čiščenje delovne površine med koraki reakcije. Tehnike načrtovanja primerjev igrajo pomembno vlogo pri izboljšanju izolacije produktov PCR in pri preprečevanju nastajanja stranskih produktov, uporaba alternativnih komponent pufra ali encimov polimeraze pa lahko pomaga pri pomnoževanju dolgih ali drugače problematičnih regij DNA. Dodatek reagentov, kot je formamid, v pufrske sisteme lahko poveča specifičnost in izkoristek PCR. Računalniška simulacija teoretičnih rezultatov PCR (elektronska PCR) se lahko izvede kot pomoč pri oblikovanju primerja.

Uporaba PCR

Selektivna izolacija DNK

PCR omogoča izolacijo fragmentov DNA iz genomske DNA s selektivnim pomnoževanjem specifične regije DNA. Ta uporaba PCR dopolnjuje številne metode, kot je ustvarjanje hibridizacijskih sond za Southern ali Northern blotting in metode kloniranja DNK, ki zahtevajo velike količine DNK, ki predstavljajo specifično regijo DNK. PCR zagotavlja tem metodam visoko vsebnost čiste DNK, kar omogoča analizo vzorcev DNK, tudi z majhno količino vhodnega materiala.

Druge aplikacije PCR vključujejo sekvenciranje DNA za identifikacijo neznanih zaporedij, pomnoženih s PCR, pri čemer se lahko eden od pomnoževalnih primerjev uporabi pri Sangerjevem sekvenciranju, izolacija zaporedja DNA za pospešitev tehnologij rekombinantne DNA, ki vključuje vstavljanje zaporedja DNA v plazmid ali genetski material drugega organizma. Kolonije bakterij (E. coli) je mogoče hitro pregledati s PCR, da se popravi zasnova vektorske DNK. PCR se lahko uporablja tudi za genetski prstni odtis; tehnika, ki se uporablja v sodni medicini za identifikacijo osebe ali organizma s primerjavo eksperimentalne DNK z različnimi metodami PCR.

Nekatere metode PCR "prstnih odtisov" imajo visoko diskriminatorno moč in se lahko uporabljajo za določanje genetskih odnosov med posamezniki, na primer med starši in otroki ali med brati in sestrami, in se uporabljajo pri testiranju očetovstva. To tehniko je mogoče uporabiti tudi za določanje evolucijskih odnosov med organizmi.

Pomnoževanje in kvantifikacija DNK

Ker PCR poveča število kopij ciljnih regij DNK, lahko PCR uporabimo za analizo zelo majhnih količin vzorca. To je pogosto ključnega pomena za forenzične preiskave, kjer so kot dokazi na voljo le sledovi DNK. PCR se lahko uporablja tudi za analizo starodavne DNK, ki je stara več deset tisoč let. Te metode PCR so bile uspešno uporabljene na živalih, kot je 40.000 let star mamut, pa tudi na človeški DNK v aplikacijah, od analize egipčanskih mumij do identifikacije ruskega carja.

Kvantitativne metode PCR ocenijo količino danega zaporedja, prisotnega v vzorcu, metoda, ki se pogosto uporablja za kvantifikacijo ravni izražanja genov. PCR v realnem času je uveljavljeno orodje za kvantifikacijo DNK, ki meri kopičenje DNK izdelka po vsakem ciklu pomnoževanja PCR.

PCR pri diagnozi bolezni

PCR omogoča zgodnjo diagnozo malignih bolezni, kot sta levkemija in limfom, ki je trenutno zelo razvita v raziskavah raka in se že rutinsko uporablja. PCR se lahko izvede neposredno na vzorcih genomske DNK za odkrivanje malignih celic, specifičnih za translokacijo, z občutljivostjo, ki je vsaj 10.000-krat višja od drugih metod.

PCR omogoča tudi odkrivanje nekultiviranih ali počasi rastočih organizmov, kot so mikobakterije, anaerobne bakterije in virusi iz tkivnih kultur in živalskih modelov. Osnova za PCR diagnostične aplikacije na področju mikrobiologije je identifikacija povzročiteljev okužb in razlikovanje nepatogenih sevov od patogenih zaradi specifičnih genov.

Virusno DNA lahko odkrijemo tudi s PCR. Primerji morajo biti specifični za ciljna zaporedja DNA virusa, PCR pa se lahko uporablja za diagnostične teste DNA ali določanje zaporedja virusnega genoma. Visoka občutljivost PCR omogoča odkrivanje virusov kmalu po okužbi in še pred izbruhom bolezni. To zgodnje odkrivanje virusa bi lahko dalo zdravnikom pomembne možnosti zdravljenja. Količino virusa (»virusno breme«) pri bolniku lahko določimo tudi s kvantitativno analizo DNK na osnovi PCR.

Različice osnovnih metod verižne reakcije s polimerazo

• Alelno specifična PCR: diagnostična ali klonska metoda, ki temelji na polimorfizmih enega nukleotida (SNP) (razlike v eni bazi v DNA). Zahteva predhodno poznavanje zaporedja DNA, vključno z razlikami med aleli, in uporablja primerje, katerih 3' konci segajo čez SNP. Strogo PCR pomnoževanje je veliko manj učinkovito v prisotnosti neujemanja med predlogo in primerjem, zato je uspešno pomnoževanje s specifičnim za SNP primer signalizira prisotnost specifičnih SNP v zaporedju.
• PCR sklop ali polimerazni ciklični sklop (PCP): umetna sinteza dolgih zaporedij DNA s PCR na skupini dolgih oligonukleotidov s kratkimi prekrivajočimi se segmenti. Oligonukleotidi izmenjujejo smeri smiselnih in protismiselnih verig, prekrivajoči se segmenti pa določajo vrstni red fragmentov PCR, s čimer selektivno ustvarijo končni dolgi produkt DNK.
• Asimetrični PCR: prednostno pomnoži eno verigo DNK v predlogi dvoverižne DNK. Uporablja se pri sekvenciranju in hibridizacijskem sondiranju, kjer je potrebno pomnoževanje samo ene od dveh komplementarnih verig. PCR izvajamo kot običajno, vendar z velikim presežkom primerjev za verigo, namenjeno pomnoževanju. Zaradi počasnega (aritmetično napredovanje) pomnoževanja na koncu reakcije po uporabi omejujočega primerja so potrebni dodatni cikli PCR. Najnovejša modifikacija tega postopka, znana kot "LATE-PCR" (linearnost po eksponentni fazi - PCR), uporablja omejevalni primer z višjim tališčem (Tm) kot presežek primerja, da se ohrani učinkovitost reakcije, saj se koncentracija omejujočega primerja zmanjša. sredi reakcije.
• Dial-out PCR: zelo vzporedna metoda za pridobivanje natančnih molekul DNK za sintezo genov. Kompleksna skupina molekul DNK je spremenjena z edinstvenimi bočnimi oznakami v masivno vzporedno zaporedje. Primerji, usmerjeni v oznake, nato zagotovijo sekvencirane molekule s PCR.
• Od helikaze odvisno pomnoževanje: podobno kot tradicionalni PCR, vendar zahteva konstantno temperaturo kot kroženje skozi cikle denaturacije in žarjenja/ekspanzije. Namesto toplotne denaturacije se uporablja DNK helikaza, encim, ki odvija DNK.
• PCR z vročim zagonom: Tehnika, ki zmanjša nespecifično pomnoževanje med začetno nastavitvijo korakov PCR. Lahko se izvede ročno s segrevanjem reakcijskih komponent na temperaturo denaturacije (npr. 95 °C) pred dodajanjem polimeraze. Razviti so bili specializirani encimski sistemi, ki zavirajo aktivnost polimeraze pri sobni temperaturi bodisi z vezavo protiteles bodisi v prisotnosti kovalentno vezanih inhibitorjev, ki disociirajo šele po koraku aktivacije pri visoki temperaturi. PCR z vročim začetkom/hladnim zaključkom se doseže z novimi hibridnimi polimerazami, ki so neaktivne pri sobni temperaturi in se takoj aktivirajo pri temperaturi raztezka.
• PCR, specifična za intermikrosatelitno zaporedje (ISSR): Metoda odvzema prstnih odtisov DNA PCR, ki poveča število kopij regij med enostavnimi ponavljajočimi se zaporedji, da se pridobi edinstven prstni odtis iz pomnožene dolžine fragmenta.
• Obrnjeno PCR pogosto uporablja za definiranje zaporednih regij okoli genomskih vstavkov. Vključuje vrsto cepitev DNK in samoligacije, kar povzroči znana zaporedja na obeh koncih neznanega zaporedja.
• PCR posredovan z ligacijo: Uporablja majhne povezovalce DNK, povezane z DNK, ki nas zanima, in nekaj primerjev, povezanih z povezovalci DNK; uporablja se za sekvenciranje DNK, sprehod po genomu in odtis DNK.
• PCR, specifičen za metilacijo(MSP): Razvila sta ga Stephen Bailin in Jim Herman na Medicinski fakulteti Johns Hopkins in se uporablja za odkrivanje metilacije CpG otokov v genomski DNK. DNK najprej obdelamo z natrijevim bisulfitom, ki pretvori nemetilirane citozinske baze v uracil, ki ga PCR primerji prepoznajo kot timin. Na modificirani DNK se nato izvedeta dva PCR z uporabo nizov enakih primerjev, razen za kateri koli otok CpG znotraj zaporedja primerjev. Na teh točkah en niz začetnikov prepozna DNA s citozini, da poveča število kopij metilirane DNA, en niz pa prepozna DNA z uracilom ali timinom, da pomnoži nemetilirano DNA. MSP z uporabo qPCR se lahko izvede tudi za pridobitev kvantitativnih in ne kvalitativnih informacij o metilaciji.
• Miniprimer - PCR: uporabljajo se termostabilne polimeraze (S-Tbr), ki se lahko raztezajo iz kratkih primerjev ("smalligos"), s številom 9 ali 10 nukleotidov. Ta tehnika omogoča PCR ciljanje na regije, povezane z manjšimi primerji, in se uporablja za pomnoževanje ohranjenih zaporedij DNA, kot je 16S (ali evkariontski 18S) gen rRNA.
• Pomnoževanje sonde, odvisno od multipleksne ligacije (MLPA): omogoča pomnoževanje več tarč s samo enim parom primerjev, s čimer se izogne ​​omejitvam ločljivosti multipleksne PCR.
• Multiplex PCR je sestavljen iz več nizov začetnih oligonukleotidov v eni mešanici PCR, da bi dobili pomnožke različnih velikosti, ki so specifični za različna zaporedja DNA. Z osredotočanjem na več genov hkrati je mogoče pridobiti dodatne informacije med enim samim testom, ki bi sicer zahteval nekajkrat več reagentov in več časa za izvedbo. Temperature žarjenja za vsak komplet temeljnih premazov je treba optimizirati za pravilno delovanje znotraj ene same reakcije in z velikostmi pomnožev. To pomeni, da mora biti njihova dolžina baznega para dovolj različna, da tvorijo ločene pasove, ko jih vizualiziramo z gelsko elektroforezo.
• Ugnezdeni PCR: poveča specifičnost pomnoževanja DNA z zmanjšanjem ozadja zaradi nespecifičnega pomnoževanja DNA. V dveh zaporednih PCR-jih se uporabita dva kompleta primerjev. Pri prvi reakciji se en par primerjev uporabi za sintezo produktov DNA, ki so lahko poleg predvidenega namena še vedno sestavljeni iz nespecifično pomnoženih fragmentov DNA. Produkte nato uporabimo v drugem PCR z nizom primerjev, katerih vezavna mesta se v celoti ali delno razlikujejo od 3' koncev vsakega od primerjev, uporabljenih v prvi reakciji. Ugnezdeni PCR je pogosto uspešnejši pri specifičnem pomnoževanju dolgih fragmentov DNA kot tradicionalni PCR, vendar zahteva podrobnejše poznavanje ciljnih sekvenc.
• PCR s prekrivajočimi se podaljški oz spajanje s prekrivajočimi se podaljški(SOE): tehnika genskega inženiringa, ki se uporablja za spajanje dveh ali več kosov DNK, ki vsebujejo komplementarna zaporedja. Uporablja se za povezovanje delov DNK, ki vsebujejo gene, ki uravnavajo sekvence ali mutacije; tehnika omogoča ustvarjanje specifičnih in dolgih konstruktov DNK.
• Kvantitativni PCR (QPCR): uporablja se za merjenje količine produkta PCR (običajno v realnem času). Kvantificira začetne količine DNA, cDNA ali RNA. qPCR se pogosto uporablja za ugotavljanje prisotnosti zaporedja DNK v vzorcu in števila njegovih kopij v vzorcu. Kvantitativni PCR v realnem času ima zelo visoko stopnjo natančnosti. Metode QRT-PCR (ali QF-PCR) uporabljajo fluorescentna barvila, kot so Sybr Green, EvaGreen, ali sonde DNA, ki vsebujejo fluorofor, kot je TaqMan, za merjenje količine pomnoženega produkta v realnem času. Včasih se imenuje RT-PCR (PCR v realnem času) ali RQ-PCR. QRT-PCR ali RTQ-PCR sta primernejši okrajšavi, saj se RT-PCR običajno nanaša na PCR z reverzno transkripcijo, ki se pogosto uporablja v povezavi s qPCR.
• PCR z reverzno transkripcijo (RT-PCR): povečati število kopij DNK iz RNK. Reverzna transkriptaza prepisuje RNA v cDNA, ki se nato pomnoži s PCR. RT-PCR se pogosto uporablja pri profiliranju izražanja za odkrivanje izražanja genov ali za določanje zaporedja transkripta RNA, vključno z mesti začetka in konca prepisovanja. Če je zaporedje genomske DNA gena znano, lahko RT-PCR uporabimo za preslikavo lokacije eksonov in intronov v genu. 5' konec gena (ki ustreza mestu začetka transkripcije) se običajno določi z RACE-PCR (hitro pomnoževanje koncev cDNA).
• PCR na trdni fazi: zajema več pomenov, vključno z "pomnoževanjem Polonia" (kjer se PCR kolonij naredi na primer na matrici z gelom), "mostičnim PCR" (primerji so kovalentno vezani na trdno nosilno površino), tradicionalnim PCR v trdni fazi (kjer je "asimetričen" PCR« se uporablja v prisotnosti primerjev, ki nosijo trdno podporo z zaporedjem, ki ustreza enemu od vodnih začetnih začetnikov), in izboljšano trdno fazo PCR (kjer je mogoče konvencionalno trdno fazo PCR izboljšati z uporabo visokih Tm in ugnezdenih trdnih nosilnih primerjev z možnost uporabe termičnega "koraka" za spodbujanje tvorbe temeljnih premazov s trdno oporo).
• Toplotno asimetrična prepletena PCR (TAIL-PCR): se uporablja za izolacijo neznanega zaporedja, ki sledi znanemu zaporedju. V znanem zaporedju TAIL-PCR uporablja ugnezdeni par primerjev z različnimi temperaturami žarjenja; degenerirani primer se uporablja za pomnoževanje v drugačni smeri od neznanega zaporedja.
• Touchdown PCR (stopenjski PCR): različica PCR, katere namen je zmanjšati nespecifično ozadje s postopnim zniževanjem temperature žarjenja, ko cikli PCR napredujejo. Temperatura žarjenja v začetnih ciklih je običajno nekaj stopinj (3-5 °C) nad Tm uporabljenih temeljnih premazov, medtem ko je v kasnejših ciklih temperatura nekaj stopinj (3-5 °C) pod Tm temeljnega premaza. primerji. Višje temperature dajejo več specifičnosti za vezavo primerja, nižje temperature pa omogočajo učinkovitejše pomnoževanje specifičnih produktov, ki nastanejo med začetnimi cikli.
• PAN-AC: Uporablja izotermne pogoje za pomnoževanje in se lahko uporablja za žive celice.
• Univerzalni hitri sprehod skozi genom: za sprehod po genomu in genetsko odvzemanje prstnih odtisov z uporabo bolj specifičnega "dvostranskega" PCR kot tradicionalni "enostranski" pristopi (uporaba samo enega gensko specifičnega primerja in enega skupnega primerja - kar lahko vodi do umetnega "šuma") zaradi mehanizma , vključno z oblikovanjem laso strukture. Poenostavljene izpeljanke UFW so "Lane RAGE" (laso ugnezdeni PCR za hitro pomnoževanje koncev genomske DNA), "5" RACE Lane" in "3" RACE Lane.
• notrisilicoPCR(digitalni PCR, virtualni PCR, e-PCR, e-PCR) se nanaša na računalniška orodja, ki se uporabljajo za izračun rezultatov teoretične verižne reakcije s polimerazo z uporabo danega nabora primerjev (sond) za pomnoževanje zaporedij DNK iz sekvenciranega genoma ali transkriptoma.

Zgodovina PCR

V članku Journal of Molecular Biology iz leta 1971 so Kleppe in sodelavci prvič opisali metodo z uporabo encimskega testa za replikacijo kratke šablone DNA s primerji pod pogoji in vitro. Vendar ta zgodnja manifestacija osnovnega principa PCR ni bila deležna velike pozornosti in izum verižne reakcije s polimerazo leta 1983 se na splošno pripisuje Careyu Mullisu.

Ko je Mullis leta 1983 razvil PCR, je delal v Emeryvillu v Kaliforniji za Cetus Corporation, zgodnje biotehnološko podjetje. Tam je bil odgovoren za sintezo kratkih verig DNK. Mullis je zapisal, da si je PCR zamislil med vožnjo po avtocesti ob pacifiški obali neke noči v svojem avtomobilu. V mislih si je zaigral nov način analiziranja sprememb (mutacij) v DNK, ko je spoznal, da je namesto tega izumil metodo za povečanje števila kopij katerega koli dela DNK s ponavljajočimi se cikli podvajanja, ki jih povzroča DNK polimeraza. V časopisu Scientific American je Mullis povzel postopek: »Če začnemo z eno samo molekulo genskega materiala DNK, lahko PCR ustvari 100 milijard takšnih molekul v enem dnevu. To reakcijo je enostavno izvesti. Ne potrebuje več kot epruvete, nekaj preprostih reagentov in vira toplote.« Za svoj izum je leta 1993 prejel Nobelovo nagrado za kemijo, sedem let kasneje pa je s sodelavci pri Cetusu svoj predlog prvič uresničil. Vendar ostaja nekaj polemik o intelektualnih in praktičnih prispevkih drugih znanstvenikov k Mullisovemu delu in o tem, ali je bil on edini izumitelj načela PCR.

Metoda PCR temelji na uporabi ustrezne polimeraze DNA, ki je sposobna prenesti visoke temperature >90 °C (194 °F), potrebne za cepitev dveh verig DNK v dvojni vijačnici DNK po vsakem ciklu replikacije. Polimeraze DNA, ki so bile prvotno uporabljene za poskuse in vitro, nakazane s PCR, niso bile sposobne prenesti tako visokih temperatur. Zato so bili zgodnji postopki replikacije DNK zelo neučinkoviti in dolgotrajni ter so zahtevali velike količine DNK polimeraze in neprekinjeno obdelavo v celotnem procesu.

Odkritje leta 1976 Taq polimeraze, DNA polimeraze, izolirane iz termofilne bakterije, Termusaquaticus, ki naravno živi v vročih (50 do 80 °C (122 do 176 °F)) okoljih, kot so vroči izviri, je utrl pot dramatičnemu izboljšanju metode PCR. DNA polimeraza izolirana iz T.Aquaticus, je stabilen pri visokih temperaturah in ostane aktiven tudi po denaturaciji DNA, s čimer odpade potreba po dodajanju novih DNA polimeraz po vsakem ciklu. To je omogočilo avtomatizacijo procesa pomnoževanja DNA na osnovi termičnega ciklerja.

Patentne vojne

Predlagano metodo PCR je patentiral Carey Mullis in je pripisana podjetju Cetus Corporation, kjer je delal Mullis, ko je leta 1983 izumil tehniko. Encim polimeraza Taq je tudi zaščiten s patenti. V zvezi z metodologijo je bilo več odmevnih tožb, vključno z neuspešno tožbo, ki jo je vložil DuPont. Farmacevtsko podjetje Hoffmann-La Roche je leta 1992 pridobilo pravice do patentov in ima trenutno tiste, ki so še zaščiteni.

Podoben patentni boj za encim polimerazo Taq še vedno poteka v nekaterih jurisdikcijah po svetu med Rochejem in Promego. Pravni argumenti so presegli pogoje prvotnih patentov za PCR in polimerazo Taq, ki so potekli 28. marca 2005.

Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je visoko natančna metoda na področju diagnosticiranja dednih patologij, okužb, virusnih bolezni v kateri koli fazi (akutni ali kronični) in tudi - v zgodnji fazi - pred očitnimi manifestacijami bolezni z identifikacijo patogenov. na podlagi njihove DNK, RNK, ki sta genetski material, v vzorcih, ki jih pridobimo od pacienta. In danes bomo govorili o bistvu, diagnostičnih stopnjah in načelih metod verižne reakcije s polimerazo (PCR), pa tudi o njenih stroških.

Kaj je verižna reakcija s polimerazo

Osnova analize je amplifikacija (podvojitev) – ustvarjanje številnih kopij iz kratkega odseka DNK (deoksiribonukleinske kisline), ki predstavlja človeški genski kompleks. Za študijo je potrebna zelo majhna količina fizioloških snovi (sputum, iztrebki, epitelijski ostanki, sok prostate, kri, seme, amnijska tekočina, sluz, tkivo posteljice, urin, slina, plevralna tekočina, cerebrospinalna tekočina). V tem primeru se lahko na primer v urogenitalnem traktu pacienta odkrije že en sam škodljiv mikrob.

Tehniko PCR (verižna reakcija s polimerazo) je razvil ameriški znanstvenik K. Mullis, ki je leta 1993 prejel Nobelovo nagrado.

Aktivno uporabljen:

• pri zgodnji diagnostiki okužb, genetskih,;
• pri sodnomedicinskem pregledu ob prisotnosti izjemno majhne količine DNK za raziskave;
• v veterini, farmaciji, biologiji, molekularni genetiki;
• za identifikacijo osebe z DNK, potrditev očetovstva;
• v paleontologiji, antropologiji, ekologiji (pri sledenju kakovosti izdelkov, okoljskih dejavnikov).

Ta videoposnetek vam bo povedal, kaj je verižna reakcija s polimerazo:

Komu je dodeljena

Verižna reakcija s polimerazo v diagnostiki nalezljivih bolezni je ena najbolj zanesljivih metod visoke natančnosti in zanesljivosti. Na primer, zanesljivost analize PCR za klamidijo in številne druge patogene se približa 100% (absolutno). Najpogosteje je postopek verižne reakcije s polimerazo predpisan bolnikom, ki imajo pri diagnosticiranju težave pri prepoznavanju določenega patogena.

Laboratorijski test PCR se uporablja:

• za odkrivanje patogenov, ki povzročajo okužbe sečil in spolnih organov, ki jih je težko prepoznati s posevki ali imunološkimi metodami;
• za ponovno diagnozo HIV v začetni fazi v primeru pozitivnega, vendar vprašljivega rezultata začetne analize (na primer pri novorojenčkih staršev, okuženih z aidsom);
• določitev onkološke bolezni v zgodnji fazi (študija onkogenskih mutacij) in individualna korekcija režima zdravljenja za določenega bolnika;
• z namenom zgodnjega odkrivanja in morebitnega zdravljenja dednih patologij.

Tako se bodoči starši testirajo, da ugotovijo, ali so nosilci genetske patologije, pri otrocih pa PCR določa verjetnost izpostavljenosti dedni bolezni.

• za odkrivanje patologij ploda v zgodnji fazi gestacije (posamezne celice rastočega zarodka se pregledajo za morebitne mutacije);
• pri bolnikih pred presaditvijo organa - za "tipizacijo tkiv" (določanje tkivne kompatibilnosti);
• odkrivanje nevarnih patogenih organizmov v darovani krvi;
• pri novorojenčkih - za odkrivanje latentnih okužb;
• oceniti rezultate protivirusnega in protimikrobnega zdravljenja.

Zakaj skozi ta postopek?

Ker je PCR zelo učinkovita diagnostična metoda, ki daje skoraj 100% rezultat, se uporablja postopek:

• potrditi ali zavrniti končno diagnozo;
• hitra ocena učinkovitosti terapije.

V mnogih primerih je PCR edina možna preiskava za odkrivanje razvijajoče se bolezni, če so druge bakteriološke, imunološke in virološke diagnostične metode neuporabne.

• Viruse odkrijemo s PCR takoj po okužbi in preden se pojavijo znaki bolezni. Zgodnje odkrivanje virusa omogoča hitro zdravljenje.
• S kvantitativno analizo DNK ugotavljamo tudi tako imenovano »virusno breme« (ali število virusov v telesu).
• Posebni patogeni (kot je Kochov tuberkulozni bacil) so težki in predolgi za gojenje. Analiza PCR vam omogoča hitro identifikacijo najmanjšega števila patogenov (živih in mrtvih) v vzorcih, ki so primerni za raziskave.

Uporablja se podrobna analiza DNK patogena:

• določiti njegovo občutljivost na določene vrste antibiotikov, kar vam omogoča takojšen začetek zdravljenja;
• za obvladovanje širjenja epidemij med domačimi, divjimi živalmi;
• za prepoznavanje in spremljanje novih nalezljivih mikrobnih vrst in podtipov patogenov, ki so spodbujali prejšnje epidemije.

Vrste diagnostike

Standardna metoda

Analiza polimerazne verižne reakcije poteka na podlagi večkratnega pomnoževanja (podvojitve) specifičnega fragmenta DNA in RNA z uporabo posebnih encimov primerja. Kot rezultat verige kopiranja se pridobi količina gradiva, ki je dovolj za raziskovanje.

Med postopkom se kopira samo želeni fragment (ki ustreza določenim specifičnim pogojem), tudi če je dejansko prisoten v vzorcu.

Ta podroben video z uporabnimi diagrami pove, kako deluje PCR:

Druge metode

• PCR v realnem času. Pri tej vrsti študije se postopek identifikacije danega fragmenta DNK začne po vsakem ciklu in ne po zaključku celotne verige 30-40 ciklov. Ta vrsta študije vam omogoča, da pridobite informacije o količini patogena (virusa ali mikroba) v telesu, to je, da izvedete kvantitativno analizo.
• RT-PCR (način povratne transkripcije). Ta test se uporablja za iskanje enoverižne RNA za odkrivanje virusov, katerih genetska osnova je RNA (na primer virus hepatitisa C, virus imunske pomanjkljivosti). Pri takšni študiji se uporablja poseben encim - reverzna transkriptaza in določen primer, na osnovi RNK pa se gradi enoverižna DNK. Nato se iz te verige obnovi druga veriga DNK in izvede se standardni postopek.

Indikacije za zadrževanje

Postopek PCR se uporablja na kliniki za infekcijske bolezni, neonatologijo, porodništvo, pediatrijo, urologijo, ginekologijo, venereologijo, nevrologijo, nefrologijo, oftalmologijo.

Indikacije za analizo:

• pojasnitev tveganja za razvoj genetskih nepravilnosti pri otroku z verjetnostjo dednih patologij;
• diagnosticiranje obeh staršev pri načrtovanju nosečnosti ali resnega stanja matere med nosečnostjo;
• težave s spočetjem, ugotavljanje vzrokov neplodnosti;
• sum na spolne okužbe v akutni fazi in s simptomi njihovega prehoda v kronično;
• odkrivanje vzrokov vnetnih procesov nejasnega izvora;
• nezaščiteni priložnostni in stalni spolni stiki;
• določitev občutljivosti patogenega mikroorganizma na določene antibiotike;
• bolniki s sumom na latentno okužbo za odkrivanje patogenov pred razvojem očitnih simptomov (predklinična diagnoza);
• bolniki za potrditev okrevanja po bolezni (retrospektivna diagnoza);

Diagnostika se uporablja tudi, če je potrebno natančno identificirati naslednje patogene:

• virusi hepatitisa (A B C G), humana imunska pomanjkljivost, citomegalovirus;
• vibrio kolera;
• herpes simplex virus, herpetiformne vrste;
• retro-adeno- in rinovirusi;
• virusi rdečk, Epstein-Barr, norice (Zoster - virus);
• parvo in pikornavirusi;
• bakterija Helicobacter pylori;
• legionela, patogene vrste Escherichia coli;
• zlati stafilokok;
• patogen;
• Clostridia, difterija in Haemophilus influenzae;

Uporablja se tudi za določanje okužb:

• Infekcijska mononukleoza;
• borelioza, listerioza, klopni encefalitis;
• kandidoza, ki jo povzročajo glive Candida;
• spolne okužbe - trihomonijaza, ureaplazmoza, bleda treponema, gardnereloza, gonoreja, mikoplazmoza, klamidija;
• tuberkuloza.

Kontraindikacije za držanje

Ker se postopek ne izvaja s pacientom, brez vpliva na telo, ampak z biološkim materialom, odvzetim za raziskavo, zaradi odsotnosti potencialne nevarnosti ni kontraindikacij za PCR.

Vendar se vzorčenje biomateriala iz cervikalnega kanala maternice po postopku kolposkopije ne izvaja. Oddaja brisov, strganja za analizo je dovoljena le 4 do 6 dni po koncu menstruacije in popolnem prenehanju izločanja.

Ali je metoda varna

Negativni vpliv na pacienta v izolirani študiji njegovega biomateriala v laboratoriju ni možen.

Priprava na poseg (oddaja bioloških substanc za analizo)

Kot vzorec za analizo PCR, v katerem se odkrije DNK tujega patogena, se uporabi katera koli biološka tekočina, tkivo, telesni izločki. Vzorčenje preskusne snovi se izvaja v obliki odvzema krvi iz vene, strganja iz grla, nosne votline, sečnice, plevralne votline, materničnega vratu.

Pred diagnostičnim postopkom zdravnik pacientu pojasni, kateri material bo odvzet:

1. Pri pregledu za spolne okužbe se vzamejo izločki iz spolnih organov, urin in bris iz sečnice.
2. Pri analizi za herpetične okužbe, citomegalovirus, mononukleozo - vzamejo urin, bris žrela za analizo, za hepatitis, toksoplazmozo - kri iz vene.
3. Za diagnosticiranje različnih vrst se vzame cerebrospinalna tekočina.
4. V pulmologiji sta vzorca za analizo sputum in plevralna tekočina.
5. Pri izvajanju študije možnih intrauterinih okužb med nosečnostjo se za analizo uporabljajo amnijska tekočina in celice placente.

Zanesljivost in natančnost analize je odvisna od sterilnosti pogojev pri odvzemu materiala. Ker je PCR test zelo občutljiv, lahko morebitna kontaminacija testne snovi popači rezultat.

Kompetentna priprava na dostavo biomateriala za bolnike ne predstavlja težav. Obstajajo določena priporočila:

• pri analizi za spolne okužbe:
  • izključite intimne stike 72 ur pred dostavo materiala;
  • prenehajte uporabljati kakršne koli vaginalne izdelke za 3 dni;
  • od večera prejšnjega dne ne izvajajte higiene preučevanega območja;
  • izključite uriniranje 3-4 ure pri odvzemu vzorca iz sečnice;
• prenehajte jemati antibiotike en mesec pred testiranjem na okužbe;
• darovati kri zjutraj pred jedjo in pitjem;
• zbiranje prvega jutranjega dela urina se izvede v sterilno posodo po temeljitem intimnem toaleti.

Preberite več o tem, kako poteka diagnostika z metodo verižne reakcije s polimerazo.

Kako poteka postopek

Pri vedno znova izvajanju študije PCR v reaktorju (ojačevalniku ali termociklerju) se določeni cikli ponavljajo:

1. Prvi korak je denaturacija. Slina, kri, biopsija, ginekološki vzorci, sputum, v katerih obstaja sum na prisotnost DNK (ali RNK) povzročitelja, se dajo v ojačevalec, kjer se material segreje in DNK razdeli v dve ločeni verigi.
2. Drugi korak je žarjenje oziroma rahlo ohlajanje materiala. in ji dodajanje primerjev, ki lahko prepoznajo želene odseke v molekuli DNK in se nanje vežejo.
3. Tretji korak je raztezek- nastane po dodatku 2 primerjev na vsako od verig DNA. Med procesom se fragment DNK patogena dokonča in nastane njegova kopija.

Ti cikli se ponavljajo kot "verižna reakcija", ki vsakič vodi do podvojitve kopij določenega fragmenta DNK (na primer segmenta, kjer je programiran določen virus). V nekaj urah nastanejo številne kopije fragmenta DNK, njihova prisotnost v vzorcu pa se zazna. Nato se rezultati analizirajo in primerjajo z bazo različnih vrst patogenov, da se določi vrsta okužbe.

O interpretaciji rezultatov in zaključku na podlagi reakcije PCR preberite spodaj.

Dešifriranje rezultatov

Končni rezultat študije se izda 1-2 dni po dostavi biološkega materiala. Pogosto - že prvi dan po analizi.

Kvalitativna analiza

• Negativno rezultat pomeni, da v snovi, ki je bila predložena v raziskavo, niso bile najdene sledi povzročiteljev okužb.
• Pozitivno rezultat pomeni odkrivanje patogenih virusov ali bakterij v biološkem vzorcu z zelo visoko stopnjo natančnosti ob oddaji.

Če je rezultat pozitiven, vendar ni znakov aktivacije okužbe, se to stanje telesa imenuje asimptomatsko "zdravo nošenje". Najpogosteje opazimo pri odvzemu biomateriala z določenega mesta (cervikalni kanal, sečnica, ustna votlina) pri virusnih boleznih. Zdravljenje v tem primeru ni potrebno, vendar je potreben stalen zdravniški nadzor, saj obstaja možnost:

• širjenje virusa od nosilcev in okužba zdravih ljudi;
• aktivacija procesa in prehod bolezni v kronično obliko.

Če pa je krvni test pozitiven, to pomeni, da je okužba prizadela telo in to ni več nosilec, temveč patologija, ki zahteva takojšnjo specifično terapijo.

Kvantitativna analiza

Kvantitativni rezultat določi specialist posebej za določeno vrsto okužbe. Na njegovi podlagi je mogoče oceniti stopnjo razvoja, stopnjo bolezni, kar omogoča takojšnje predpisovanje pravilnega zdravljenja.

povprečni stroški

Cene za izvedbo verižne reakcije s polimerazo določajo: vrsta študije, zapletenost identifikacije patogena, težavnost zbiranja biološkega materiala, vrsta analize (kvalitativna ali kvantitativna), raven cen v laboratoriju.

Po drugi strani pa je v študiji PCR mogoče odkriti več patogenov hkrati, ko vzamemo eno vrsto materiala za analizo. To prihrani pri drugih laboratorijskih preiskavah.

Približno stroški analize PCR v rubljih:

• gonococcus, gardnerella, trichomonas vaginalis - od 180
• Chlamydia trachomatis - od 190
• papiloma virus - od 380 do 500
• biocenoza urogenitalnega trakta pri ženskah (kvantitativna in kvalitativna ocena mikroflore) - od 800.

Za več koristnih informacij o študiji PCR si oglejte spodnji video:

Prejel Nobelovo nagrado.

Na začetku uporabe metode je bilo treba po vsakem ciklu segrevanja-hlajenja reakcijski zmesi dodati DNA polimerazo, saj je bila inaktivirana pri visoki temperaturi, potrebni za ločevanje verig vijačnice DNA. Reakcijski postopek je bil relativno neučinkovit, zahteval je veliko časa in encimov. Leta 1986 je bila metoda verižne reakcije s polimerazo bistveno izboljšana. Predlagana je bila uporaba DNA polimeraz iz termofilnih bakterij. Ti encimi so se izkazali za termostabilne in so lahko vzdržali številne reakcijske cikle. Njihova uporaba je omogočila poenostavitev in avtomatizacijo PCR. Ena prvih termostabilnih DNA polimeraz je bila izolirana iz bakterij Thermus aquaticus in imenovan Taq- polimeraza. Pomanjkljivost te polimeraze je, da je verjetnost vnosa napačnega nukleotida precej velika, saj ta encim nima mehanizmov za popravljanje napak (3" → 5" eksonukleazna aktivnost). Polimeraze pfu in Pwo, izolirani iz arhej, imajo takšen mehanizem, njihova uporaba bistveno zmanjša število mutacij v DNK, vendar je hitrost njihovega delovanja (procesivnost) nižja kot pri Taq. Trenutno uporabljam mešanice Taq in pfu za doseganje visoke hitrosti polimerizacije in visoke natančnosti kopiranja.

Carey Mullis je v času iznajdbe metode delal kot sintetični kemik (sintetiziral je oligonukleotide, ki so jih nato s hibridizacijo z genomsko DNK uporabljali za detekcijo točkovnih mutacij) v podjetju Cetus Corporation, ki je patentiralo metodo PCR. Leta 1992 je Cetus prodal pravice do metode in patent za uporabo Taq podjetje za polimerazo Hoffman-La Roche za 300 milijonov dolarjev. Vendar se je izkazalo, da Taq-polimerazo so leta 1980 označili sovjetski biokemiki A. Kaledin, A. Slyusarenko in S. Gorodetsky, 4 leta pred to sovjetsko publikacijo, to je leta 1976, pa tudi ameriški biokemiki Alice Chien, David B. Edgar in John M. Trela. V zvezi s tem je podjetje Promega (Promega) poskušalo na sodišču prisiliti Roche, da se odreče izključnim pravicam za ta encim. Ameriški patent za metodo PCR je potekel marca 2005.

Izvajanje PCR

Metoda temelji na večkratnem selektivnem kopiranju določene regije DNA s pomočjo encimov v umetnih pogojih ( in vitro). V tem primeru se kopira samo območje, ki izpolnjuje določene pogoje, in le, če je prisotno v proučevanem vzorcu. V nasprotju s pomnoževanjem DNK v živih organizmih (replikacija) se s PCR pomnoži relativno kratke odseke DNK. Pri običajnem postopku PCR dolžina repliciranih regij DNK ne presega 3000 baznih parov (3 kbp). S pomočjo mešanice različnih polimeraz, z uporabo dodatkov in pod določenimi pogoji lahko dolžina PCR fragmenta doseže 20-40 tisoč baznih parov. To je še vedno precej manj od dolžine kromosomske DNK evkariontske celice. Na primer, človeški genom je dolg približno 3 milijarde baznih parov.

Reakcijske komponente

Za PCR so v najpreprostejšem primeru potrebne naslednje komponente:

• DNK šablona, ki vsebuje del DNK, ki ga je treba pomnožiti.
• Dva primerja, komplementarno nasprotnim koncem različnih verig želenega fragmenta DNA.
• termostabilen DNA polimeraza je encim, ki katalizira polimerizacijo DNK. Polimeraza za uporabo v PCR mora ostati aktivna pri visoki temperaturi dolgo časa, zato se uporabljajo encimi, izolirani iz termofilov - Thermus aquaticus(Taq polimeraza), Pyrococcus furiosus(Pfu polimeraza), Pyrococcus woesei(Pwo-polimeraza) in drugi.
• Deoksiribonukleozidni trifosfati(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Ioni Mg 2+, potrebni za delovanje polimeraze.
• puferska raztopina, ki zagotavlja potrebne reakcijske pogoje - pH, ionsko moč raztopine. Vsebuje soli, goveji serumski albumin.

Da preprečimo izhlapevanje reakcijske zmesi, dodamo v epruveto olje z visokim vreliščem, kot je vazelin. Če se uporablja ogrevan cikličen pokrov, to ni potrebno.

Dodatek pirofosfataze lahko poveča izkoristek reakcije PCR. Ta encim katalizira hidrolizo pirofosfata, stranskega produkta dodajanja nukleotidnih trifosfatov na rastočo verigo DNA, v ortofosfat. Pirofosfat lahko zavre reakcijo PCR.

Primerji

Specifičnost PCR temelji na tvorbi komplementarnih kompleksov med šablono in primerji, kratkimi sintetičnimi oligonukleotidi, dolgimi 18-30 baz. Vsak od primerjev je komplementaren eni od verig dvoverižne predloge in omejuje začetek in konec pomnožene regije.

Po hibridizaciji matrice s primerjem (žarjenjem) slednji služi kot primer za DNA polimerazo pri sintezi komplementarne verige matrice (glej).

Najpomembnejša značilnost primerjev je tališče (Tm) kompleksa primer-matriks.

T m je temperatura, pri kateri polovica predlog DNA tvori kompleks z oligonukleotidnim primerjem. Povprečna formula za izračun T m za kratek oligonukleotid (in za dolge fragmente DNA), ob upoštevanju koncentracije ionov K + in DMSO:

kjer je L število nukleotidov v začetniku, K + je molska koncentracija kalijevih ionov, G+C je vsota vseh gvaninov in citozinov.

Če sta dolžina in nukleotidna sestava primerja ali temperatura žarjenja izbrana nepravilno, je možna tvorba delno komplementarnih kompleksov z drugimi regijami matrične DNK, kar lahko privede do pojava nespecifičnih produktov. Zgornja meja tališča je omejena z optimalno temperaturo delovanja polimeraze, katere aktivnost pade pri temperaturah nad 80 °C.

Pri izbiri temeljnih premazov je zaželeno upoštevati naslednja merila:

ojačevalnik

riž. eno: PCR cikler

PCR se izvaja v ojačevalniku - napravi, ki zagotavlja periodično hlajenje in segrevanje epruvet, običajno z natančnostjo najmanj 0,1 ° C. Sodobni ciklerji vam omogočajo nastavitev zapletenih programov, vključno z možnostjo "vročega zagona", Touchdown PCR (glejte spodaj) in poznejšega shranjevanja pomnoženih molekul pri 4 °C. Za PCR v realnem času se proizvajajo naprave, opremljene s fluorescenčnim detektorjem. Instrumenti so na voljo tudi s samodejnim pokrovom in prostorom za mikroplošče, kar omogoča njihovo integracijo v avtomatizirane sisteme.

Napredek reakcije

Fotografija gela, ki vsebuje DNK markerja (prva in zadnja reža) in produkte PCR

Običajno se med PCR izvede 20-35 ciklov, od katerih je vsak sestavljen iz treh stopenj (slika 2).

Denaturacija

Predloga dvoverižne DNA se segreva na 94–96 °C (ali 98 °C, če se uporablja posebej termostabilna polimeraza) 0,5–2 minuti, da se verigi DNA ločita. Ta stopnja se imenuje denaturacija ker so vodikove vezi med obema verigama DNK pretrgane. Včasih se pred prvim ciklom (pred dodajanjem polimeraze) reakcijska zmes predhodno segreje 2–3 minute, da se popolnoma denaturira šablona in primerji. Takšen pristop se imenuje vroč zagon, omogoča zmanjšanje količine nespecifičnih reakcijskih produktov.

Žarjenje

Ko so prameni ločeni, se temperatura zniža, da se primerji lahko vežejo na enovijačno predlogo. Ta stopnja se imenuje žarjenje. Temperatura žarjenja je odvisna od sestave temeljnih premazov in je običajno izbrana enaka temperaturi taljenja temeljnih premazov. Nepravilna izbira temperature žarjenja vodi bodisi do slabše vezave primerjev na šablono (pri povišani temperaturi) bodisi do vezave na napačnem mestu in pojava nespecifičnih produktov (pri nizki temperaturi). Čas faze žarjenja je 30 sekund, hkrati pa ima polimeraza v tem času že čas, da sintetizira več sto nukleotidov. Zato je priporočljivo izbrati primerje s tališčem nad 60 °C in sočasno izvajati žarjenje in elongacijo pri 60-72 °C.

Raztezek

Polimeraza DNA replicira vzorčno verigo z uporabo primerja kot primerja. To je oder raztezek. Polimeraza začne sintezo druge verige s 3" konca primerja, ki se je vezal na predlogo in se premika vzdolž predloge, sintetizira novo verigo v smeri od 5" do 3" konca. 72 °C. Čas raztezka je odvisen tako od vrste DNA polimeraze kot od dolžine pomnoženega fragmenta. Običajno je čas raztezka ena minuta za vsakih tisoč baznih parov. Po vseh ciklih se pogosto izvede dodaten korak končni raztezek za dokončanje vseh enoverižnih fragmentov. Ta stopnja traja 7-10 minut.

riž. 2: Shematski prikaz prvega cikla PCR. (1) Denaturacija pri 94-96 °C. (2) Žarjenje pri 68 °C (na primer). (3) Raztezek pri 72 °C (P=polimeraza). (4) Prvi cikel je končan. Dve nastali verigi DNK služita kot predloga za naslednji cikel, tako da se količina DNK predloge med vsakim ciklom podvoji.

Količina specifičnega reakcijskega produkta (omejenega s primerji) teoretično narašča sorazmerno z 2n - 2n, kjer je n število reakcijskih ciklov. Pravzaprav je lahko učinkovitost vsakega cikla manjša od 100 %, tako da je v resnici P ~ (1+E) n , kjer je P količina produkta, E povprečna učinkovitost cikla.

Narašča tudi število »dolgih« kopij DNK, vendar linearno, zato v produktih reakcije prevladuje določen fragment.

Rast zahtevanega produkta je eksponentno omejena s količino reagentov, prisotnostjo inhibitorjev in tvorbo stranskih produktov. V zadnjih ciklih reakcije se rast upočasni, to imenujemo "učinek platoja".

Sorte PCR

• Ugnezdeni PCR(Nested PCR (eng.) ) - uporablja se za zmanjšanje števila stranskih produktov reakcije. Uporabite dva para primerjev in izvedite dve zaporedni reakciji. Drugi par primerjev pomnoži regijo DNK znotraj produkta prve reakcije.
• Invertirana PCR(Inverzna PCR (angleško) ) - se uporablja, če je znano le majhno območje znotraj želenega zaporedja. Ta metoda je še posebej uporabna, ko je treba po vstavitvi DNK v genom določiti sosednje sekvence. Za izvedbo invertne PCR se izvede serija rezov DNA z restrikcijskimi encimi, ki jim sledi povezovanje fragmentov (ligacija). Posledično so znani fragmenti na obeh koncih neznane regije, po kateri se PCR lahko izvede kot običajno.
• PCR z reverzno transkripcijo(Reverse Transcription PCR, RT-PCR (angleško) ) – uporablja se za pomnoževanje, izolacijo ali identifikacijo znanega zaporedja iz knjižnice RNA. Pred konvencionalno PCR se na šabloni mRNA s pomočjo reverzetaze sintetizira enoverižna DNA molekula in dobi enoverižna cDNA, ki se uporablja kot matrica za PCR. Ta metoda pogosto določa, kje in kdaj so ti geni izraženi.
• Asimetrični PCR(Angleščina) Asimetrični PCR) - se izvaja, ko je treba pomnožiti predvsem eno od verig izvorne DNK. Uporablja se v nekaterih tehnikah analize zaporedja in hibridizacije. PCR izvedemo kot običajno, le da enega od primerjev vzamemo v velikem presežku. Spremembe te metode so angleške. L inear- A po- T on- E xponential-PCR (LATE-PCR), ki uporablja primerje z različnimi koncentracijami, začetni primer z nizko koncentracijo pa je izbran z višjo (tališče) kot začetni primer z visoko koncentracijo. PCR se izvaja pri visoki temperaturi žarjenja, s čimer se ohrani učinkovitost reakcije skozi vse cikle.
• Kvantitativni PCR(Kvantitativni PCR, Q-PCR) oz PCR v realnem času- uporablja se za neposredno spremljanje merjenja količine specifičnega produkta PCR v vsakem reakcijskem ciklu. Ta metoda uporablja fluorescentno označene primerje ali sonde DNA za natančno merjenje količine reakcijskega produkta, ko se kopiči; ali se uporabi fluorescentno interkalacijsko barvilo Sybr Green I ki se veže na dvoverižno DNA. Sybr Green I zagotavlja preprosto in stroškovno učinkovito možnost za odkrivanje PCR v realnem času in kvantifikacijo produktov PCR brez potrebe po posebnih fluorescenčnih sondah ali primerjih. Med ojačanjem se barvilo SYBR Zelena I integrira v manjši utor DNK produktov PCR in oddaja močnejši fluorescentni signal kot nevezano barvilo, ko je obsevano z modrim laserjem. SYBR Zelena I združljiv z vsemi trenutno znanimi PCR instrumenti v realnem času. Največja absorpcija za SYBR Zelena I je pri valovni dolžini 494 nm. Poleg glavnega sta v spektru barvila še dva majhna dodatna absorpcijska maksimuma - pri 290 nm in 380 nm. Največja emisija za SYBR Zelena I je pri valovni dolžini 521 nm (zeleno).
• Korak PCR(Touchdown PCR (angleško) ) - s tem pristopom se zmanjša vpliv nespecifične vezave začetnih oligonukleotidov. Prve cikle izvajamo pri temperaturi nad optimalno temperaturo žarjenja, nato pa vsakih nekaj ciklov temperaturo žarjenja postopoma znižamo na optimalno. To zagotavlja, da se začetni hibrid hibridizira s komplementarno verigo po celotni dolžini; medtem ko se pri optimalni temperaturi žarjenja primer delno hibridizira s komplementarno verigo. Delna hibridizacija primerja na genomski DNA vodi do nespecifičnega pomnoževanja, če je dovolj veznih mest za primer. V večini primerov lahko prvih deset ciklov PCR izvedemo pri temperaturi žarjenja 72-75 °C, nato pa jo takoj znižamo na optimalno, na primer na 60-65 °C.
• Metoda molekularne kolonije(PCR v gelu) Kolonija-PCR kolonija) - akrilamidni gel polimeriziramo z vsemi komponentami PCR na površini in izvedemo PCR. Na točkah, ki vsebujejo analizirano DNK, pride do pomnoževanja s tvorbo molekularnih kolonij.
• PCR s hitrim pomnoževanjem koncev cDNA(Angleščina) Hitro pomnoževanje koncev cDNA, RACE-PCR ).
• PCR dolgih fragmentov(Angleščina) PCR dolgega dosega) - modifikacija PCR za pomnoževanje razširjenih segmentov DNA (10 tisoč ali več baz). Uporablja se mešanica dveh polimeraz, od katerih je ena polimeraza Taq z visoko procesnostjo (to je sposobna sintetizirati dolgo verigo DNA v enem prehodu), druga pa je polimeraza DNA z aktivnostjo eksonukleaze 3 "-5", običajno Pfu polimeraza. Druga polimeraza je potrebna za popravljanje napak, ki jih je vnesla prva, saj Taq polimeraza ustavi sintezo DNA, če je dodan nekomplementaren nukleotid. Ta nekomplementarni nukleotid odstrani Pfu polimeraza. Mešanico polimeraz vzamemo v razmerju 50:1 ali celo manj kot 100:1, pri čemer Taq polimerazo vzamemo 25-100 krat več v primerjavi s Pfu polimerazo.
• RAPD(Angleščina) Naključno pomnoževanje polimorfne DNA ), PCR z naključnim pomnoževanjem polimorfne DNA - se uporablja, kadar je treba razlikovati med organizmi, ki so si v genetskem zaporedju blizu, na primer različne sorte gojenih rastlin, pasme psov ali tesno sorodni mikroorganizmi. Ta metoda običajno uporablja en sam majhen primer (približno 10 bp). Ta primer bo delno komplementaren naključnim regijam DNK preučevanih organizmov. Z izbiro pogojev (dolžina primerja, sestava primerja, temperatura itd.) je možno doseči zadovoljivo razliko v vzorcu PCR za dva organizma.
• Skupinsko specifična PCR(Angleščina) skupinsko specifična PCR) - PCR za sorodna zaporedja znotraj iste ali med različnimi vrstami z uporabo konzervativnih primerjev za ta zaporedja. Na primer, izbor univerzalnih primerjev za ribosomske 18S in 26S geni za pomnoževanje vrstno specifičnega medgenega distančnika: gensko zaporedje 18S in 26S je med vrstami konzervativen, zato bo PCR med temi geni potekal za vse proučevane vrste. Nasprotje te metode je - edinstven PCR(Angleščina) edinstven PCR), v katerem je naloga izbrati primerje za pomnoževanje samo določenega zaporedja med sorodnimi zaporedji.
• PCR z uporabo vročega zagona(Angleščina) PCR z vročim zagonom) - modifikacija PCR z uporabo DNA polimeraze, pri kateri je aktivnost polimeraze blokirana pri sobni temperaturi s protitelesi ali majhnimi molekulami, ki posnemajo protitelesa, kot je Affibody, to je v času reakcije pred prvo denaturacijo v PCR. Običajno se prva denaturacija izvaja pri 95 °C 10 minut.
• Virtualni PCR(angl. in silico PCR, digital PCR, electronic PCR, e-PCR) - matematična metoda računalniške analize teoretične polimerazne verižne reakcije z uporabo seznama začetnih zaporedij (ali DNK sond) za napoved potencialne DNK pomnožitve proučevanega genoma. , kromosoma, krožne DNK ali katerega koli drugega dela DNK.

Če je nukleotidno zaporedje predloge delno znano ali sploh ni znano, lahko uporabite degenerirani primerji, katerega zaporedje vsebuje degenerirane položaje, ki lahko vsebujejo poljubne baze. Na primer, zaporedje primerja je lahko: …ATH…, kjer je N - A, T ali C.

Uporaba PCR

PCR se uporablja na številnih področjih za analizo in v znanstvenih poskusih.

Kriminalistika

PCR se uporablja za primerjavo tako imenovanih "genetskih prstnih odtisov". Potreben je vzorec genetskega materiala s kraja zločina - krvi, sline, semena, las itd. Primerja se z genetskim materialom osumljenca. Dovolj je zelo majhna količina DNK, teoretično - ena kopija. DNK se razreže na fragmente, nato pa se pomnoži s PCR. Fragmente ločimo z elektroforezo DNA. Nastala slika razporeditve trakov DNK se imenuje genetski prstni odtis(Angleščina) genetski prstni odtis).

Ugotavljanje očetovstva

riž. 3: Rezultati elektroforeze fragmentov DNA, pomnoženih s PCR. (1) Oče. (2) Otrok. (3) Mati. Otrok je podedoval nekatere značilnosti genetskega odtisa obeh staršev, kar je dalo nov, edinstven odtis.

Čeprav so »genetski prstni odtisi« unikatni (razen v primeru enojajčnih dvojčkov), je družinske vezi vseeno mogoče vzpostaviti z izdelavo več takih prstnih odtisov (slika 3). Enako metodo lahko z majhnimi spremembami uporabimo za ugotavljanje evolucijskih odnosov med organizmi.

Medicinska diagnostika

PCR omogoča bistveno pospešitev in olajšanje diagnosticiranja dednih in virusnih bolezni. Želeni gen se pomnoži s PCR z uporabo ustreznih primerjev in nato sekvencira za določitev mutacij. Virusne okužbe lahko odkrijemo takoj po okužbi, tedne ali mesece preden se pojavijo simptomi bolezni.

Personalizirana medicina

Včasih so zdravila za nekatere bolnike strupena ali alergena. Vzroki za to so deloma v individualnih razlikah v občutljivosti in presnovi zdravil in njihovih derivatov. Te razlike so določene na genetski ravni. Na primer, pri enem bolniku je lahko določen citokrom (jetrni protein, odgovoren za presnovo tujih snovi) bolj aktiven, pri drugem pa manj. Da bi ugotovili, kakšen citokrom ima določen bolnik, se pred uporabo zdravila predlaga analiza PCR. Ta analiza se imenuje predhodna genotipizacija. prospektivno genotipizacijo).

Kloniranje genov

Kloniranje genov (ne zamenjujte s kloniranjem organizmov) je postopek izolacije genov in kot rezultat manipulacije genskega inženiringa pridobivanje velike količine produkta določenega gena. PCR se uporablja za pomnoževanje gena, ki se nato vstavi v vektor- fragment DNA, ki prenaša tuj gen v isti ali drug organizem, primeren za gojenje. Kot vektorji se uporabljajo na primer plazmidi ali virusna DNA. Z vstavitvijo genov v tuj organizem se običajno pridobi produkt tega gena – RNK ali najpogosteje protein. Na ta način se pridobi veliko beljakovin v industrijskih količinah za uporabo v kmetijstvu, medicini itd.

riž. štiri: Kloniranje gena s plazmidom.
(1) Kromosomska DNA organizma A. (2) PCR. (3) Več kopij gena organizma A. (4) Vstavitev gena v plazmid. (5) Plazmid z genom organizma A. (6) Vnos plazmida v organizem B. (7) Pomnožitev števila kopij gena organizma A v organizmu B.

Sekvenciranje DNK

Pri metodi sekvenciranja z uporabo dideoksinukleotidov, označenih s fluorescentno ali radioaktivnim izotopom, je PCR sestavni del, saj se prav med polimerizacijo derivati ​​nukleotidov, označenih s fluorescentno ali radioaktivno oznako, vstavijo v verigo DNA. Dodatek dideoksinukleotida sintetizirani verigi prekine sintezo, kar omogoča določitev položaja specifičnih nukleotidov po ločitvi v gelu.

Mutageneza

Trenutno je PCR postala glavna metoda za izvajanje mutageneze (uvajanje sprememb v nukleotidnem zaporedju DNK). Uporaba PCR je omogočila poenostavitev in pospešitev postopka mutageneze ter njeno zanesljivost in ponovljivost.

S.V. Pospelova, M.V. Kuznecova

verižna reakcija polimeraze

S.V. Pospelova– Kand. med. znanosti, izredni profesor, Katedra za mikrobiologijo, virusologijo in imunologijo, M.V. Kuznecova– Kand. biol. Sci., uslužbenec IEGM UB RAS

Pospelova, S.V.

Namenjen samostojnemu delu študentov vseh fakultet: medicinske, pediatrične, medicinsko preventivne, stomatološke in fakultete za visoko šolstvo zdravstvene nege (FVSO) Medicinske akademije.

Recenzent:

glavo Oddelek za biologijo, ekologijo in medicinsko genetiko PSMA, red A.B. Vinogradov

Tiskano po sklepu centralne koordinacije
metodološki svet GOU VPO PGMA
njim. ak. E.A. Wagner Roszdrav

UDK 616-078.33

© Pospelova S.V., Kuznetsova M.V., 2007

© GOU VPO PGMA im. ak. E.A. Wagner Roszdrav, 2007

Verižna reakcija s polimerazo v klinični praksi
mikrobiološka diagnostika

Sodobna medicina uspešno uporablja dosežke naravoslovnih znanosti, intenzivno uporablja nove tehnologije za diagnosticiranje in zdravljenje bolezni. Tradicionalnim mikrobiološkim in imunološkim metodam laboratorijske diagnostike nalezljivih bolezni so se v zadnjem času pridružile nove metode, ki temeljijo na uporabi molekularno genetskih tehnologij. Uporaba teh metod ne le v znanstvene namene, ampak tudi v praktični laboratorijski diagnostiki je postala v veliki meri mogoča zaradi oblikovanja postopka umetnega večkratnega kopiranja DNK sredi 80-ih let in nadaljnjega hitrega razvoja te tehnologije, trenutno znan kot verižna reakcija polimeraze(PCR). V manj kot 15 letih svojega obstoja je analiza specifičnih zaporedij DNK številnih patogenov postala rutinska. Vsestranskost, visoka občutljivost in relativna enostavnost izvedbe so naredile metodo PCR nepogrešljivo pri reševanju različnih problemov klinične diagnostike, kot so neposredno odkrivanje in identifikacija patogenov, molekularna tipizacija in proučevanje lastnosti patogenih mikroorganizmov, analiza mutacij, povezanih z genetskimi. bolezni pri ljudeh in identifikacija osebe.

Kaj je PCR?

verižna reakcija polimeraze(PCR) - umetni postopek ponavljajočega se kopiranja (ojačitve) izvedeno specifično zaporedje DNK in vitro(slika 1). Kopiranje DNK med PCR izvaja poseben encim - DNA polimeraza, kot v celicah živih organizmov. DNA polimeraza, ki se premika vzdolž ene verige DNA (matrike), sintetizira njeno komplementarno zaporedje DNA. Pomembno je, da DNA polimeraza ne more začeti sinteze verige DNA "iz nič", potrebuje kratko "semensko" verigo RNK ali DNK, ki ji lahko začne dodajati nukleotide. Osnovno načelo PCR je, da polimerizacijsko reakcijo (sintezo polimerne verige DNK iz monomernih nukleotidnih enot) sprožijo specifične primerji(kratki fragmenti "semenske" DNK) v vsakem od številnih ponavljajočih se ciklov. Specifičnost PCR je določena s sposobnostjo primerjev, da "prepoznajo" strogo določeno regijo DNA in se nanjo vežejo po principu molekularne komplementarnost.

Pri običajni reakciji PCR se uporablja par primerjev, ki "omejujejo" pomnoženo regijo na obeh straneh z vezavo na nasprotni verigi DNK predloge. Za pomnožitev števila kopij originalne DNK je potrebna ciklična reakcija. Praviloma je vsak od zaporedno ponavljajočih se ciklov PCR sestavljen iz treh stopenj:

1)denaturacija, ali "taljenje" dvoverižne DNA: pred začetkom reakcije je tarčna DNA dvoverižna, pri temperaturi 94-95 0 C se komplementarni verigi DNA razideta - preideta v enoverižno stanje;

2) zavezujoče (žarjenje) primerji: pri temperaturi, ki je optimalna za izbrane primerje, se vežejo na komplementarno regijo matrične DNA;

3)raztezek, ali podaljšanje verige: DNA polimeraza dodaja nukleotide primerjem, sintetizira nove verige DNK, ki postanejo tarče za primerje v naslednjih ciklih PCR.

Sprememba stopenj vsakega cikla se izvede s spreminjanjem temperature reakcijske mešanice (glej sliko 1).

riž. 1. Glavni koraki cikla PCR

Sprva se primerji lahko vežejo samo na določeno zaporedje originalne DNK, v naslednjih ciklih pa se vežejo na kopije tega zaporedja, sintetiziranega v prejšnjih ciklih. V tem primeru se količina glavnega produkta PCR (kopija zaporedja DNA, omejena s primerji) v vsakem ciklu teoretično podvoji. Če je bila v začetnem ciklu v proučevanem materialu samo ena ciljna DNK, bosta po prvem ciklu že dve kopiji, po dveh ciklih - 4 kopije, rezultat tretjega cikla bo 8 kopij, trideset- peti - že 68 milijard izvodov (slika 2).

riž. 2. Postopek večkratnega kopiranja
Ciljna DNK med sekvenčnim
spreminjanje ciklov

Glavna metoda analize produktov reakcije, ki se tradicionalno uporablja v mnogih laboratorijih za odkrivanje pomnožene DNK in določanje njene velikosti, je metoda gel elektroforeza čemur sledi barvanje z barvilom, specifičnim za DNK, kot je etidijev bromid (slika 3).

Kontrola - različni fragmenti DNK z znanim številom njihovih sestavnih nukleotidov. Znano je, da je razdalja med različnimi fragmenti logaritemsko odvisna od njihove velikosti in mase. Vrstica 1 - Odkriti so bili fragmenti PCR približno 1850 baz. Vrstica 2 in 4 sta fragmenta, dolga približno 800 baz.

riž. 3. Analiza reakcijskih produktov po metodi
gel elektroforeza

Vrstica 3 - želeni fragmenti niso bili zaznani, negativen rezultat reakcije. Linija 5 - več linij je nastalo, ker so bili primerji komplementarni več fragmentom DNK različnih dolžin: približno 550, 800 in 1500 baz.

Izboljšanje tehnologije PCR

Sprva so bile za PCR uporabljene običajne DNA polimeraze, ki so bile izpostavljene temperaturni inaktivaciji v vsakem ciklu na stopnji denaturacije DNA. Polimerazo je bilo treba večkrat dodajati reakcijski mešanici, kar je bilo precej naporno in ni omogočalo avtomatizacije procesa.

Reakcija uporablja termostabilen DNA polimeraze, ki prenesejo visoke temperature v vseh fazah cikla PCR več deset ciklov. Število komercialno dostopnih termostabilnih DNA polimeraz, ki se razlikujejo po nekaterih lastnostih, je precej veliko. Najpogosteje uporabljena Taq polimeraza, prvotno izoliran iz termofilnega mikroorganizma Thermus aquaticus. Druge polimeraze se pogosteje uporabljajo za posebne PCR aplikacije. Sodobni komercialni pripravki termostabilnih polimeraz zagotavljajo praviloma stabilno ponovljivo aktivnost, kar omogoča uporabo tehnologije PCR v standardni laboratorijski praksi.

V zadnjih letih se je hitro razvila tudi tehnična zasnova spreminjanja temperature reakcijske zmesi. Najprej smo izvedli PCR z uporabo treh vodnih kopeli, nastavljenih na različne temperature: za denaturacijo DNA, žarjenje primerja in polimerizacijo. Epruvete so prenašali iz ene vodne kopeli v drugo »v krogu«, zaradi česar je prihajalo do spremembe temperature v različnih fazah cikla. Obstajale so tudi različice naprav, kjer je bila voda različnih temperatur izmenično dovajana v vodno kopel, v kateri so bile epruvete z reakcijsko mešanico. Spreminjanje ciklov je v teh primerih trajalo dolgo, proces pa je bilo težko avtomatizirati. Za izvajanje PCR se uporabljajo predvsem instrumenti (toplotni ciklerji), ki samodejno spreminjajo temperaturo glede na nastavljen program. V termičnih ciklerjih so epruvete z reakcijsko mešanico postavljene v kovinski blok, katerega temperatura se spreminja z visoko hitrostjo, kar skrajša trajanje posameznega cikla PCR.

Sodobni termični ciklerji so prilagojeni za uporabo posebnih tankostenskih plastičnih epruvet za reakcijsko mešanico, kar omogoča pospešitev izmenjave toplote med blokom naprave in reakcijsko mešanico ter na koncu še dodatno skrajša reakcijski čas.

Tako lahko standardni PCR izvedemo v 1-3 urah.Številne naprave omogočajo programiranje posebnih zapletenih temperaturnih profilov, ki so potrebni za specifične modifikacije procesa PCR.

Vzporedno z izpopolnjevanjem tehnologije PCR so se razvijale tudi metode za analizo produktov reakcije. Metoda gel elektroforeza ki mu sledi barvanje z barvilom, specifičnim za DNK, kot je etidijev bromid, se tradicionalno uporablja v številnih laboratorijih za odkrivanje pomnožene DNK in določanje njene velikosti. Uporaba hibridizacija z notranjimi DNA sondami omogoča v nekaterih primerih znatno povečanje občutljivosti in specifičnosti detekcije produktov PCR. Zaradi odsotnosti potrebe po pripravi in ​​izvajanju elektroforetskega ločevanja, možnosti avtomatizacije analize velikega števila vzorcev in uporabe neradioaktivnega detekcijskega formata, postaja ta metoda vse pogostejša. V nekaterih primerih vam uporaba posebnih fluorescentnih "markerjev" omogoča nadzor nad pomnoževanjem ali detekcijo končnih produktov PCR neposredno v reakcijski epruveti.

Uporaba PCR
v medicinski mikrobiologiji

Med številnimi različnimi področji klinične diagnostike zavzema medicinska mikrobiologija morda vodilno mesto po številu in raznolikosti aplikacij s tehnologijo PCR. Uvedba te metode v prakso je skupaj s serološko diagnostiko bistveno razširila možnosti sodobne klinične mikrobiologije, ki še vedno temelji na metodah izolacije in gojenja mikroorganizmov na umetnih hranilnih gojiščih ali v celični kulturi.

Priložnosti in omejitve tradicionalnega
metode gojenja

Kulturna diagnostična metoda, ki je tradicionalna za mikrobiološke laboratorije, se praviloma dobro upravičuje za odkrivanje in preučevanje takšnih lastnosti, kot so občutljivost na antibiotike, virulentnost zlahka gojenih mikroorganizmov. Nekateri mikroorganizmi (pnevmokok, hemofilus, neisseria, mikoplazma, obvezni anaerobi itd.) pa so lahko izjemno občutljivi na pogoje vzorčenja kliničnega materiala, transporta in gojenja, prisotnost posebnih rastnih faktorjev ali pa so sposobni razmnoževanja. in vitro samo v celični kulturi (virusi, klamidije, rikecije).

Počasna rast mikroorganizmov, kot so mikobakterije in glive, na umetnih gojiščih je še ena naravna omejitev, povezana z uporabo metode kulture za diagnozo teh mikroorganizmov. Poleg tega lahko delo z živimi kulturami izoliranih patogenov, ne le posebej nevarnih, ampak včasih oportunističnih patogenov, ogrozi zdravje laboratorijskega osebja.

Med povzročitelji človeških bolezni poznamo tudi negojene vrste bakterij, npr Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, in številne vrste virusov, vključno s človeškimi papiloma virusi in hepatitisom C, katerih poskusi rasti v celični kulturi so bili doslej neuspešni. Nazadnje, tudi pri uspešni kultivaciji obstaja potreba po naknadni identifikaciji izoliranih mikroorganizmov.

Tradicionalne mikrobiološke metode identifikacije temeljijo na uporabi različnih fenotipskih testov, kot so detekcija specifične encimske aktivnosti, sposobnosti presnove sladkorjev ali podpiranja rasti na gojiščih s selektivnimi dodatki. Vzrok za napačno identifikacijo je lahko težava pri standardizaciji pogojev takšnih testov, pa tudi naravna fenotipska variabilnost, ki je lastna številnim mikroorganizmom.

Uporaba PCR za neposredno diagnozo
in identifikacijo patogenov
nalezljive bolezni

V primerih, ko je uporaba metod gojenja problematična ali povezana z nezadostno diagnostično učinkovitostjo, je možna zamenjava biološkega pomnoževanja (tj. rasti na umetnih gojiščih) z encimskim podvajanjem nukleinskih kislin. in vitro z uporaba PCR je še posebej privlačna. Obstajajo različni pristopi k uporabi PCR za diagnozo povzročiteljev okužb. Najpogostejša vrsta PCR (specifični PCR) vključuje uporabo primerjev, ki se dopolnjujejo določeno zaporedje DNK značilnost strogo določene vrste mikroorganizmov. Na primer PCR pomnoževanje specifične regije gena, ki kodira glavni protein zunanje membrane (MOMP) Chlamydia trachomatis, v kombinaciji z neradioaktivno hibridizacijo za detekcijo reakcijskih produktov omogoča detekcijo posameznih kopij klamidijske DNA v proučevanih vzorcih. Hkrati je PCR v diagnostični učinkovitosti bistveno boljši od gojenja in metod neposrednega odkrivanja klamidijskega antigena (mikroimunofluorescenca in encimski imunski test), ki se tradicionalno uporabljajo za odkrivanje C. trachomatis.

Obstaja tudi možnost uporabe več parov vrstno specifičnih primerjev hkrati v eni reakcijski epruveti za hkratno pomnoževanje DNA različnih patogenov. Ta sprememba se imenuje večkratna PCR. (multipleks PCR). Z večkratno PCR lahko ugotovimo etiološko vlogo različnih mikroorganizmov, ki povzročajo določene vrste bolezni. Na primer, možnosti uporabe večkratne PCR za hkratno odkrivanje dveh (C. trachomatis in N. gonorrhoeae z boleznimi urogenitalnega trakta) ali celo štirje povzročitelji (I. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis in A. otitidis s kroničnim gnojnim otitisom).

Alternativni pristop k PCR diagnostiki je povezan z uporabo univerzalnih primerjev, ki omogočajo pomnoževanje genskih fragmentov, prisotnih v vseh mikroorganizmih določene taksonomske skupine. Število vrst, ki jih lahko identificiramo s to metodo, lahko omejimo tako z okvirjem majhnih sistematskih skupin (rod, družina) kot velikih taksonov na ravni reda, razreda, tipa. V slednjem primeru so tarča za PCR največkrat ribosomski geni (16S in 23S rRNA), ki imajo podobno zgradbo pri različnih prokariontskih mikroorganizmih.

Uporaba primerjev, ki so komplementarni ohranjenim regijam teh genov, omogoča pomnoževanje DNK večine bakterijskih vrst. Nastale fragmente ribosomskega gena PCR je nato mogoče analizirati z uporabo različnih laboratorijskih metod za identifikacijo bakterije, ki ji pripadajo. Najbolj natančna metoda »molekularne« identifikacije je določitev celotnega nukleotidnega zaporedja (sekvenciranje) pomnožene DNA in primerjava z ustreznimi zaporedji znanih vrst.

Kljub razpoložljivosti avtomatiziranih sistemov, ki uporabljajo opisani princip identifikacije, se v praksi običajno uporabljajo manj zamudne in drage metode, ki pa kljub temu omogočajo zanesljivo odkrivanje določenih razlik v zaporedju fragmentov DNA. Najpogostejše so metode, ki temeljijo na analizi lokacije cepitvenih mest v DNK z restrikcijskimi encimi (metoda RFLP - polimorfizem dolžine restrikcijskih fragmentov), ali o določanju elektroforetske mobilnosti DNK v enoverižni obliki (SSCP-metoda). enoverižni konformacijski polimorfizem).

PCR z uporabo univerzalnih primerjev se lahko uporablja za identifikacijo mikroorganizmov, izoliranih v čisti kulturi, in za neposredno diagnosticiranje širokega spektra patogenov neposredno v kliničnih vzorcih. Vendar je treba opozoriti, da je občutljivost "širokospektralnega" PCR na splošno nižja kot pri "vrstno specifičnih" testnih sistemih. Poleg tega se PCR z univerzalnimi primerji običajno ne uporablja za preučevanje vzorcev, ki lahko vsebujejo veliko število različnih mikroorganizmov, zaradi težav pri analizi reakcijskih produktov, dobljenih s pomnoževanjem DNA različnih vrst.

Metode molekularnega tipiziranja
mikroorganizmov na osnovi PCR

PCR se široko uporablja ne le za diagnozo in identifikacijo, temveč tudi za tipizacijo podvrst in analizo genetskega sorodstva (klonalnosti) izoliranih sevov mikroorganizmov, zlasti pri izvajanju epidemioloških študij. V primerjavi s tradicionalnimi fenotipskimi metodami (bio-, fago- in serotipizacija) genotipizacijo na podlagi PCR odlikujejo vsestranskost, globlja stopnja diferenciacije, možnost uporabe kvantitativnih metod za oceno identitete sevov in visoka ponovljivost. Opisanih je veliko metod genotipizacije, ki jih lahko štejemo za izpeljanke tehnologije PCR.

Kljub raznolikosti metod PCR tipizacije je večini skupna uporaba gelske elektroforeze za ločevanje različno dolgih fragmentov DNA, pridobljenih iz vsakega posameznega seva. Hkrati vizualno ali računalniško opravljena primerjalna analiza posameznih elektroforetskih profilov omogoča oceno stopnje genetskega sorodstva proučevanih sevov.

Uporaba PCR za odkrivanje drog
odpornost mikroorganizmov

V zadnjem času se PCR vedno bolj uporablja za preučevanje različnih lastnosti patogenih mikroorganizmov, zlasti za ugotavljanje odpornosti določenih vrst patogenov na določena zdravila. Praviloma je uporaba PCR za določanje občutljivosti mikroorganizmov primerna le v primerih, ko tradicionalne fenotipske metode niso uporabne ali niso dovolj učinkovite. Na primer, definicija občutljivosti Mycobacterium tuberculosis do zdravil proti tuberkulozi z uporabo metod kulture običajno traja od 4 do 8 tednov. Poleg tega so rezultati fenotipskih testov v takšnih primerih lahko popačeni zaradi zmanjšanja aktivnosti protimikrobnih sredstev med dolgotrajnim gojenjem mikroorganizmov. Študija molekularnih mehanizmov odpornosti na zdravila M. tuberkuloza in nekaterih drugih patogenov je omogočil razvoj metod, ki temeljijo na PCR, za hitro odkrivanje genetskih markerjev odpornosti.

Za takšno analizo običajno uporabimo DNK ali RNK patogena, izoliranega v čisti kulturi. Vendar pa v nekaterih primerih obstaja možnost neposredne PCR analize za odpornost na antibiotike brez predhodne kultivacije patogena. Študirani vzorec kliničnega materiala se uporabi kot vir tarčne DNA za PCR, kopirani produkt PCR pa se analizira za odkrivanje mutacij, povezanih z odpornostjo na antibiotike. Na primer, razvita je bila metoda, ki omogoča uporabo PCR za odkrivanje odpornosti patogena na rifampicin pri bolnikih s tuberkuloznim meningitisom.

Vendar pa obstajajo naravne omejitve za uporabo genetskih metod za ocenjevanje odpornosti mikroorganizmov na zdravila:

Podatki o specifičnih genskih mehanizmih odpornosti morda niso na voljo;

Odpornost na določena zdravila je pogosto povezana z različnimi mehanizmi in mutacijami v različnih genih, ki neodvisno vplivajo na fenotip.

Na primer, odpornost po Gramu negativnih bakterij na aminoglikozidne antibiotike lahko povzroči proizvodnja različnih encimov, ki spreminjajo aminoglikozide, ali spremembe v prepustnosti celične stene. V tem primeru rezultati PCR analize, ki vedno označujejo strogo določeno specifično regijo DNA, ne morejo služiti kot osnova za oceno občutljivosti mikroorganizma kot celote.

Poleg tega je pomanjkanje mednarodnih standardov in priporočil za uporabo PCR za določanje občutljivosti na protimikrobna zdravila dodaten dejavnik, ki omejuje možnost široke uporabe tega pristopa v praktični diagnostiki.

V zadnjem času je bila razvita zanesljiva, zelo občutljiva in hitra metoda za diagnosticiranje različnih človeških nalezljivih bolezni. Ta metoda se imenuje "analiza PCR". Kaj je to, kaj je njegovo bistvo, katere mikroorganizme lahko razkrije in kako ga pravilno jemati, bomo povedali v našem članku.

Zgodovina odkritij

Metode PCR se uporabljajo tudi pri diagnosticiranju raka.

Prednosti metode

Diagnostika PCR ima več prednosti:

1. Visoka občutljivost. Tudi ob prisotnosti le nekaj molekul DNK mikroorganizmov PCR analiza ugotovi prisotnost okužbe. Metoda bo pomagala pri kroničnih in latentnih boleznih. Pogosto je v takih primerih mikroorganizem sicer nekulturen.
2. Vsak material je primeren za raziskave, na primer slina, kri, genitalni izločki, lasje, epitelne celice. Najpogostejši je krvni test in urogenitalni bris za PCR.

   

3. Dolgotrajno gojenje pridelkov ni potrebno. Avtomatiziran diagnostični postopek vam omogoča, da dobite rezultate študije po 4-5 urah.
4. Metoda je skoraj 100% zanesljiva. Zabeleženi so bili le posamezni primeri lažno negativnih rezultatov.
5. Možnost identifikacije več vrst patogenov iz enega vzorca materiala. To ne le pospeši postopek diagnosticiranja bolezni, ampak tudi znatno zmanjša materialne stroške. Pogosto zdravnik predpiše celovito analizo PCR. Cena pregleda, ki ga sestavlja določitev šestih patogenov, je približno 1500 rubljev.

Da bi bili rezultati med študijo PCR zanesljivi, je treba analizo opraviti ob upoštevanju priporočil za predhodno pripravo na diagnozo:

1. Pred darovanjem sline se morate vzdržati hrane in jemanja zdravil 4 ure pred odvzemom materiala. Neposredno pred postopkom sperite usta s prekuhano vodo.
2. Zgornja pravila je treba upoštevati tudi pri jemanju vzorca z notranje površine lica. Po izpiranju je priporočljivo izvesti rahlo masažo kože, da poudarite skrivnost žleze.
3. Urin se običajno zbira doma. Če želite to narediti, morate opraviti temeljito stranišče genitalij. Zberite 50-60 ml urina v sterilno plastično posodo. Za zagotovitev čistosti materiala je priporočljivo, da ženske tampon vstavijo v nožnico, moški pa, da kožno gubo potegnejo čim dlje. Materiala ne morete vzeti med menstruacijo.
4. Za darovanje sperme se morate vzdržati spolnih odnosov 3 dni pred zbiranjem materiala. Zdravniki odsvetujejo tudi obisk savne in vroče kopeli, pitje alkohola in začinjene hrane. 3 ure pred analizo se morate vzdržati uriniranja.
5. Za porod, na primer, če se opravi test PCR za klamidijo, se ženskam in moškim priporoča spolni počitek 3 dni. 2 tedna pred analizo ne smete jemati antibakterijskih zdravil. Za en teden morate prenehati uporabljati intimne gele, mazila, vaginalne svečke, izpiranje. 3 ure pred pregledom se morate vzdržati uriniranja. Med menstruacijo se vzorčenje materiala ne izvaja, le 3 dni po prenehanju izločanja krvi lahko vzamete urogenitalni bris.

PCR med nosečnostjo

Med čakanjem na otroka so številne spolno prenosljive okužbe izjemno nevarne za normalen razvoj ploda. SPO lahko povzročijo intrauterini zastoj rasti, spontani splav ali prezgodnji porod, prirojene malformacije otroka. Zato je izredno pomembno opraviti PCR preiskavo v zgodnji nosečnosti. Ob registraciji je potrebno opraviti analizo - do 12 tednov.



Material se vzame iz cervikalnega kanala s posebno krtačo. Postopek je neboleč in ne predstavlja nevarnosti za otroka. Običajno se med nosečnostjo opravi analiza za klamidijo z metodo PCR, pa tudi za ureaplazmozo, mikoplazmozo, citomegalovirus, herpes, papiloma virus. Tak kompleks preiskav se imenuje PCR-6.

PCR za diagnozo HIV

Ker je metoda zelo občutljiva na spremembe v telesu in pogoje diagnoze, lahko na rezultat vpliva veliko dejavnikov. Zato analiza PCR za okužbo s HIV ni zanesljiva metoda, njena učinkovitost je 96-98%. V preostalih 2-4% primerov test daje lažno pozitivne rezultate.

Toda v nekaterih situacijah brez PCR diagnostike HIV ni mogoče. Običajno se daje ljudem z lažno negativnim rezultatom ELISA. Takšni kazalniki kažejo, da oseba še ni razvila protiteles proti virusu in jih ni mogoče odkriti brez večkratnega povečanja števila. Prav to je mogoče doseči z izvajanjem krvnega testa z metodo PCR.

Takšna diagnostika je potrebna tudi za otroke prvega leta življenja, rojene od HIV pozitivne matere. Metoda je edini način za zanesljivo določitev statusa otroka.

PCR za diagnozo hepatitisa

Metoda verižne reakcije s polimerazo omogoča odkrivanje DNK virusa hepatitisa A, B, C že dolgo pred nastankom protiteles proti okužbi ali pojavom simptomov bolezni. Analiza PCR za hepatitis C je še posebej učinkovita, saj je v 85% primerov ta bolezen asimptomatska in brez pravočasnega zdravljenja preide v kronično fazo.



Pravočasno odkrivanje patogena bo pomagalo preprečiti zaplete in dolgotrajno zdravljenje.

Celovit PCR pregled

Celovita analiza PCR: preiskava z metodo polimerne verižne reakcije, ki vključuje določanje več vrst okužb hkrati: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, citomegalovirus, herpes tipa 1 in 2, gonoreja, papiloma virus. Cena takšne diagnostike se giblje od 2000 do 3500 rubljev. odvisno od klinike, uporabljenih materialov in opreme, pa tudi od vrste analize: kvalitativne ali kvantitativne. Kaj je potrebno v vašem primeru - odloči zdravnik. V nekaterih primerih je dovolj samo določiti prisotnost patogena, v drugih, na primer pri okužbi s HIV, ima kvantitativni titer pomembno vlogo. Pri diagnosticiranju vseh zgoraj navedenih patogenov se pregled imenuje "analiza PCR-12".

Dešifriranje rezultatov analize

Dešifriranje analize PCR ni težko. Obstajata samo 2 lestvici kazalnika - "pozitiven rezultat" in "negativen rezultat". Ko je patogen odkrit, lahko zdravniki z 99-odstotno gotovostjo potrdijo prisotnost bolezni in začnejo zdravljenje bolnika. Pri kvantitativni metodi za določanje okužbe bo v ustreznem stolpcu naveden numerični indikator odkritih bakterij. Samo zdravnik lahko določi stopnjo bolezni in predpiše potrebno zdravljenje.



V nekaterih primerih, na primer pri določanju okužbe s HIV s PCR, z negativnim rezultatom postane potrebno opraviti dodatne preglede za potrditev pridobljenih kazalcev.

Kje vzeti analizo?

Kje opraviti analizo PCR: v javni kliniki ali v zasebnem laboratoriju? Na žalost so v občinskih zdravstvenih ustanovah oprema in metode pogosto zastarele. Zato je bolje dati prednost zasebnim laboratorijem s sodobno opremo in visoko usposobljenim osebjem. Poleg tega boste v zasebni kliniki rezultate dobili veliko hitreje.

V Moskvi številni zasebni laboratoriji ponujajo analizo PCR za različne okužbe. Na primer, v takih klinikah, kot so Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro, se izvaja analiza PCR. Cena pregleda je od 200 rubljev. za identifikacijo posameznega patogena.

Zaključimo lahko, da je diagnoza nalezljivih bolezni s PCR v večini primerov hiter in zanesljiv način za odkrivanje povzročitelja v telesu v zgodnjih fazah okužbe. Toda v nekaterih primerih je vredno izbrati druge diagnostične metode. Samo specialist lahko ugotovi potrebo po takšni študiji. Dešifriranje analize PCR zahteva tudi profesionalen pristop. Upoštevajte zdravnikova navodila in ne opravljajte testov, ki jih ne potrebujete.