დნმ პოლიმერაზას რეაქცია დადებითია. PCR ანალიზი: რა არის ეს? როგორ გავაკეთოთ PCR ტესტი სწორად. PCR არის ფარული ინფექციების გამოვლენის მთავარი მეთოდი

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR)არის ბიოქიმიური ტექნოლოგიის მეთოდი მოლეკულურ ბიოლოგიაში, რომელიც ხორციელდება დნმ-ის ფრაგმენტების ერთი ან რამდენიმე ასლის რამდენიმე გრადუსით გაზრდის მიზნით, რაც შესაძლებელს ხდის შექმნას დნმ-ის კონკრეტული თანმიმდევრობის რამდენიმე ათასიდან მილიონამდე ასლი.

შემუშავებული 1983 წელს Cary Mullis-ის მიერ, PCR ახლა არის გავრცელებული და ხშირად შეუცვლელი ტექნიკა, რომელიც გამოიყენება სამედიცინო და ბიოლოგიურ კვლევით ლაბორატორიებში სხვადასხვა აპლიკაციებისთვის. მათ შორისაა დნმ-ის კლონირება თანმიმდევრობისთვის, დნმ-ზე დაფუძნებული ფილოგენეზი ან გენების ფუნქციური ანალიზი; მემკვიდრეობითი დაავადებების დიაგნოსტიკა; გენეტიკური თითის ანაბეჭდების აღმოჩენა (გამოიყენება სასამართლო მეცნიერებაში და მამობის ტესტირებაში) და ინფექციური დაავადებების გამოვლენა და დიაგნოსტიკა. 1993 წელს მალისს მიენიჭა ნობელის პრემია ქიმიაში მაიკლ სმიტთან ერთად PCR-ზე მუშაობისთვის.

მეთოდი ემყარება თერმულ ციკლს, რომელიც შედგება გათბობისა და გაგრილების განმეორებითი ციკლებისგან, რეაქციისგან დენატურაციაზე და ფერმენტებით დნმ-ის რეპლიკაციაზე. პრაიმერები (დნმ-ის მოკლე ნაწილაკები), რომლებიც შეიცავენ სამიზნე უბნის შემავსებელ თანმიმდევრობებს დნმ პოლიმერაზასთან ერთად (საიდანაც მეთოდი იღებს სახელს), არის ძირითადი კომპონენტები სელექციური და განმეორებითი გაძლიერებისთვის. PCR პროცესში, სინთეზირებული დნმ თავად გამოიყენება რეპლიკაციის შაბლონად, რაც ააქტიურებს ჯაჭვურ რეაქციას, რომელშიც დნმ-ის შაბლონი ექსპონენციალურად ძლიერდება. PCR შეიძლება მნიშვნელოვნად შეიცვალოს გენეტიკური მანიპულაციების ფართო სპექტრის შესასრულებლად.

PCR-ის თითქმის ყველა აპლიკაცია იყენებს თერმოსტაბილურ დნმ პოლიმერაზას, როგორიცაა Taq პოლიმერაზა, ფერმენტი, რომელიც თავდაპირველად იზოლირებული იყო ბაქტერიებისგან. თერმუსიაკვატიკუსი. ეს დნმ პოლიმერაზა ფერმენტულად აგროვებს დნმ-ის ახალ ჯაჭვს დნმ-ის სამშენებლო ბლოკებიდან - ნუკლეოტიდებიდან, იყენებს ერთჯაჭვიან დნმ-ს შაბლონად და დნმ-ის ოლიგონუკლეოტიდებს (ასევე უწოდებენ დნმ პრაიმერებს), რომლებიც აუცილებელია დნმ-ის სინთეზის დასაწყებად. PCR მეთოდების აბსოლუტური უმრავლესობა იყენებს თერმულ ციკლირებას, ანუ PCR ნიმუშის მონაცვლეობით გათბობას და გაგრილებას ტემპერატურის საფეხურების გარკვეულ სერიაზე. ეს თერმული ციკლის საფეხურები აუცილებელია პირველ რიგში დნმ-ის ორმაგი სპირალის ორი ჯაჭვის ფიზიკურად განცალკევებისთვის მაღალ ტემპერატურაზე პროცესში, რომელსაც ეწოდება დნმ-ის დენატურაცია. დაბალ ტემპერატურაზე, თითოეული ჯაჭვი გამოყენებული იქნება როგორც შაბლონი დნმ პოლიმერაზას მიერ დნმ-ის სინთეზში, რათა შერჩევით გააძლიეროს სამიზნე დნმ-ის რეგიონი. PCR-ის შედეგების სელექციურობა პრაიმერების გამოყენებით, რომლებიც ავსებენ სამიზნე დნმ-ის რეგიონს გაძლიერებისთვის გარკვეული თერმული ციკლის პირობებში.

PCR დიაგნოსტიკის პრინციპები

PCR გამოიყენება დნმ-ის ჯაჭვის (სამიზნე დნმ) კონკრეტული მონაკვეთის გასაძლიერებლად. PCR მეთოდების უმეტესობა, როგორც წესი, აძლიერებს დნმ-ის ფრაგმენტებს ~ 10000 ბაზის წყვილამდე (კბ), თუმცა ზოგიერთ მეთოდს შეუძლია ფრაგმენტების 40 კბ-მდე გაზრდა. რეაქცია წარმოქმნის საბოლოო გაძლიერებული პროდუქტის შეზღუდულ რაოდენობას, რომელიც რეგულირდება რეაქციის პროდუქტების რეაქციაში და უკუკავშირის დათრგუნვაში არსებული რეაგენტებით.

ძირითადი PCR ნაკრები მოითხოვს რამდენიმე კომპონენტს და რეაგენტს. Ესენი მოიცავს:

• დნმ-ის შაბლონი, რომელიც შეიცავს სამიზნე დნმ რეგიონს, რომელიც საჭიროებს გაძლიერებას.
• ორი პრაიმერიავსებს სამიზნე დნმ-ის თითოეული სენსორული და ანტიმგრძნობიარე ჯაჭვის 3" ბოლოებს.
• Taq პოლიმერაზაან სხვა დნმ პოლიმერაზა, რომელიც მოქმედებს დაახლოებით 70 °C ოპტიმალურ ტემპერატურაზე.
• დეოქსინუკლეოზიდის ტრიფოსფატები(dNTPs; ნუკლეოტიდების შემცველი ტრიფოსფატის ჯგუფები), სამშენებლო ბლოკები, საიდანაც დნმ პოლიმერაზა ასინთეზებს დნმ-ის ახალ ჯაჭვს.
• ბუფერული ხსნარიდნმ-პოლიმერაზას ოპტიმალური აქტივობისა და სტაბილურობისთვის შესაფერის ქიმიურ პირობებს უზრუნველყოფს.
• ორვალენტიანი კათიონებიმაგნიუმის ან მანგანუმის იონები; Mg2+ ჩვეულებრივ გამოიყენება, მაგრამ Mn2+ ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას PCR-ს შუამავლობით დნმ-ის მუტაგენეზისთვის, ვინაიდან Mn2+-ის უფრო მაღალი კონცენტრაცია ზრდის შეცდომის სიხშირეს დნმ-ის სინთეზის დროს.
• მონოვალენტური კათიონებიკალიუმის იონები.

PCR ჩვეულებრივ ტარდება რეაქციის მოცულობით 10-200 μl მცირე რეაქციის მილებში (მოცულობა 0.2-0.5 მლ) თერმოციკლერის გამაძლიერებელში. გამაძლიერებელი ათბობს და აციებს რეაქციის მილებს, რათა მიაღწიოს რეაქციის თითოეული ეტაპისთვის საჭირო ტემპერატურას. ბევრი თანამედროვე თერმოციკლატორი იყენებს Peltier-ის ეფექტს, რომელიც საშუალებას აძლევს PCR მილების ბლოკს გაცხელდეს და გაცივდეს უბრალოდ ელექტრო დენის მიმართულების შეცვლით. თხელკედლიანი რეაქციის მილები ხელს უწყობს ხელსაყრელ თბოგამტარობას, რათა უზრუნველყოს სწრაფი თერმული წონასწორობა. ძველ ციკლერებს, რომლებსაც არ აქვთ გაცხელებული სახურავი, სჭირდებათ ზეთის ფენა რეაქციის ნარევის ზედაპირზე ან ცვილის მძივი სინჯარაში.

Პროცედურა

როგორც წესი, PCR შედგება 20-40 განმეორებითი ტემპერატურის ცვლილების სერიისგან, რომელსაც ეწოდება ციკლები, რომელთაგან თითოეული ციკლი, როგორც წესი, შედგება 2-3 დისკრეტული ტემპერატურის საფეხურისგან, ჩვეულებრივ სამი. ველოსიპედით მოძრაობა ხშირად იწყება და მთავრდება ერთი ტემპერატურის საფეხურით (ე.წ ელოდება) მაღალ ტემპერატურაზე (>90°C) საბოლოო პროდუქტის გაფართოების ან მოკლევადიანი შენახვისთვის. გამოყენებული ტემპერატურა და მათი გამოყენების ხანგრძლივობა თითოეულ ციკლში დამოკიდებულია ბევრ პარამეტრზე. ეს მოიცავს ფერმენტს, რომელიც გამოიყენება დნმ-ის სინთეზისთვის, რეაქციაში ორვალენტიანი იონების და dNTP-ების კონცენტრაციას და პრაიმერების დნობის ტემპერატურას (Tm).

• ინიციალიზაციის ეტაპი:ეს საფეხური შედგება რეაქციის გაცხელებისგან 94-96 °C ტემპერატურამდე (ან 98 °C, თუ მაღალი თერმოსტაბილური პოლიმერაზები გამოიყენება) 1-9 წუთის განმავლობაში. ნაბიჯი საჭიროა მხოლოდ დნმ პოლიმერაზებისთვის, რომლებიც საჭიროებენ გააქტიურებას სითბოთი, ეგრეთ წოდებული ცხელი დაწყების PCR.
• დენატურაციის ეტაპი:არის პირველი რეგულარული თერმოციკლური მოვლენა და შედგება რეაქციის გაცხელებისგან 94-98°C-მდე 20-30 წამის განმავლობაში. ეს იწვევს დნმ-ის შაბლონის დაშლას წყალბადის ბმების განადგურებით კომპლემენტურ ფუძეებს შორის და ერთჯაჭვიანი დნმ-ის მოლეკულების წარმოქმნით.
• დამუშავების ეტაპი:რეაქციის ტემპერატურა 20-40 წამში მცირდება 50-65°C-მდე, რაც პრაიმერებს საშუალებას აძლევს ერთჯაჭვიან დნმ-ის შაბლონს დაუკავშირონ. როგორც წესი, ანეილირების ტემპერატურა დაახლოებით 3-5 გრადუსი ცელსიუსით დაბალია გამოყენებული პრაიმერების Tm-ზე. სტაბილური დნმ-დნმ წყალბადის ბმები იქმნება მხოლოდ მაშინ, როდესაც პრაიმერის თანმიმდევრობა უფრო მჭიდროდ ემთხვევა თანმიმდევრობის შაბლონს. პოლიმერაზა უერთდება პრაიმერი-თარგის ჰიბრიდს და იწყებს დნმ-ის სინთეზს.
• გაფართოების/დაფართოების ეტაპი:ტემპერატურა ამ ეტაპზე დამოკიდებულია გამოყენებული დნმ პოლიმერაზაზე; Taq პოლიმერაზას აქვს აქტივობის ოპტიმალური ტემპერატურა 75-80°C; ამ ფერმენტისთვის ჩვეულებრივ გამოიყენება 72°C ტემპერატურა. ამ ეტაპზე, დნმ პოლიმერაზა სინთეზირებს დნმ-ის ახალ ჯაჭვს, რომელიც ავსებს შაბლონის დნმ-ის ჯაჭვს, ამატებს dNTP-ებს, რომლებიც ავსებს შაბლონს 5"-დან 3"-მდე მიმართულებით, აკავშირებს dNTP-ის 5"-ფოსფატულ ჯგუფს 3"-თან. ჰიდროქსილის ჯგუფი მიღებული (გაგრძელებული) დნმ-ის ბოლოს. გაფართოების დრო დამოკიდებულია როგორც გამოყენებულ დნმ პოლიმერაზაზე, ასევე დნმ-ის ფრაგმენტის სიგრძეზე, რომელიც უნდა გაძლიერდეს. როგორც წესი, ოპტიმალურ ტემპერატურაზე დნმ პოლიმერაზა პოლიმერიზებს ათას ბაზას წუთში. ოპტიმალურ პირობებში, ე.ი. შემზღუდავი სუბსტრატების ან რეაგენტების გამო შეზღუდვების არარსებობის შემთხვევაში, გაფართოების თითოეულ საფეხურზე სამიზნე დნმ-ის რაოდენობა ორმაგდება, რაც იწვევს დნმ-ის ფრაგმენტის ექსპონენციალურ (გეომეტრიულ) გაძლიერებას.
• საბოლოო გაფართოება:ეს არის ერთჯერადი ნაბიჯი, რომელიც ზოგჯერ კეთდება 70-74°C ტემპერატურაზე 5-15 წუთის განმავლობაში ბოლო PCR ციკლის შემდეგ, რათა უზრუნველყოფილ იქნას დარჩენილი ერთჯაჭვიანი დნმ-ის სრულად გახანგრძლივება.
• საბოლოო მოლოდინი:ეს ნაბიჯი 4-15°C-ზე განუსაზღვრელი ვადით შეიძლება გამოყენებულ იქნას რეაქციის ხანმოკლე დროით შესანარჩუნებლად. იმის შესამოწმებლად, მოახდინა თუ არა PCR სინთეზირებული დნმ-ის მოსალოდნელი ფრაგმენტი (ასევე ზოგჯერ უწოდებენ "ამპლიმერს" ან "ამპლიკონს"), აგაროზის გელის ელექტროფორეზი გამოიყენება PCR პროდუქტების ზომის მიხედვით გამოსაყოფად. PCR პროდუქტების ზომა განისაზღვრება დნმ-ის კიბესთან შედარებით (მოლეკულური წონის მარკერი), რომელიც შეიცავს ცნობილი ზომის დნმ-ის ფრაგმენტებს, რომლებიც შესრულებულია გელზე PCR პროდუქტებთან ერთად.

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის ეტაპები

PCR პროცესი შეიძლება დაიყოს სამ ეტაპად:

1. ექსპონენციალური გაძლიერება: ყოველი ციკლის განმავლობაში პროდუქტის რაოდენობა ორმაგდება (რეაქციის 100% ეფექტურობის გათვალისწინებით). რეაქცია ძალიან მგრძნობიარეა: საჭიროა მხოლოდ მცირე რაოდენობით დნმ.
2. ნიველირებადი ეტაპირეაქცია ნელდება, რადგან დნმ პოლიმერაზა კარგავს აქტივობას და რეაგენტების მოხმარება, როგორიცაა dNTP და პრაიმერები, იწვევს მათ შეზღუდვას. .
3. პლატო: პროდუქტი აღარ გროვდება რეაგენტებისა და ფერმენტების ამოწურვის გამო.

PCR ოპტიმიზაცია

პრაქტიკაში, PCR შეიძლება ჩავარდეს სხვადასხვა მიზეზის გამო, განსაკუთრებით მისი მგრძნობელობა დაბინძურების მიმართ, რაც იწვევს დნმ-ის ქვეპროდუქტების გაძლიერებას. ამასთან დაკავშირებით, შემუშავებულია მრავალი ტექნიკა და პროცედურა PCR პირობების ოპტიმიზაციისთვის. გარე დნმ-ის დაბინძურება განიხილება ლაბორატორიული პროტოკოლებითა და პროცედურებით, რომლებიც ასუფთავებენ დნმ-ის პოტენციური დამაბინძურებლების წინასწარ PCR ნარევებს. ეს, როგორც წესი, გულისხმობს PCR კომპლექტების სივრცით გამოყოფას PCR პროდუქტების ანალიზისთვის ან გაწმენდისთვის, ერთჯერადი პლასტმასის ჭურჭლის გამოყენებით და სამუშაო ზედაპირის საფუძვლიან გაწმენდას რეაქციის ეტაპებს შორის. პრაიმერის დიზაინის ტექნიკა მნიშვნელოვან როლს თამაშობს PCR პროდუქტების აღდგენის გაუმჯობესებაში და გვერდითი პროდუქტების წარმოქმნის თავიდან აცილებაში, ხოლო ალტერნატიული ბუფერული კომპონენტების ან პოლიმერაზას ფერმენტების გამოყენებამ შეიძლება ხელი შეუწყოს დნმ-ის გრძელი ან სხვაგვარად პრობლემური მონაკვეთების გაძლიერებას. ისეთი რეაგენტების დამატება, როგორიცაა ფორმამიდი ბუფერულ სისტემებში, შეუძლია გაზარდოს PCR-ის სპეციფიკა და აღდგენა. თეორიული PCR შედეგების კომპიუტერული სიმულაცია (ელექტრონული PCR) შეიძლება შესრულდეს პრაიმერის დიზაინის დასახმარებლად.

PCR-ის გამოყენება

დნმ-ის შერჩევითი ექსტრაქცია

PCR საშუალებას იძლევა დნმ-ის ფრაგმენტების გამოყოფა გენომიური დნმ-დან დნმ-ის კონკრეტული რეგიონის შერჩევითი გაძლიერებით. PCR-ის ეს გამოყენება ავსებს ბევრ ტექნიკას, როგორიცაა ჰიბრიდიზაციის ზონდების გენერირება სამხრეთის ან ჩრდილოეთის ბლოტისთვის და დნმ-ის კლონირებისთვის, რაც მოითხოვს დნმ-ის დიდ რაოდენობას, რომელიც წარმოადგენს დნმ-ის კონკრეტულ რეგიონს. PCR უზრუნველყოფს ამ მეთოდებს სუფთა დნმ-ის მაღალი შემცველობით, რაც საშუალებას აძლევს დნმ-ის ნიმუშებს გაანალიზდეს საწყისი მასალის მცირე რაოდენობითაც კი.

PCR-ის სხვა აპლიკაციები მოიცავს დნმ-ის თანმიმდევრობას უცნობი PCR- გაძლიერებული თანმიმდევრობების იდენტიფიცირებისთვის, რომელშიც ერთ-ერთი გამაძლიერებელი პრაიმერი შეიძლება გამოყენებულ იქნას Sanger-ის თანმიმდევრობის დროს, დნმ-ის თანმიმდევრობის ექსტრაქცია რეკომბინანტული დნმ ტექნოლოგიების დასაჩქარებლად, რომელიც მოიცავს დნმ-ის თანმიმდევრობის პლაზმიდში ან გენეტიკურ მასალაში ჩასმას. სხვა ორგანიზმის. ბაქტერიების კოლონიები (E. coli) შეიძლება სწრაფად შემოწმდეს PCR-ით ვექტორის დნმ-ის დიზაინის გამოსასწორებლად. PCR ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას გენეტიკური თითის ანაბეჭდისთვის; ტექნიკა, რომელიც გამოიყენება სასამართლო მედიცინაში პიროვნების ან ორგანიზმის იდენტიფიცირებისთვის ექსპერიმენტული დნმ-ის შედარების გზით სხვადასხვა PCR მეთოდების გამოყენებით.

PCR თითის ანაბეჭდის ზოგიერთ მეთოდს აქვს მაღალი დისკრიმინაციული ძალა და შეიძლება გამოყენებულ იქნას გენეტიკური ურთიერთობების დასადგენად ინდივიდებს შორის, როგორიცაა მშობელი-შვილი ან და-ძმას შორის, და გამოიყენება მამობის გამოვლენაში. ეს ტექნიკა ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას ორგანიზმებს შორის ევოლუციური ურთიერთობების დასადგენად.

დნმ-ის გაძლიერება და რაოდენობრივი განსაზღვრა

იმის გამო, რომ PCR ზრდის დნმ-ის მიზნობრივი რეგიონების ასლების რაოდენობას, PCR შეიძლება გამოყენებულ იქნას ნიმუშის ძალიან მცირე რაოდენობის გასაანალიზებლად. ეს ხშირად კრიტიკულია სასამართლო ექსპერტიზის შემთხვევებში, სადაც მხოლოდ დნმ-ის კვალი ხელმისაწვდომია როგორც მტკიცებულება. PCR ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას უძველესი დნმ-ის გასაანალიზებლად, რომელიც ათობით ათასი წლისაა. ეს PCR მეთოდები წარმატებით იქნა გამოყენებული ცხოველებზე, როგორიცაა ორმოცი ათასი წლის მამონტი, ისევე როგორც ადამიანის დნმ, ეგვიპტური მუმიების ანალიზიდან რუსეთის ცარის იდენტიფიკაციამდე.

რაოდენობრივი PCR მეთოდები აფასებს მოცემული თანმიმდევრობის რაოდენობას ნიმუშში, მეთოდი, რომელიც ხშირად გამოიყენება გენის ექსპრესიის დონის დასაზომად. რეალურ დროში PCR არის დამკვიდრებული ინსტრუმენტი დნმ-ის რაოდენობრივი ანალიზისთვის, რომელიც ზომავს პროდუქტის დნმ-ის დაგროვებას ყოველი PCR ამპლიფიკაციის ციკლის შემდეგ.

PCR დაავადების დიაგნოსტიკაში

PCR იძლევა ავთვისებიანი დაავადებების ადრეულ დიაგნოზს, როგორიცაა ლეიკემია და ლიმფომა, რომელიც ამჟამად ძალიან განვითარებულია კიბოს კვლევაში და უკვე გამოიყენება რუტინულად. PCR შეიძლება განხორციელდეს უშუალოდ გენომიური დნმ-ის ნიმუშებზე ტრანსლოკაციისთვის სპეციფიური ავთვისებიანი უჯრედების გამოსავლენად, რომელთა მგრძნობელობა სულ მცირე 10000-ჯერ აღემატება სხვა მეთოდებს.

PCR ასევე შეუძლია აღმოაჩინოს არაკულტურული ან ნელა მზარდი მიკროორგანიზმები, როგორიცაა მიკობაქტერიები, ანაერობული ბაქტერიები და ვირუსები ქსოვილის კულტურიდან და ცხოველური მოდელებიდან. მიკრობიოლოგიის სფეროში PCR დიაგნოსტიკური გამოყენების საფუძველია ინფექციური აგენტების იდენტიფიცირება და არაპათოგენური შტამების დიფერენცირება პათოგენურისგან სპეციფიკური გენების გამო.

ვირუსული დნმ ასევე შეიძლება გამოვლინდეს PCR-ის გამოყენებით. პრაიმერები უნდა იყოს სპეციფიკური ვირუსული დნმ-ის მიმდევრებისთვის და PCR შეიძლება გამოყენებულ იქნას დნმ-ის დიაგნოსტიკური ტესტებისთვის ან ვირუსული გენომის თანმიმდევრობის დასადგენად. PCR-ის მაღალი მგრძნობელობა საშუალებას გაძლევთ გამოავლინოთ ვირუსები დაინფიცირებიდან მალევე და დაავადების დაწყებამდეც კი. ვირუსის ამ ადრეულმა აღმოჩენამ შეიძლება ექიმებს მნიშვნელოვანი მკურნალობის ვარიანტები მისცეს. ვირუსის რაოდენობა („ვირუსული დატვირთვა“) პაციენტში ასევე შეიძლება დადგინდეს PCR-ზე დაფუძნებული დნმ ტესტირების გამოყენებით.

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის ძირითადი მეთოდების ვარიაციები

• ალელური სპეციფიკური PCR: დიაგნოსტიკური ან კლონირების მეთოდი, რომელიც დაფუძნებულია ერთ ნუკლეოტიდულ პოლიმორფიზმებზე (SNPs) (განსხვავებები დნმ-ში ერთ ფუძეში). მოითხოვს წინასწარ ცოდნას დნმ-ის თანმიმდევრობის შესახებ, მათ შორის განსხვავებების შესახებ ალელებს შორის და იყენებს პრაიმერებს, რომელთა 3" ბოლოები მოიცავს SNP-ს. PCR გაძლიერება მკაცრ პირობებში გაცილებით ნაკლებად ეფექტურია შაბლონსა და პრაიმერს შორის შეუსაბამობის შემთხვევაში, ასე რომ, წარმატებული გაძლიერება SNP-ით. კონკრეტული პრაიმერის სიგნალები თანმიმდევრობით სპეციფიკური SNP-ების არსებობის შესახებ.
• PCR ასამბლეა ან პოლიმერაზული ციკლური შეკრება (PCR):გრძელი დნმ-ის თანმიმდევრობების ხელოვნური სინთეზი PCR-ის შესრულებით გრძელი ოლიგონუკლეოტიდების რეზერვზე მოკლე გადახურვის სეგმენტებით. ოლიგონუკლეოტიდები მონაცვლეობენ სენსორულ და ანტიმგრძნობიარე ჯაჭვის მიმართულებებს შორის და გადახურული სეგმენტები განსაზღვრავენ PCR ფრაგმენტების რიგს, რითაც შერჩევით წარმოიქმნება საბოლოო გრძელი დნმ-ის პროდუქტი.
• ასიმეტრიული PCR: უპირატესად აძლიერებს დნმ-ის ერთ ჯაჭვს ორჯაჭვიან დნმ-ის შაბლონში. გამოიყენება თანმიმდევრობისა და ჰიბრიდიზაციის ზონდირებაში, სადაც საჭიროა ორი დამატებითი ძაფიდან მხოლოდ ერთის გაძლიერება. PCR ტარდება ჩვეულებისამებრ, მაგრამ პრაიმერების დიდი სიჭარბით ძაფების გასაძლიერებლად. შემზღუდველი პრაიმერის გამოყენების შემდეგ რეაქციის ბოლოს ნელი (არითმეტიკული პროგრესიით) გაძლიერების გამო, საჭიროა დამატებითი PCR ციკლები. ამ პროცესის უახლესი მოდიფიკაცია, რომელიც ცნობილია როგორც "LATE-PCR" (წრფივიობა ექსპონენციალური ფაზის შემდეგ - PCR), იყენებს შეზღუდვის პრაიმერს უფრო მაღალი დნობის ტემპერატურით (Tm), ვიდრე ჭარბი პრაიმერი, რათა შეინარჩუნოს რეაქციის ეფექტურობა, როგორც შემზღუდველი პრაიმერის კონცენტრაცია. მცირდება რეაქციის შუა პერიოდში.
• Dial-out PCR: უაღრესად პარალელური მეთოდი გენის სინთეზისთვის ზუსტი დნმ-ის მოლეკულების მისაღებად. დნმ-ის მოლეკულების რთული აუზი მოდიფიცირებულია უნიკალური ფლანგური ტეგებით მასიურად პარალელური თანმიმდევრობის დაწყებამდე. ტეგზე მიმართული პრაიმერები შემდეგ წარმოქმნიან მოლეკულებს მოცემული თანმიმდევრობით PCR-ის გამოყენებით.
• ჰელიკაზაზე დამოკიდებული გაძლიერება:ტრადიციული PCR-ის მსგავსია, მაგრამ მოითხოვს მუდმივ ტემპერატურას, ვიდრე დენატურაციისა და ანეილირების/გაფართოების ციკლების მეშვეობით. სითბოს დენატურაციის ნაცვლად გამოიყენება დნმ ჰელიკაზა, ფერმენტი, რომელიც შლის დნმ-ს.
• ცხელი დაწყება PCR: ტექნიკა, რომელიც ამცირებს არასპეციფიკურ გაძლიერებას PCR საფეხურების საწყისი დაყენების დროს. შეიძლება გაკეთდეს ხელით რეაქციის კომპონენტების გაცხელებით დენატურაციის ტემპერატურამდე (მაგ. 95 °C) პოლიმერაზას დამატებამდე. შემუშავებულია სპეციალიზებული ფერმენტული სისტემები, რომლებიც თრგუნავენ პოლიმერაზას აქტივობას ოთახის ტემპერატურაზე, ან ანტისხეულების შებოჭვით ან კოვალენტურად შეკრული ინჰიბიტორების თანდასწრებით, რომლებიც იშლება მხოლოდ მაღალი ტემპერატურის აქტივაციის საფეხურის შემდეგ. „ცხელი დაწყება/ცივი დასრულება“ PCR მიიღწევა ახალი ჰიბრიდული პოლიმერაზების გამოყენებით, რომლებიც არააქტიურია გარემოს ტემპერატურაზე და დაუყოვნებლივ აქტიურდება დრეკადობის ტემპერატურაზე.
• მიკროსატელიტური თანმიმდევრობის სპეციფიკური PCR (ISSR): PCR არის დნმ-ის თითის ანაბეჭდის მეთოდი, რომელიც ზრდის რეგიონების ასლის რაოდენობას მარტივ განმეორებით თანმიმდევრობებს შორის, რათა შეიქმნას უნიკალური თითის ანაბეჭდი ფრაგმენტის გაძლიერებული სიგრძიდან.
• შებრუნებული PCRფართოდ გამოიყენება გენომური ჩანართების ირგვლივ თანმიმდევრობის რეგიონების დასადგენად. იგი მოიცავს დნმ-ის დაშლის და თვითლიგატების სერიას, რომლებიც წარმოქმნიან ცნობილ თანმიმდევრობებს უცნობი მიმდევრობის ორივე ბოლოში.
• ლიგაციის შუამავლობით PCR:იყენებს საინტერესო დნმ-თან დაკავშირებულ მცირე დნმ ლინკერებს და დნმ-ის ლინკერებთან დაკავშირებულ მრავალ პრაიმერს; გამოიყენება დნმ-ის თანმიმდევრობის, გენომის სიარულისა და დნმ-ის ნაკვალევისთვის.
• მეთილაციის სპეციფიკური PCR(MSP): შემუშავებული სტივენ ბეილინის და ჯიმ ჰერმანის მიერ ჯონს ჰოპკინსის მედიცინის სკოლაში, გამოიყენება გენომიურ დნმ-ში CpG კუნძულების მეთილაციის გამოსავლენად. დნმ პირველად მუშავდება ნატრიუმის ბისულფიტით, რომელიც გარდაქმნის არამეთილირებული ციტოზინის ფუძეებს ურაცილად, რომელიც PCR პრაიმერებით აღიარებულია თიმინად. ორი PCR შესრულებულია მოდიფიცირებულ დნმ-ზე იდენტური პრაიმერების ნაკრების გამოყენებით, გარდა ნებისმიერი CpG კუნძულისა პრაიმერის თანმიმდევრობის ფარგლებში. ამ წერტილებში, პრაიმერების ერთი კომპლექტი ამოიცნობს დნმ-ს ციტოზინებთან ერთად, რათა გაზარდოს მეთილირებული დნმ-ის ასლების რაოდენობა, ხოლო ერთი ნაკრები ამოიცნობს დნმ-ს ურაცილით ან თიმინით, რათა გააძლიეროს არამეთილირებული დნმ. MSP qPCR გამოყენებით ასევე შეიძლება შესრულდეს რაოდენობრივი და არა ხარისხობრივი მეთილაციის ინფორმაციის მისაღებად.
• მინიპრაიმერი - PCR:გამოიყენება თერმოსტაბილური პოლიმერაზები (S-Tbr), რომლებიც შეიძლება გაფართოვდეს მოკლე პრაიმერებიდან („სმალიგოები“), 9 ან 10 ნუკლეოტიდის რაოდენობით. ეს მეთოდი საშუალებას აძლევს PCR-ს მიმართოს უფრო მცირე პრაიმერებით შეკრულ რეგიონებს და გამოიყენება შენარჩუნებული დნმ-ის თანმიმდევრობების გასაძლიერებლად, როგორიცაა 16S (ან ევკარიოტული 18S) rRNA გენი.
• მულტიპლექს ლიგირებაზე დამოკიდებული ზონდის გაძლიერება (MLPA): საშუალებას იძლევა გაძლიერდეს მრავალი სამიზნე პრაიმერის მხოლოდ ერთი წყვილით, რითაც თავიდან აიცილებს მულტიპლექს PCR-ის გარჩევადობის შეზღუდვებს.
• Multiplex PCRშედგება პრაიმერების რამდენიმე კომპლექტისაგან ერთ PCR ნარევში, რათა გამოიმუშაოს სხვადასხვა ზომის ამპლიკონები, რომლებიც სპეციფიკურია დნმ-ის სხვადასხვა თანმიმდევრობისთვის. რამდენიმე გენის ერთდროულად დამიზნებით, შესაძლებელია დამატებითი ინფორმაციის მიღება ერთი ტესტის დროს, რომელიც სხვაგვარად რამდენჯერმე მეტ რეაგენტს და მეტ დროს მოითხოვს. პრაიმერის თითოეული ნაკრებისთვის ანეილირების ტემპერატურა უნდა იყოს ოპტიმიზირებული, რათა სწორად იმუშაოს ერთ რეაქციაში და ამპლიკონის ზომებით. ანუ, მათი ბაზის წყვილის სიგრძე უნდა იყოს საკმარისად განსხვავებული, რათა წარმოქმნას განსხვავებული ზოლები გელის ელექტროფორეზით ვიზუალიზაციისას.
• ჩადგმული PCR: ზრდის დნმ-ის გაძლიერების სპეციფიკას ფონის შემცირებით დნმ-ის არასპეციფიკური გაძლიერების გამო. პრაიმერების ორი კომპლექტი გამოიყენება ორ თანმიმდევრულ PCR-ში. პირველ რეაქციაში, პრაიმერის ერთი წყვილი გამოიყენება დნმ-ის პროდუქტების სინთეზირებისთვის, რომლებიც, გარდა მიზნობრივი სამიზნისა, შეიძლება კვლავ შედგებოდეს არასპეციფიკურად გაძლიერებული დნმ-ის ფრაგმენტებისგან. პროდუქტები შემდეგ გამოიყენება მეორე PCR-ში პრაიმერების ნაკრებით, რომელთა შეკავშირების ადგილები მთლიანად ან ნაწილობრივ განსხვავდება პირველ რეაქციაში გამოყენებული თითოეული პრაიმერის 3" ბოლოებისგან. Nested PCR ხშირად უფრო წარმატებულია დნმ-ის გრძელი ფრაგმენტების კონკრეტულად გაძლიერებაში. ვიდრე ტრადიციული PCR, მაგრამ ის მოითხოვს სამიზნე თანმიმდევრობის უფრო დეტალურ ცოდნას.
• PCR გადახურვის გაფართოებებითან შეერთება გაფართოებების გადაფარვით(SOE): გენეტიკური ინჟინერიის ტექნიკა, რომელიც გამოიყენება დნმ-ის ორი ან მეტი ნაწილის შესაერთებლად, რომლებიც შეიცავს დამატებით თანმიმდევრობებს. გამოიყენება გენების, მარეგულირებელი თანმიმდევრობების ან მუტაციების შემცველი დნმ-ის ნაწილების დასაკავშირებლად; ტექნიკა საშუალებას გაძლევთ შექმნათ კონკრეტული და გრძელი დნმ-ის სტრუქტურები.
• რაოდენობრივი PCR (qPCR):გამოიყენება PCR პროდუქტის რაოდენობის გასაზომად (ჩვეულებრივ რეალურ დროში). რაოდენობრივად ზომავს დნმ-ის, cDNA ან რნმ-ის საწყის რაოდენობას. qPCR ფართოდ გამოიყენება ნიმუშში დნმ-ის თანმიმდევრობის არსებობისა და ნიმუშში მისი ასლების რაოდენობის დასადგენად. რაოდენობრივ რეალურ დროში PCR-ს აქვს სიზუსტის ძალიან მაღალი ხარისხი. QRT-PCR (ან QF-PCR) მეთოდები იყენებენ ფლუორესცენტურ საღებავებს, როგორიცაა Sybr Green, EvaGreen, ან ფტორფორის შემცველი დნმ-ის ზონდები, როგორიცაა TaqMan, გაძლიერებული პროდუქტის ოდენობის რეალურ დროში გასაზომად. ზოგჯერ მოიხსენიება აბრევიატურით RT-PCR (რეალურ დროში PCR) ან RQ-PCR. QRT-PCR ან RTQ-PCR უფრო შესაფერისი აბრევიატურებია, რადგან RT-PCR ჩვეულებრივ ეხება საპირისპირო ტრანსკრიფციის PCR-ს, რომელიც ხშირად გამოიყენება qPCR-თან ერთად.
• საპირისპირო ტრანსკრიფციის PCR (RT-PCR):რნმ-დან დნმ-ის ასლების რაოდენობის გაზრდა. საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა ახდენს რნმ-ის ტრანსკრიფციას cDNA-ში, რომელიც შემდეგ ძლიერდება PCR-ის გამოყენებით. RT-PCR ფართოდ გამოიყენება ექსპრესიის პროფილირებაში გენის ექსპრესიის გამოსავლენად ან რნმ-ის ტრანსკრიპტის თანმიმდევრობის დასადგენად, ტრანსკრიპციის დაწყებისა და შეწყვეტის ადგილების ჩათვლით. თუ ცნობილია გენის გენომიური დნმ-ის თანმიმდევრობა, RT-PCR შეიძლება გამოყენებულ იქნას გენში ეგზონებისა და ინტრონების მდებარეობის გამოსათვლელად. გენის 5" ბოლო (შეესაბამება ტრანსკრიფციის დაწყების ადგილს) ჩვეულებრივ განისაზღვრება RACE-PCR (cDNA ბოლოების სწრაფი გაძლიერება).
• მყარი ფაზის PCR: მოიცავს რამდენიმე მნიშვნელობას, მათ შორის "პოლონიუმის გაძლიერება" (როდესაც კოლონიური PCR ტარდება გელის მატრიცაზე, მაგალითად), "ხიდის PCR" (პრაიმერები კოვალენტურად არის დაკავშირებული მყარ საყრდენ ზედაპირთან), ტრადიციული მყარი ფაზის PCR (სადაც "ასიმეტრიული PCR გამოიყენება პრაიმერების თანდასწრებით, რომლებსაც აქვთ მყარი საყრდენი, თანმიმდევრობით, რომელიც შეესაბამება ერთ-ერთ წყალხსნარულ პრაიმერს), და გაძლიერებული მყარი ფაზის PCR (სადაც ტრადიციული მყარი ფაზის PCR შეიძლება გაუმჯობესდეს მაღალი Tm და ჩასმული მყარი საყრდენი პრაიმერების გამოყენებით. თერმული "ნაბიჯის" გამოყენების ვარიანტი, რათა ხელი შეუწყოს მყარი საყრდენი პრაიმერების წარმოქმნას).
• თერმული ასიმეტრიული ალტერნატიული PCR (TAIL-PCR):გამოიყენება უცნობი მიმდევრობის იზოლირებისთვის ცნობილი მიმდევრობის შემდეგ. ცნობილი თანმიმდევრობით, TAIL-PCR იყენებს პრაიმერების ბუდებულ წყვილს სხვადასხვა ანეილირების ტემპერატურის მქონე; დეგენერირებული პრაიმერი გამოიყენება უცნობი თანმიმდევრობისგან განსხვავებული მიმართულებით გასაძლიერებლად.
• Touchdown PCR (ნაბიჯ-ნაბიჯ PCR): PCR-ის ვარიანტი, რომელიც მიზნად ისახავს არასპეციფიკური ფონის შემცირებას ანეილირების ტემპერატურის თანდათანობით შემცირებით PCR ციკლების პროგრესირებასთან ერთად. დადუღების ტემპერატურა საწყის ციკლებზე, როგორც წესი, რამდენიმე გრადუსით (3-5°C) აღემატება გამოყენებული პრაიმერების Tm-ს, ხოლო შემდგომ ციკლებზე ტემპერატურა რამდენიმე გრადუსით (3-5°C) არის პრაიმერების Tm-ზე დაბალი. უფრო მაღალი ტემპერატურა უზრუნველყოფს პრაიმერის შეკვრის მეტ სპეციფიკურობას, ხოლო დაბალი ტემპერატურა იძლევა უფრო ეფექტურ გაძლიერებას საწყისი ციკლების დროს წარმოქმნილი კონკრეტული პროდუქტებისგან.
• PAN-AC: იყენებს იზოთერმულ პირობებს ამპლიფიკაციისთვის და შეიძლება გამოყენებულ იქნას ცოცხალ უჯრედებზე.
• უნივერსალური სწრაფი გავლა გენომში: გენომის სიარულისთვის და გენეტიკური თითის ანაბეჭდისთვის უფრო სპეციფიკური "ორმხრივი" PCR-ების გამოყენებით, ვიდრე ტრადიციული "ცალმხრივი" მიდგომები (მხოლოდ ერთი გენის სპეციფიკური პრაიმერის და ერთი ზოგადი პრაიმერის გამოყენება - რამაც შეიძლება გამოიწვიოს ხელოვნური "ხმაური") მექანიზმის გამო. , მათ შორის ლასო სტრუქტურის ფორმირება. UFW-ის გამარტივებული წარმოებულებია "Lane RAGE" (ლასოზე დამოკიდებული წყობილი PCR გენომიური დნმ-ის ბოლოების სწრაფი გაძლიერებისთვის), "5"RACE Lane" და "3"RACE Lane.
• InსილიციუმიPCR(ციფრული PCR, ვირტუალური PCR, e-PCR, e-PCR) ეხება გამოთვლით ინსტრუმენტებს, რომლებიც გამოიყენება თეორიული პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის შედეგების გამოსათვლელად, პრაიმერების (ზონდების) მოცემული ნაკრების გამოყენებით, რათა გააძლიერონ დნმ-ის თანმიმდევრობები თანმიმდევრული გენომიდან ან ტრანსკრიპტომიდან.

PCR-ის ისტორია

1971 წელს მოლეკულური ბიოლოგიის ჟურნალის სტატიაში კლეპე და მისი თანაავტორები პირველად აღწერდნენ მეთოდს ფერმენტული ანალიზის გამოყენებით მოკლე დნმ-ის შაბლონის პრაიმერებით ინ ვიტრო რეპლიკაციისთვის. თუმცა, PCR-ის ძირითადი პრინციპის ამ ადრეულ გამოვლინებას დიდი ყურადღება არ მიუქცევია და 1983 წელს პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის გამოგონება, ზოგადად, კარი მულისს მიეკუთვნება.

როდესაც მაულისმა 1983 წელს PCR შეიმუშავა, ის მუშაობდა ემერივილში, კალიფორნიაში, ადრეული ბიოტექნოლოგიური კომპანიის Cetus Corporation-ისთვის. იქ ის იყო პასუხისმგებელი დნმ-ის მოკლე ჯაჭვების სინთეზზე. მალისმა დაწერა, რომ მას PCR-ის იდეა გაუჩნდა წყნარი ოკეანის სანაპირო გზატკეცილის გასწვრივ ტარებისას ერთ ღამეს თავის მანქანაში. ის თავის გონებაში იმეორებდა დნმ-ში ცვლილებების (მუტაციების) ანალიზის ახალ გზას, როდესაც მიხვდა, რომ ამის ნაცვლად გამოიგონა მეთოდი დნმ-ის ნებისმიერი ნაწილის ასლების რაოდენობის გაზრდის დნმ-პოლიმერაზას მიერ განხორციელებული დუბლირების განმეორებითი ციკლების მეშვეობით. Scientific American-ში მალისმა შეაჯამა პროცედურა: „დნმ-ის გენეტიკური მასალის ერთი მოლეკულით დაწყებული, PCR-ს შეუძლია 100 მილიარდი ასეთი მოლეკულის გამომუშავება ერთ დღეში. ეს რეაქცია მარტივი შესასრულებელია. მას არაუმეტეს საცდელი მილი, რამდენიმე მარტივი რეაგენტი და სითბოს წყარო სჭირდება“. მას მიენიჭა ნობელის პრემია ქიმიაში 1993 წელს თავისი გამოგონებისთვის, შვიდი წლის შემდეგ, რაც მან და მისმა კოლეგებმა Cetus-ში პირველად განახორციელეს მისი წინადადება პრაქტიკაში. თუმცა, გარკვეული დაპირისპირება დარჩა სხვა მეცნიერების ინტელექტუალური და პრაქტიკული წვლილის შესახებ მალისის მუშაობაში და იყო თუ არა ის PCR პრინციპის ერთადერთი გამომგონებელი.

PCR მეთოდი ეყრდნობა შესაფერისი დნმ პოლიმერაზას გამოყენებას, რომელსაც შეუძლია გაუძლოს მაღალ ტემპერატურას >90°C (194°F), რომელიც საჭიროა დნმ-ის ორი ჯაჭვის გაყოფისთვის დნმ-ის ორმაგ სპირალში ყოველი რეპლიკაციის ციკლის შემდეგ. დნმ-პოლიმერაზები, რომლებიც თავდაპირველად გამოიყენებოდა ინ ვიტრო ექსპერიმენტებისთვის, რომლებიც ასახავდა PCR-ს, ვერ გაუძლებდნენ ასეთ მაღალ ტემპერატურას. ამიტომ, ადრეული დნმ-ის რეპლიკაციის პროცედურები იყო ძალიან არაეფექტური და შრომატევადი, რაც მოითხოვდა დიდი რაოდენობით დნმ პოლიმერაზას და უწყვეტ დამუშავებას მთელი პროცესის განმავლობაში.

1976 წელს აღმოაჩინა Taq პოლიმერაზა, დნმ პოლიმერაზა, რომელიც იზოლირებულია თერმოფილური ბაქტერიისგან, თერმუსიაკვატიკუსი, რომელიც ბუნებრივად ცხოვრობს ცხელ (50-დან 80°C (122-დან 176°F)) გარემოში, როგორიცაა ცხელი წყაროები - გზა გაუხსნა PCR მეთოდის მკვეთრ გაუმჯობესებას. დნმ პოლიმერაზა გამოყოფილია თ.აკვატიკუსი, სტაბილურია მაღალ ტემპერატურაზე და აქტიური რჩება დნმ-ის დენატურაციის შემდეგაც, რითაც გამორიცხავს ახალი დნმ პოლიმერაზების დამატების საჭიროებას ყოველი ციკლის შემდეგ. ამან შესაძლებელი გახადა თერმოციკლერის გამაძლიერებლის საფუძველზე დნმ-ის გაძლიერების პროცესის ავტომატიზაცია.

საპატენტო ომები

შემოთავაზებული PCR მეთოდი დაპატენტებულია Cary Mullis-ის მიერ და მიეკუთვნება Cetus Corporation-ს, სადაც Mullis მუშაობდა, როდესაც მან გამოიგონა ტექნიკა 1983 წელს. ფერმენტ Taq პოლიმერაზა ასევე დაცული იყო პატენტებით. ტექნიკასთან დაკავშირებული იყო რამდენიმე გახმაურებული სარჩელი, მათ შორის DuPont-ის წარუმატებელი სარჩელი. ფარმაცევტულმა კომპანიამ Hoffmann-La Roche-მ პატენტების უფლებები 1992 წელს შეიძინა და ამჟამად ფლობს პატენტებს, რომლებიც ჯერ კიდევ დაცულია.

მსგავსი საპატენტო ბრძოლა Taq პოლიმერაზას ფერმენტთან დაკავშირებით ჯერ კიდევ მიმდინარეობს მსოფლიოს ზოგიერთ იურისდიქციაში Roche-სა და Promega-ს შორის. სამართლებრივი არგუმენტები გასცდა ორიგინალური PCR და Taq პოლიმერაზას პატენტების პირობებს, რომელთა ვადა ამოიწურა 2005 წლის 28 მარტს.

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR) არის მაღალი სიზუსტის მეთოდი მემკვიდრეობითი პათოლოგიების, ინფექციების, ვირუსული დაავადებების დიაგნოსტიკის სფეროში ნებისმიერ ეტაპზე (მწვავე ან ქრონიკული), ასევე - ადრეულ ეტაპზე - დაავადების აშკარა გამოვლინებამდე იდენტიფიცირების გზით. პათოგენები, რომლებიც დაფუძნებულია მათ დნმ-ზე, რნმ-ზე, რომელიც წარმოადგენს გენეტიკურ მასალას, პაციენტისგან მიღებულ ნიმუშებში. დღეს კი ვისაუბრებთ პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (PCR) მეთოდების არსზე, დიაგნოსტიკურ ეტაპებზე და პრინციპებზე, ასევე მის ღირებულებაზე.

რა არის პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია

ანალიზის საფუძველია გაძლიერება (გაორმაგება) - მრავალი ასლის შექმნა დნმ-ის მოკლე მონაკვეთიდან (დეოქსირიბონუკლეინის მჟავა), რომელიც წარმოადგენს ადამიანის გენეტიკურ კომპლექსს. კვლევა მოითხოვს ფიზიოლოგიური ნივთიერების ძალიან მცირე რაოდენობას (ნახველი, განავალი, ეპითელიუმის ნაკაწრები, პროსტატის წვენი, სისხლი, სპერმა, ამნიონური სითხე, ლორწო, პლაცენტის ქსოვილი, შარდი, ნერწყვი, პლევრის სითხე, ცერებროსპინალური სითხე). ამ შემთხვევაში, მაგალითად, ერთი მავნე მიკრობიც კი შეიძლება გამოვლინდეს პაციენტის სასქესო ტრაქტში.

PCR (პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია) ტექნიკა შეიმუშავა ამერიკელმა მეცნიერმა კ.მალისმა, რომელმაც მიიღო ნობელის პრემია 1993 წელს.

აქტიურად გამოიყენება:

• ინფექციების ადრეულ დიაგნოზში, გენეტიკური;
• სასამართლო-სამედიცინო ექსპერტიზაში, როდესაც გამოკვლევისთვის ხელმისაწვდომია დნმ-ის უკიდურესად მცირე რაოდენობა;
• ვეტერინარულ მედიცინაში, ფარმაცევტიკაში, ბიოლოგიაში, მოლეკულურ გენეტიკაში;
• პირის დნმ-ით იდენტიფიკაციისთვის, მამობის დადასტურებისთვის;
• პალეონტოლოგიაში, ანთროპოლოგიაში, ეკოლოგიაში (პროდუქციის ხარისხის მონიტორინგისას, გარემო ფაქტორები).

ეს ვიდეო დეტალურად გეტყვით რა არის პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია:

ვისთვის არის დანიშნული?

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია ინფექციური დაავადებების დიაგნოსტიკაში განსაკუთრებული სიზუსტისა და სანდოობის ერთ-ერთი ყველაზე საიმედო მეთოდია. მაგალითად, ქლამიდიის და მრავალი სხვა პათოგენის PCR ანალიზის სანდოობა 100%-ს (აბსოლუტურს) უახლოვდება. ყველაზე ხშირად პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის პროცედურას უნიშნავენ პაციენტებს, რომლებსაც დიაგნოზის დროს უჭირთ კონკრეტული პათოგენის იდენტიფიცირება.

ლაბორატორიული PCR ტესტი გამოიყენება:

• გამოავლინოს პათოგენები, რომლებიც იწვევენ საშარდე და სასქესო ორგანოების ინფექციებს, რომელთა იდენტიფიცირება რთულია კულტურის ან იმუნოლოგიური მეთოდების გამოყენებით;
• საწყის ეტაპზე აივ-ის ხელახალი დიაგნოსტიკისთვის თავდაპირველი ტესტის დადებითი, მაგრამ საეჭვო შედეგის შემთხვევაში (მაგალითად, შიდსით ინფიცირებული მშობლების ახალშობილებში);
• კიბოს ადრეულ სტადიაზე იდენტიფიცირება (ონკოგენური მუტაციების შესწავლა) და ინდივიდუალური პაციენტის მკურნალობის რეჟიმის ინდივიდუალური კორექტირება;
• მემკვიდრეობითი პათოლოგიების ადრეული გამოვლენისა და პოტენციური მკურნალობის მიზნით.

ამრიგად, მომავალი მშობლები ატარებენ ტესტს იმის გასარკვევად, არიან თუ არა ისინი გენეტიკური პათოლოგიის მატარებლები, ბავშვებში PCR განსაზღვრავს მემკვიდრეობით გადამდები დაავადების ზემოქმედების ალბათობას.

• ნაყოფის პათოლოგიების გამოსავლენად გესტაციის ადრეულ ეტაპებზე (მზარდი ემბრიონის ცალკეული უჯრედები გამოკვლეულია შესაძლო მუტაციების არსებობისთვის);
• პაციენტებში ორგანოს ტრანსპლანტაციამდე - "ქსოვილის ტიპაჟისთვის" (ქსოვილოვანი თავსებადობის განსაზღვრა);
• დონორის სისხლში საშიში პათოგენური ორგანიზმების იდენტიფიცირება;
• ახალშობილებში - ფარული ინფექციების იდენტიფიცირება;
• ანტივირუსული და ანტიმიკრობული მკურნალობის შედეგების შესაფასებლად.

რატომ გაიარეთ ასეთი პროცედურა?

ვინაიდან PCR არის უაღრესად ეფექტური დიაგნოსტიკური მეთოდი, რომელიც იძლევა თითქმის 100% შედეგს, პროცედურა გამოიყენება:

• საბოლოო დიაგნოზის დადასტურება ან გამორიცხვა;
• თერაპიის ეფექტურობის სწრაფი შეფასება.

ხშირ შემთხვევაში, PCR არის ერთადერთი შესაძლო ტესტი განვითარებადი დაავადების გამოსავლენად, თუ სხვა ბაქტერიოლოგიური, იმუნოლოგიური და ვირუსოლოგიური დიაგნოსტიკური მეთოდები უსარგებლოა.

• ვირუსების გამოვლენა ხდება PCR პროცედურის გამოყენებით ინფექციის შემდეგ დაუყოვნებლივ და დაავადების ნიშნების გამოვლენამდე. ვირუსის ადრეული გამოვლენა საშუალებას იძლევა დროული მკურნალობა.
• ეგრეთ წოდებული „ვირუსული დატვირთვა“ (ან ვირუსების რაოდენობა ორგანიზმში) ასევე განისაზღვრება დნმ-ის ანალიზით რაოდენობრივი მეთოდით.
• სპეციფიკური პათოგენები (მაგ., კოხის ტუბერკულოზის ბაცილი) რთულია და დამუშავებას ძალიან დიდი დრო სჭირდება. PCR ტესტირება საშუალებას იძლევა სწრაფად აღმოაჩინოს მინიმალური პათოგენები (ცოცხალი და მკვდარი) ტესტირებისთვის ხელსაყრელ ნიმუშებში.

პათოგენის დნმ-ის დეტალური ანალიზი გამოიყენება:

• განსაზღვროს მისი მგრძნობელობა კონკრეტული ტიპის ანტიბიოტიკების მიმართ, რაც დაუყოვნებელი მკურნალობის საშუალებას იძლევა;
• შინაურ და გარეულ ცხოველებს შორის ეპიდემიის გავრცელების კონტროლი;
• ახალი ინფექციური მიკრობული სახეობებისა და პათოგენების ქვეტიპების იდენტიფიცირება და თვალყურის დევნება, რომლებმაც გამოიწვია წინა ეპიდემიები.

დიაგნოსტიკის სახეები

სტანდარტული მეთოდი

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის ანალიზი ტარდება დნმ-ისა და რნმ-ის კონკრეტული ფრაგმენტის მრავალჯერადი გაძლიერების (გაორმაგების) საფუძველზე სპეციალური პრაიმერის ფერმენტების გამოყენებით. კოპირების ჯაჭვის შედეგად მიიღება საკმარისი რაოდენობის მასალა კვლევისთვის.

პროცედურის დროს კოპირდება მხოლოდ სასურველი ფრაგმენტი (რომელიც შეესაბამება მითითებულ სპეციფიკურ პირობებს) და თუ ის რეალურად იმყოფება ნიმუშში.

ეს დეტალური ვიდეო სასარგებლო დიაგრამებით განმარტავს, თუ როგორ მუშაობს PCR:

სხვა მეთოდები

• რეალურ დროში PCR. ამ ტიპის კვლევაში მოცემული დნმ-ის ფრაგმენტის იდენტიფიცირების პროცესი იწყება ყოველი ციკლის შემდეგ და არა მთელი ჯაჭვის 30-40 ციკლის დასრულების შემდეგ. ამ ტიპის კვლევა საშუალებას გაძლევთ მიიღოთ ინფორმაცია ორგანიზმში პათოგენის (ვირუსის ან მიკრობის) რაოდენობის შესახებ, ანუ ჩაატაროთ რაოდენობრივი ანალიზი.
• RT-PCR (უკუ ტრანსკრიფციის რეჟიმი). ეს ტესტი გამოიყენება ერთჯაჭვიანი რნმ-ის მოსაძებნად ვირუსების გამოსავლენად, რომელთა გენეტიკური ბაზაა რნმ (მაგალითად, C ჰეპატიტის ვირუსი, იმუნოდეფიციტის ვირუსი). ამ კვლევაში გამოყენებულია სპეციალური ფერმენტი - საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა და სპეციფიკური პრაიმერი, ხოლო რნმ-ის ბაზაზე აგებულია ერთჯაჭვიანი დნმ. შემდეგ დნმ-ის მეორე ჯაჭვი ამოღებულია ამ ჯაჭვიდან და ტარდება სტანდარტული პროცედურა.

ჩვენებები ტესტირებისთვის

PCR პროცედურა გამოიყენება ინფექციურ დაავადებათა, ნეონატოლოგიაში, მეანობაში, პედიატრიაში, უროლოგიაში, გინეკოლოგიაში, ვენეროლოგიაში, ნევროლოგიაში, ნეფროლოგიასა და ოფთალმოლოგიაში.

ჩვენებები ტესტირებისთვის:

• მემკვიდრეობითი პათოლოგიების ალბათობით ბავშვში გენეტიკური დარღვევების განვითარების რისკის განსაზღვრა;
• ორსულობის დაგეგმვისას ორივე მშობლის დიაგნოსტიკა ან მიმდინარე ორსულობის დროს დედის მძიმე მდგომარეობა;
• ჩასახვის სირთულეები, უნაყოფობის მიზეზების იდენტიფიცირება;
• სქესობრივი გზით გადამდები ინფექციების ეჭვი მწვავე სტადიაში და მათი ქრონიკულზე გადასვლის სიმპტომებით;
• უცნობი წარმოშობის ანთებითი პროცესების მიზეზების გამოვლენა;
• დაუცველი შემთხვევითი და რეგულარული სექსუალური კონტაქტები;
• პათოგენური მიკროორგანიზმის მგრძნობელობის განსაზღვრა კონკრეტული ანტიბიოტიკების მიმართ;
• პაციენტები ეჭვმიტანილი ლატენტური ინფექციით, რათა აღმოაჩინონ პათოგენები აშკარა სიმპტომების განვითარებამდე (პრეკლინიკური დიაგნოზი);
• პაციენტები ავადმყოფობის შემდეგ გამოჯანმრთელების დასადასტურებლად (რეტროსპექტული დიაგნოზი);

დიაგნოსტიკა ასევე გამოიყენება, თუ აუცილებელია შემდეგი პათოგენების ზუსტი იდენტიფიცირება:

• ჰეპატიტის ვირუსები (A B C G), ადამიანის იმუნოდეფიციტი, ციტომეგალოვირუსი;
• ვიბრიო ქოლერა;
• ჰერპეს სიმპლექსის ვირუსი, ჰერპეტიფორმული სახეობა;
• რეტრო - ადენო - და რინოვირუსები;
• წითურას, ეპშტეინ-ბარის, ვარიცელას (ზოსტერის) ვირუსები;
• პარვო და პიკორნოვირუსები;
• ბაქტერია Helicobacter pylori;
• ლეგიონელა, Escherichia coli-ს პათოგენური ტიპები;
• Სტაფილოკოკის ბაქტერია;
• პათოგენი;
• კლოსტრიდია, დიფტერია და ჰემოფილუს გრიპი;

იგი ასევე გამოიყენება ინფექციების დასადგენად:

• ინფექციური მონონუკლეოზი;
• ბორელიოზი, ლისტერიოზი, ტკიპებით გამოწვეული ენცეფალიტი;
• Candida სოკოებით გამოწვეული კანდიდოზი;
• სქესობრივი გზით გადამდები ინფექციები - ტრიქომონიაზი, ურეთაპლაზმოზი, ფერმკრთალი ტრეპონემა, გარდნერელოზი, გონორეა, მიკოპლაზმოზი, ქლამიდია;
• ტუბერკულოზი.

უკუჩვენებები

ვინაიდან პროცედურა არ ტარდება პაციენტთან, სხეულზე რაიმე ზემოქმედების გარეშე, არამედ კვლევისთვის აღებული ბიოლოგიური მასალით, პოტენციური საფრთხის არარსებობის გამო PCR-ზე უკუჩვენებები არ არსებობს.

თუმცა, კოლპოსკოპიის პროცედურის შემდეგ ბიომასალა არ გროვდება საშვილოსნოს ყელის არხიდან. ნაცხისა და ნაცხის წარდგენა ანალიზისთვის დასაშვებია მხოლოდ მენსტრუაციის დასრულებიდან 4-6 დღის შემდეგ და გამონადენის სრული შეწყვეტიდან.

მეთოდი უსაფრთხოა?

შეუძლებელია პაციენტზე ნეგატიური ზემოქმედება ლაბორატორიაში მისი ბიომასალის იზოლირებული შესწავლის დროს.

პროცედურისთვის მომზადება (ბიოლოგიური ნივთიერებების ანალიზისთვის წარდგენა)

ნებისმიერი ბიოლოგიური სითხე, ქსოვილი ან სხეულის სეკრეცია არის ნიმუში PCR ანალიზისთვის, რომელიც აღმოაჩენს უცხო პათოგენის დნმ-ს. საცდელი ნივთიერება მიიღება ვენიდან სისხლის აღების, ხორხიდან, ცხვირის ღრუდან, ურეთრიდან, პლევრის ღრუდან, საშვილოსნოს ყელის ამოღების სახით.

დიაგნოსტიკური პროცედურის დაწყებამდე ექიმი პაციენტს უხსნის რა მასალას შეაგროვებს:

1. სქესობრივი გზით გადამდები ინფექციების გამოკვლევისას გროვდება სასქესო ორგანოებიდან გამონადენი, შარდი და ნაცხი ურეთრიდან.
2. ჰერპესული ინფექციების ანალიზისას, ციტომეგალოვირუსის, მონონუკლეოზის, შარდისა და ყელის ნაცხის აღება ხდება ანალიზისთვის, ჰეპატიტის, ტოქსოპლაზმოზის დროს - ვენიდან სისხლი.
3. სხვადასხვა ტიპის დიაგნოსტიკის მიზნით გროვდება ცერებროსპინალური სითხე.
4. პულმონოლოგიაში ანალიზისთვის ნიმუშებია ნახველი და პლევრის სითხე.
5. ორსულობის დროს შესაძლო ინტრაუტერიული ინფექციების კვლევის ჩატარებისას, ანალიზისთვის გამოიყენება ამნიონური სითხე და პლაცენტის უჯრედები.

ანალიზის სანდოობა და სიზუსტე დამოკიდებულია მასალის მიღებისას პირობების სტერილურობაზე. ვინაიდან PCR ტესტირება ძალიან მგრძნობიარეა, ტესტის ნივთიერების ნებისმიერმა დაბინძურებამ შეიძლება გამოიწვიოს შედეგის დამახინჯება.

ბიომასალის მიწოდებისთვის კომპეტენტური მომზადება არ წარმოადგენს რაიმე სირთულეს პაციენტებისთვის. არსებობს გარკვეული რეკომენდაციები:

• სქესობრივი გზით გადამდები ინფექციების ანალიზისას:
  • გამორიცხეთ ინტიმური კონტაქტები მასალის გაგზავნამდე 72 საათით ადრე;
  • შეწყვიტე ვაგინალური პროდუქტების გამოყენება 3 დღით ადრე;
  • წინა დღის საღამოდან არ განახორციელოთ შესამოწმებელი ტერიტორიის ჰიგიენა;
  • გამორიცხეთ შარდვა ურეთრიდან ნიმუშის აღებამდე 3-4 საათით ადრე;
• შეწყვიტეთ ანტიბიოტიკების მიღება ინფექციებზე ტესტირებამდე ერთი თვით ადრე;
• სისხლს აბარებენ დილით ჭამამდე და დალევამდე;
• პირველი დილის შარდის ნიმუში გროვდება სტერილურ კონტეინერში საფუძვლიანი ინტიმური ტუალეტის შემდეგ.

წაიკითხეთ ქვემოთ იმის შესახებ, თუ როგორ ტარდება დიაგნოსტიკა პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის მეთოდის გამოყენებით.

როგორ მუშაობს პროცედურა?

PCR კვლევის ჩატარებისას, გარკვეული ციკლები მეორდება რეაქტორში (გამაძლიერებელი ან თერმოციკლერი):

1. პირველი ნაბიჯი არის დენატურაცია. ნერწყვი, სისხლი, ბიოფსიის მასალა, გინეკოლოგიური ნიმუშები, ნახველი, რომლებშიც საეჭვოა პათოგენის დნმ (ან რნმ) არსებობა, მოთავსებულია გამაძლიერებელში, სადაც მასალა თბება და დნმ იყოფა ორ ცალკეულ ჯაჭვად.
2. მეორე ნაბიჯი არის მასალის ანილირება ან ოდნავ გაგრილებადა მასში პრაიმერების დამატება, რომლებსაც შეუძლიათ დნმ-ის მოლეკულაში სასურველი უბნების ამოცნობა და მათთან დაკავშირება.
3. მესამე ნაბიჯი არის დრეკადობა- ხდება მას შემდეგ, რაც 2 პრაიმერი მიმაგრებულია დნმ-ის თითოეულ ჯაჭვზე. პროცესის დროს სრულდება პათოგენის დნმ-ის ფრაგმენტი და იქმნება მისი ასლი.

ეს ციკლები მეორდება, როგორც „ჯაჭვური რეაქცია“, ყოველ ჯერზე იწვევს დნმ-ის კონკრეტული ფრაგმენტის ასლების გაორმაგებას (მაგალითად, სეგმენტი, სადაც კონკრეტული ვირუსი დაპროგრამებულია). რამდენიმე საათში იქმნება დნმ-ის ფრაგმენტის მრავალი ასლი და აღმოჩენილია მათი არსებობა ნიმუშში. ამის შემდეგ ხდება შედეგების ანალიზი და შედარება სხვადასხვა ტიპის პათოგენების მონაცემთა ბაზის მონაცემებთან ინფექციის ტიპის დასადგენად.

წაიკითხეთ ქვემოთ PCR რეაქციის საფუძველზე შედეგების გაშიფვრისა და დასკვნის შესახებ.

შედეგების გაშიფვრა

კვლევის საბოლოო შედეგი გაიცემა ბიოლოგიური მასალის წარდგენიდან 1 – 2 დღეში. ხშირად - ანალიზის შემდეგ უკვე პირველ დღეს.

თვისებრივი ანალიზი

• უარყოფითიშედეგი ნიშნავს, რომ ტესტირებისთვის წარდგენილ ნივთიერებაში არ აღმოჩნდა ინფექციური აგენტის კვალი.
• პოზიტიურიშედეგი ნიშნავს პათოგენური ვირუსების ან ბაქტერიების აღმოჩენას ბიოლოგიურ ნიმუშში მასალის წარდგენის დროს ძალიან მაღალი სიზუსტით.

თუ შედეგი დადებითია, მაგრამ ინფექციის გაზრდის ნიშნები არ არის გამოვლენილი, სხეულის ამ მდგომარეობას უსიმპტომო "ჯანსაღი ვაგონი" ეწოდება. ყველაზე ხშირად შეინიშნება ბიომასალის გარკვეული ადგილიდან (საშვილოსნოს ყელის არხი, ურეთრა, პირის ღრუ) აღებისას ვირუსული დაავადებების დროს. ამ შემთხვევაში მკურნალობა არ არის საჭირო, მაგრამ საჭიროა მუდმივი სამედიცინო ზედამხედველობა, ვინაიდან არსებობს შესაძლებლობა:

• ვირუსის გავრცელება მატარებლებისგან და ჯანმრთელი ადამიანების ინფექცია;
• პროცესის გააქტიურება და დაავადების ქრონიკულ ფორმაში გადასვლა.

თუმცა, თუ სისხლის ტესტი დადებითია, ეს მიუთითებს იმაზე, რომ ინფექციამ დაარტყა სხეულს და ეს აღარ არის გადამზიდავი მდგომარეობა, არამედ პათოლოგია, რომელიც საჭიროებს დაუყოვნებელ სპეციფიკურ თერაპიას.

Რაოდენობრივი ანალიზი

რაოდენობრივ შედეგს განსაზღვრავს სპეციალისტი სპეციალურად კონკრეტული ტიპის ინფექციისთვის. მასზე დაყრდნობით შესაძლებელია შეფასდეს დაავადების განვითარების ხარისხი და სტადია, რაც შესაძლებელს ხდის დროულად დანიშნოს სწორი მკურნალობა.

საშუალო ფასი

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის ფასებს განსაზღვრავს: კვლევის ტიპი, გამომწვევის იდენტიფიცირების სირთულე, ბიოლოგიური მასალის შეგროვების სირთულე, ანალიზის ტიპი (ხარისხობრივი ან რაოდენობრივი) და ლაბორატორიული ფასის დონე.

მეორეს მხრივ, PCR-ის შესწავლისას შესაძლებელია ერთდროულად რამდენიმე პათოგენის იდენტიფიცირება ანალიზისთვის ერთი ტიპის მასალის შეგროვებისას. ეს საშუალებას გაძლევთ დაზოგოთ სხვა ლაბორატორიული ტესტები.

PCR ანალიზის სავარაუდო ღირებულება რუბლებში:

• გონოკოკი, გარდნერელა, ტრიქომონას ვაგინალისი – 180-დან
• chlamydia trachomatis – 190-დან
• პაპილომავირუსი - 380-დან 500-მდე
• ქალებში უროგენიტალური ტრაქტის ბიოცენოზი (მიკროფლორას რაოდენობრივი და ხარისხობრივი შეფასება) – 800-დან.

კიდევ უფრო სასარგებლო ინფორმაცია PCR ტესტირებასთან დაკავშირებით მოცემულია ქვემოთ მოცემულ ვიდეოში:

მიიღო ნობელის პრემია.

მეთოდის დასაწყისში, ყოველი გათბობა-გაგრილების ციკლის შემდეგ, საჭირო იყო რეაქციულ ნარევში დნმ პოლიმერაზას დამატება, რადგან ის ინაქტივირებული იყო მაღალ ტემპერატურაზე, რომელიც საჭიროა დნმ-ის სპირალის ჯაჭვების გამოყოფისთვის. რეაქციის პროცედურა შედარებით არაეფექტური იყო და დიდ დროს და ფერმენტს მოითხოვდა. 1986 წელს მნიშვნელოვნად გაუმჯობესდა პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის მეთოდი. შემოთავაზებულია თერმოფილური ბაქტერიების დნმ პოლიმერაზების გამოყენება. ეს ფერმენტები აღმოჩნდა თერმოსტაბილური და შეძლეს გაუძლოს მრავალი რეაქციის ციკლს. მათმა გამოყენებამ შესაძლებელი გახადა PCR-ის გამარტივება და ავტომატიზაცია. ერთ-ერთი პირველი თერმოსტაბილური დნმ პოლიმერაზა იზოლირებული იყო ბაქტერიებისგან თერმუს აკვატიკუსიდა დაასახელა ტაქ- პოლიმერაზა. ამ პოლიმერაზას მინუსი ის არის, რომ მცდარი ნუკლეოტიდის შეყვანის ალბათობა საკმაოდ მაღალია, ვინაიდან ამ ფერმენტს არ გააჩნია შეცდომების კორექტირების მექანიზმები (3"→5" ეგზონუკლეაზას აქტივობა). პოლიმერაზები პფუდა Pwoარქეებისგან იზოლირებულებს აქვთ ასეთი მექანიზმი, მათი გამოყენება მნიშვნელოვნად ამცირებს დნმ-ში მუტაციების რაოდენობას, მაგრამ მათი მუშაობის სიჩქარე (პროცესურობა) უფრო დაბალია, ვიდრე ტაქ. ამჟამად გამოიყენება ნარევები ტაქდა პფუპოლიმერიზაციის მაღალი სიჩქარისა და კოპირების მაღალი სიზუსტის მისაღწევად.

მეთოდის გამოგონების დროს კარი მალისი მუშაობდა სინთეზურ ქიმიკოსად (მან სინთეზიდა ოლიგონუკლეოტიდებს, რომლებიც შემდეგ გამოიყენებოდა წერტილოვანი მუტაციების გამოსავლენად გენომიურ დნმ-თან ჰიბრიდიზაციით) Cetus Corporation-ში, რომელმაც დააპატენტა PCR მეთოდი. 1992 წელს ცეტუსმა გაყიდა მეთოდის უფლებები და გამოყენების პატენტი ტაქ-პოლიმერაზული კომპანია Hofmann-La Roche 300 მილიონ დოლარად. თუმცა აღმოჩნდა, რომ ტაქ-პოლიმერაზას ახასიათებდნენ საბჭოთა ბიოქიმიკოსები ა. კალედინი, ა. სლუზარენკო და ს. გოროდეცკი 1980 წელს, ასევე ამ საბჭოთა გამოცემამდე 4 წლით ადრე, ანუ 1976 წელს, ამერიკელმა ბიოქიმიკოსებმა ალის ჩიენმა, დევიდ ბ. ედგარმა და ჯონ მ. ტრელა. ამასთან დაკავშირებით, კომპანია პრომეგა ცდილობდა როშს სასამართლოში დაეტოვებინა ექსკლუზიური უფლებები ამ ფერმენტზე. PCR მეთოდის ამერიკულ პატენტს ვადა ამოეწურა 2005 წლის მარტში.

PCR-ის ჩატარება

მეთოდი ეფუძნება დნმ-ის გარკვეული მონაკვეთის განმეორებით შერჩევით კოპირებას ფერმენტების გამოყენებით ხელოვნურ პირობებში ( ინ ვიტრო). ამ შემთხვევაში კოპირდება მხოლოდ ის მონაკვეთი, რომელიც აკმაყოფილებს მითითებულ პირობებს და მხოლოდ იმ შემთხვევაში, თუ ის იმყოფება შესასწავლ ნიმუშში. ცოცხალ ორგანიზმებში დნმ-ის გაძლიერებისგან განსხვავებით (რეპლიკაცია), დნმ-ის შედარებით მოკლე მონაკვეთები მრავლდება PCR-ის გამოყენებით. ჩვეულებრივი PCR პროცესის დროს, კოპირებული დნმ-ის სექციების სიგრძე არ არის 3000 ბაზის წყვილზე მეტი (3 kbp). სხვადასხვა პოლიმერაზების ნარევის გამოყენებით, დანამატების გამოყენებით და გარკვეულ პირობებში, PCR ფრაგმენტის სიგრძემ შეიძლება მიაღწიოს 20-40 ათას ნუკლეოტიდურ წყვილს. ეს ჯერ კიდევ მნიშვნელოვნად ნაკლებია ევკარიოტული უჯრედის ქრომოსომული დნმ-ის სიგრძეზე. მაგალითად, ადამიანის გენომი შედგება დაახლოებით 3 მილიარდი ბაზის წყვილისგან.

რეაქციის კომპონენტები

უმარტივეს შემთხვევაში PCR-ის ჩასატარებლად საჭიროა შემდეგი კომპონენტები:

• დნმ მატრიცა, რომელიც შეიცავს დნმ-ის იმ მონაკვეთს, რომელიც საჭიროებს გაძლიერებას.
• ორი პრაიმერი, რომელიც ავსებს სასურველი დნმ-ის ფრაგმენტის სხვადასხვა ჯაჭვების საპირისპირო ბოლოებს.
• თერმულად სტაბილური დნმ პოლიმერაზა- ფერმენტი, რომელიც აკატალიზებს დნმ-ის პოლიმერიზაციის რეაქციას. პოლიმერაზა PCR-ში გამოსაყენებლად აქტიური უნდა დარჩეს მაღალ ტემპერატურაზე დიდი ხნის განმავლობაში, ამიტომ გამოიყენება თერმოფილებისგან იზოლირებული ფერმენტები - თერმუს აკვატიკუსი(Taq პოლიმერაზა), Pyrococcus furiosus(პფუ პოლიმერაზა), Pyrococcus woesei(Pwo პოლიმერაზა) და სხვა.
• დეოქსირიბონუკლეოზიდის ტრიფოსფატები(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• პოლიმერაზას ფუნქციონირებისთვის საჭირო Mg 2+ იონები.
• ბუფერული ხსნარი, რომელიც უზრუნველყოფს რეაქციის საჭირო პირობებს - pH, ხსნარის იონური სიძლიერე. შეიცავს მარილებს, მსხვილფეხა რქოსანი შრატის ალბუმინს.

რეაქციის ნარევის აორთქლების თავიდან ასაცილებლად, სინჯარაში დაამატეთ მაღალი მდუღარე ზეთი, როგორიცაა ვაზელინი. თუ იყენებთ თერმოციკლერს გახურებული სახურავით, ეს არ არის საჭირო.

პიროფოსფატაზას დამატებამ შეიძლება გაზარდოს PCR რეაქციის გამომუშავება. ეს ფერმენტი კატალიზებს პიროფოსფატის ჰიდროლიზს, ნუკლეოტიდის ტრიფოსფატების დამატების ქვეპროდუქტს მზარდი დნმ-ის ჯაჭვში, ორთოფოსფატში. პიროფოსფატმა შეიძლება დათრგუნოს PCR რეაქცია.

პრაიმერები

PCR-ის სპეციფიკა ემყარება შაბლონსა და პრაიმერებს შორის დამატებითი კომპლექსების წარმოქმნას, მოკლე სინთეზური ოლიგონუკლეოტიდები 18-30 ბაზის სიგრძით. თითოეული პრაიმერი ავსებს ორჯაჭვიანი შაბლონის ერთ-ერთ ძაფს და ზღუდავს გაძლიერებული რეგიონის დასაწყისსა და დასასრულს.

შაბლონის პრაიმერთან ჰიბრიდიზაციის შემდეგ (ანილირება), ეს უკანასკნელი ემსახურება როგორც პრაიმერი დნმ-პოლიმერაზასთვის დამატებითი შაბლონის ჯაჭვის სინთეზის დროს (იხ.).

პრაიმერების ყველაზე მნიშვნელოვანი მახასიათებელია პრაიმერი-მატრიცის კომპლექსის დნობის ტემპერატურა (Tm).

Tm არის ტემპერატურა, რომლის დროსაც დნმ-ის შაბლონების ნახევარი ქმნის კომპლექსს ოლიგონუკლეოტიდურ პრაიმერთან. Tm-ის გამოთვლის საშუალო ფორმულა მოკლე ოლიგონუკლეოტიდისთვის (და გრძელი დნმ-ის ფრაგმენტებისთვის), K + და DMSO იონების კონცენტრაციის გათვალისწინებით:

სადაც L არის ნუკლეოტიდების რაოდენობა პრაიმერში, K + არის კალიუმის იონების მოლური კონცენტრაცია, G + C არის ყველა გუანინისა და ციტოზინის ჯამი.

თუ პრაიმერის სიგრძე და ნუკლეოტიდური შემადგენლობა არასწორად არის შერჩეული, შესაძლებელია ნაწილობრივ დამატებითი კომპლექსების წარმოქმნა შაბლონის დნმ-ის სხვა რეგიონებთან, რამაც შეიძლება გამოიწვიოს არასპეციფიკური პროდუქტების გამოჩენა. დნობის ტემპერატურის ზედა ზღვარი შემოიფარგლება პოლიმერაზას მოქმედების ოპტიმალური ტემპერატურით, რომლის აქტივობა მცირდება 80 °C-ზე მაღალ ტემპერატურაზე.

პრაიმერების არჩევისას მიზანშეწონილია დაიცვან შემდეგი კრიტერიუმები:

გამაძლიერებელი

ბრინჯი. 1: ციკლერი PCR-ისთვის

PCR ტარდება თერმოციკლერში - მოწყობილობა, რომელიც უზრუნველყოფს საცდელი მილების პერიოდულ გაგრილებას და გათბობას, როგორც წესი, მინიმუმ 0,1 °C სიზუსტით. თანამედროვე ციკლერები საშუალებას გაძლევთ დააყენოთ რთული პროგრამები, მათ შორის „ცხელი დაწყება“, Touchdown PCR (იხ. ქვემოთ) და შემდგომში გაძლიერებული მოლეკულების შენახვა 4 °C ტემპერატურაზე. რეალურ დროში PCR-სთვის იწარმოება ფლუორესცენტური დეტექტორით აღჭურვილი მოწყობილობები. ასევე არსებობს მოწყობილობები ავტომატური სახურავით და მიკროფირფიტების განყოფილებით, რაც მათ ავტომატიზირებულ სისტემებში ინტეგრირების საშუალებას აძლევს.

რეაქციის პროგრესი

გელის ფოტო, რომელიც შეიცავს მარკერის დნმ-ს (პირველი და ბოლო სლოტები) და PCR პროდუქტები

როგორც წესი, PCR ატარებს 20-35 ციკლს, რომელთაგან თითოეული შედგება სამი ეტაპისგან (ნახ. 2).

დენატურაცია

ორჯაჭვიანი დნმ-ის შაბლონი თბება 94-96 °C-მდე (ან 98 °C-მდე, თუ განსაკუთრებით თერმოსტაბილური პოლიმერაზა გამოიყენება) 0,5-2 წუთის განმავლობაში დნმ-ის ჯაჭვების გამოსაყოფად. ამ ეტაპს ე.წ დენატურაცია, ვინაიდან დნმ-ის ორ ჯაჭვს შორის წყალბადის ბმები განადგურებულია. ზოგჯერ, პირველ ციკლამდე (პოლიმერაზას დამატებამდე), სარეაქციო ნარევს წინასწარ აცხელებენ 2-3 წუთის განმავლობაში, რათა მთლიანად დენატურირებული იყოს მატრიცა და პრაიმერები. ამ ტექნიკას ე.წ ცხელი დაწყება, ის საშუალებას გაძლევთ შეამციროთ არასპეციფიკური რეაქციის პროდუქტების რაოდენობა.

ანეილირება

მას შემდეგ, რაც ძაფები გაიყოფა, ტემპერატურა იკლებს, რათა პრაიმერები მიბმული იყვნენ ერთჯაჭვიან შაბლონთან. ამ ეტაპს ე.წ ანეილირება. დუღილის ტემპერატურა დამოკიდებულია პრაიმერების შემადგენლობაზე და ჩვეულებრივ არჩეულია პრაიმერების დნობის ტემპერატურის ტოლფასი. დუღილის ტემპერატურის არასწორი არჩევანი იწვევს პრაიმერების ცუდ მიბმას შაბლონთან (ძალიან მაღალ ტემპერატურაზე) ან არასწორ ადგილას შეკვრას და არასპეციფიკური პროდუქტების გამოჩენას (ძალიან დაბალ ტემპერატურაზე). ანეილირების ეტაპის დრო 30 წამია, ამ დროს პოლიმერაზა უკვე ახერხებს რამდენიმე ასეული ნუკლეოტიდის სინთეზირებას. ამიტომ რეკომენდირებულია პრაიმერების შერჩევა 60 °C-ზე მეტი დნობის წერტილით და ადუღება და დრეკადობა ერთდროულად 60-72 °C ტემპერატურაზე.

დრეკადობა

დნმ პოლიმერაზა იმეორებს შაბლონის ძაფს პრაიმერის, როგორც პრაიმერის გამოყენებით. ეს არის ეტაპი დრეკადობა. პოლიმერაზა იწყებს მეორე ჯაჭვის სინთეზს პრაიმერის 3" ბოლოდან, რომელიც მიბმულია შაბლონთან და მოძრაობს შაბლონის გასწვრივ, ასინთეზირებს ახალ ძაფს 5"-დან 3"-მდე ბოლოების მიმართულებით. დრეკადობის ტემპერატურა დამოკიდებულია პოლიმერაზა. ხშირად გამოყენებული პოლიმერაზები Taq და Pfu ყველაზე აქტიურია 72 °C ტემპერატურაზე. დრეკადობის დრო დამოკიდებულია როგორც დნმ პოლიმერაზას ტიპზე, ასევე გაძლიერებული ფრაგმენტის სიგრძეზე. როგორც წესი, დრეკადობის დრო დაყენებულია ერთ წუთზე ათას ბაზის წყვილზე. ყველა ციკლის დასრულების შემდეგ ხშირად კეთდება დამატებითი ნაბიჯი საბოლოო დრეკადობაყველა ერთჯაჭვიანი ფრაგმენტის დასასრულებლად. ეს ეტაპი გრძელდება 7-10 წუთი.

ბრინჯი. 2: პირველი PCR ციკლის სქემატური წარმოდგენა. (1) დენატურაცია 94-96 °C-ზე. (2) ანილირება 68 °C-ზე (მაგალითად). (3) დრეკადობა 72°C-ზე (P=პოლიმერაზა). (4) დასრულდა პირველი ციკლი. შედეგად მიღებული დნმ-ის ორი ჯაჭვი ემსახურება როგორც შაბლონს შემდეგი ციკლისთვის, ამიტომ შაბლონის დნმ-ის რაოდენობა ორმაგდება ყოველი ციკლის განმავლობაში.

სპეციფიკური რეაქციის პროდუქტის რაოდენობა (პრაიმერებით შეზღუდული) თეორიულად იზრდება 2n - 2n-ის პროპორციულად, სადაც n არის რეაქციის ციკლების რაოდენობა. სინამდვილეში, თითოეული ციკლის ეფექტურობა შეიძლება იყოს 100%-ზე ნაკლები, ასე რომ, სინამდვილეში P ~ (1+E) n, სადაც P არის პროდუქტის რაოდენობა, E არის ციკლის საშუალო ეფექტურობა.

ასევე იზრდება დნმ-ის "გრძელი" ასლების რაოდენობა, მაგრამ ხაზოვანი, ამიტომ კონკრეტული ფრაგმენტი დომინირებს რეაქციის პროდუქტებში.

საჭირო პროდუქტის ზრდა ექსპონენტურად შეზღუდულია რეაგენტების რაოდენობით, ინჰიბიტორების არსებობით და ქვეპროდუქტების წარმოქმნით. რეაქციის ბოლო ციკლების დროს ზრდა ნელდება, ამას ეწოდება "პლატო ეფექტი".

PCR-ის სახეები

• ჩადგმული PCR(Nested PCR (ინგლისური)) - გამოიყენება რეაქციის ქვეპროდუქტების რაოდენობის შესამცირებლად. გამოიყენება ორი წყვილი პრაიმერი და ტარდება ორი თანმიმდევრული რეაქცია. პრაიმერების მეორე წყვილი აძლიერებს დნმ-ის რეგიონს პირველი რეაქციის პროდუქტში.
• ინვერსიული PCR(ინვერსიული PCR (ინგლისური)) - გამოიყენება, თუ ცნობილია მხოლოდ მცირე რეგიონი სასურველი თანმიმდევრობის ფარგლებში. ეს მეთოდი განსაკუთრებით სასარგებლოა, როდესაც საქმე ეხება მეზობელი თანმიმდევრობების განსაზღვრას დნმ-ის გენომში ჩასმის შემდეგ. ინვერსიული PCR-ის ჩასატარებლად ტარდება დნმ-ის ჭრილობების სერია შემზღუდავი ფერმენტებით, რასაც მოჰყვება ფრაგმენტების შეერთება (ლიგაცია). შედეგად, ცნობილი ფრაგმენტები მთავრდება უცნობი რეგიონის ორივე ბოლოში, რის შემდეგაც PCR შეიძლება ჩატარდეს ჩვეულებრივად.
• საპირისპირო ტრანსკრიფცია PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR (ინგლისური)) - გამოიყენება რნმ ბიბლიოთეკიდან ცნობილი თანმიმდევრობის გასაძლიერებლად, იზოლირებისთვის ან იდენტიფიცირებისთვის. ჩვეულებრივი PCR-მდე, ერთჯაჭვიანი დნმ-ის მოლეკულა სინთეზირდება mRNA შაბლონზე რევერსიაზის გამოყენებით და მიიღება ერთჯაჭვიანი cDNA, რომელიც გამოიყენება PCR-ის შაბლონად. ეს მეთოდი ხშირად განსაზღვრავს სად და როდის არის ეს გენები გამოხატული.
• ასიმეტრიული PCR(ინგლისური) ასიმეტრიული PCR) - ტარდება მაშინ, როდესაც აუცილებელია დნმ-ის უპირატესად ერთ-ერთი წყაროს ჯაჭვის გაძლიერება. გამოიყენება გარკვეული თანმიმდევრობისა და ჰიბრიდიზაციის ანალიზის ტექნიკაში. PCR ტარდება ჩვეულებისამებრ, გარდა იმისა, რომ ერთ-ერთი პრაიმერი აღებულია დიდი სიჭარბით. ამ მეთოდის ცვლილებები ინგლისურია. ლ ყურში-ა შემდეგ -თ ის-ე xponential-PCR (LATE-PCR), რომელშიც გამოიყენება სხვადასხვა კონცენტრაციის პრაიმერები და დაბალი კონცენტრაციის პრაიმერი შეირჩევა უფრო მაღალი (დნობის წერტილი) ვიდრე მაღალი კონცენტრაციის პრაიმერი. PCR ტარდება ცხელების მაღალ ტემპერატურაზე, რითაც ინარჩუნებს რეაქციის ეფექტურობას ყველა ციკლის განმავლობაში.
• რაოდენობრივი PCR(Quantitative PCR, Q-PCR (ინგლისური)) ან რეალურ დროში PCR- გამოიყენება თითოეული რეაქციის ციკლში კონკრეტული PCR პროდუქტის ოდენობის გაზომვის პირდაპირ მონიტორინგისთვის. ეს მეთოდი იყენებს ფლუორესცენტურად მარკირებულ პრაიმერებს ან დნმ-ის ზონდებს, რათა ზუსტად გაზომოს რეაქციის პროდუქტის რაოდენობა მისი დაგროვებისას; ან გამოიყენება ფლუორესცენტური ინტერკალირებული საღებავი Sybr Green I, რომელიც უერთდება ორჯაჭვიან დნმ-ს. Sybr Green Iგთავაზობთ მარტივ და ეკონომიურ ვარიანტს PCR პროდუქტების აღმოსაჩენად და რაოდენობრივად რეალურ დროში PCR-ის დროს სპეციფიური ფლუორესცენტური ზონდების ან პრაიმერების საჭიროების გარეშე. ამპლიფიკაციის დროს, საღებავი SYBR მწვანე Iჩაშენებულია PCR პროდუქტების დნმ-ის უმნიშვნელო ღარში და ასხივებს უფრო ძლიერ ფლუორესცენტურ სიგნალს ლურჯი ლაზერით დასხივებისას შეუზღუდავ საღებავთან შედარებით. SYBR მწვანე Iთავსებადია ყველა ამჟამად ცნობილ მოწყობილობასთან რეალურ დროში PCR-ისთვის. მაქსიმალური შეწოვა ამისთვის SYBR მწვანე Iმდებარეობს 494 ნმ ტალღის სიგრძეზე. გარდა ძირითადისა, საღებავის სპექტრი შეიცავს ორ მცირე დამატებით შთანთქმის მაქსიმუმს - 290 ნმ და 380 ნმ. მაქსიმალური ემისია ამისთვის SYBR მწვანე Iმდებარეობს ტალღის სიგრძეზე 521 ნმ (მწვანე).
• ეტაპობრივი PCR(Touchdown PCR (ინგლისური)) - ამ მიდგომის გამოყენებით მცირდება პრაიმერის არასპეციფიკური შებოჭვის გავლენა. პირველი ციკლები ტარდება ოპტიმალურ ტემპერატურაზე მაღალ ტემპერატურაზე, შემდეგ ყოველ რამდენიმე ციკლში გახურების ტემპერატურა თანდათან მცირდება ოპტიმალურ ტემპერატურამდე. ეს კეთდება ისე, რომ პრაიმერი ჰიბრიდირებული იყოს დამატებით ძაფთან მთელ სიგრძეზე; ხოლო ოპტიმალური ანეილირების ტემპერატურაზე, პრაიმერი ნაწილობრივ ჰიბრიდდება დამატებით ძაფთან. პრაიმერის ნაწილობრივი ჰიბრიდიზაცია გენომურ დნმ-ზე იწვევს არასპეციფიკურ ამპლიფიკაციას, თუ პრაიმერის მრავალი დამაკავშირებელი ადგილია. უმეტეს შემთხვევაში, პირველი ათი PCR ციკლი შეიძლება განხორციელდეს 72-75°C ანეილირების ტემპერატურაზე და შემდეგ დაუყოვნებლივ შემცირდეს ოპტიმალურ ტემპერატურამდე, მაგალითად, 60-65°C-მდე.
• მოლეკულური კოლონიის მეთოდი(PCR გელში, ინგლისური. კოლონია - PCR კოლონია) - აკრილამიდის გელი პოლიმერიზებულია ყველა PCR კომპონენტით ზედაპირზე და ტარდება PCR. გაანალიზებული დნმ-ის შემცველ წერტილებში გაძლიერება ხდება მოლეკულური კოლონიების წარმოქმნით.
• მთავრდება PCR cDNA-ს სწრაფი გაძლიერებით(ინგლისური) cDNA ბოლოების სწრაფი გაძლიერება, RACE-PCR ).
• გრძელი ფრაგმენტი PCR(ინგლისური) გრძელვადიანი PCR) - PCR-ის მოდიფიკაცია დნმ-ის გაფართოებული სექციების (10 ათასი ბაზის ან მეტი) გასაძლიერებლად. გამოიყენება ორი პოლიმერაზას ნარევი, რომელთაგან ერთი არის Taq პოლიმერაზა მაღალი პროცესურობით (ანუ შეუძლია დნმ-ის გრძელი ჯაჭვის სინთეზირება ერთ უღელტეხილზე), ხოლო მეორე არის დნმ პოლიმერაზა 3"-5" ეგზონუკლეაზური აქტივობით, ჩვეულებრივ. პფუ პოლიმერაზა. მეორე პოლიმერაზა აუცილებელია პირველის მიერ დაშვებული შეცდომების გამოსასწორებლად, რადგან Taq პოლიმერაზა აჩერებს დნმ-ის სინთეზს, თუ დაემატება არაკომპლიმენტური ნუკლეოტიდი. ეს არაკომპლიმენტური ნუკლეოტიდი ამოღებულია Pfu პოლიმერაზას მიერ. პოლიმერაზების ნარევი მიიღება 50:1 თანაფარდობით ან თუნდაც 100:1-ზე ნაკლები, სადაც Taq პოლიმერაზა მიიღება 25-100-ჯერ მეტი Pfu პოლიმერაზასთან მიმართებაში.
• RAPD(ინგლისური) პოლიმორფული დნმ-ის შემთხვევითი გაძლიერება ), PCR პოლიმორფული დნმ-ის შემთხვევითი გაძლიერებით - გამოიყენება, როდესაც საჭიროა განასხვავოთ ორგანიზმები, რომლებიც ახლოს არიან გენეტიკური თანმიმდევრობით, მაგალითად, სხვადასხვა ჯიშის კულტივირებული მცენარეები, ძაღლების ჯიშები ან მჭიდროდ დაკავშირებული მიკროორგანიზმები. ეს მეთოდი ჩვეულებრივ იყენებს ერთ პატარა პრაიმერს (დაახლოებით 10 bp). ეს პრაიმერი ნაწილობრივ შეავსებს შესასწავლი ორგანიზმების დნმ-ის შემთხვევით ნაწილებს. პირობების შერჩევით (პრაიმერის სიგრძე, მისი შემადგენლობა, ტემპერატურა და ა.შ.) შესაძლებელია ორი ორგანიზმისთვის PCR ნიმუშის დამაკმაყოფილებელი სხვაობის მიღწევა.
• ჯგუფის სპეციფიკური PCR(ინგლისური) ჯგუფის სპეციფიკური PCR) - PCR დაკავშირებული თანმიმდევრობებისთვის ერთსა და იმავე სახეობებში ან სხვადასხვა სახეობებს შორის, ამ თანმიმდევრობისთვის კონსერვირებული პრაიმერების გამოყენებით. მაგალითად, რიბოსომისთვის უნივერსალური პრაიმერების შერჩევა 18Sდა 26Sგენები სახეობების სპეციფიკური ინტერგენური სპეცერის გაძლიერებისთვის: გენის თანმიმდევრობა 18Sდა 26Sშენარჩუნებულია სახეობებს შორის, ამიტომ ამ გენებს შორის PCR იმუშავებს ყველა შემოწმებული სახეობისთვის. ამ მეთოდის საპირისპიროა - უნიკალური PCR(ინგლისური) უნიკალური PCR), რომელშიც ამოცანაა პრაიმერების შერჩევა დაკავშირებულ მიმდევრებს შორის მხოლოდ კონკრეტული მიმდევრობის გასაძლიერებლად.
• PCR ცხელი დაწყების გამოყენებით(ინგლისური) ცხელი დაწყების PCR) - PCR-ის მოდიფიკაცია დნმ პოლიმერაზას გამოყენებით, რომელშიც პოლიმერაზას აქტივობა იბლოკება ოთახის ტემპერატურაზე ანტისხეულებით ან მცირე მოლეკულებით, რომლებიც სიმულაციას უკეთებენ ანტისხეულებს, როგორიცაა Affibody, ანუ რეაქციის დაყენების დროს PCR-ში პირველ დენატურაციამდე. როგორც წესი, პირველი დენატურაცია ტარდება 95 °C ტემპერატურაზე 10 წუთის განმავლობაში.
• ვირტუალური PCR(ინგლ. in silico PCR, digital PCR, electronic PCR, e-PCR) - თეორიული პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის კომპიუტერული ანალიზის მეთოდი პრაიმერის თანმიმდევრობების (ან დნმ ზონდების) სიის გამოყენებით გენომის პოტენციური დნმ-ის გაძლიერების პროგნოზირებისთვის. , ქრომოსომა, წრიული დნმ ან დნმ-ის ნებისმიერი სხვა ნაწილი.

თუ შაბლონის ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობა ნაწილობრივ ცნობილია ან საერთოდ უცნობია, შეგიძლიათ გამოიყენოთ გადაგვარებული პრაიმერები, რომლის თანმიმდევრობა შეიცავს დეგენერაციულ პოზიციებს, რომლებშიც შეიძლება განთავსდეს ნებისმიერი ფუძე. მაგალითად, პრაიმერის თანმიმდევრობა შეიძლება იყოს: ...ATH..., სადაც N არის A, T ან C.

PCR-ის გამოყენება

PCR გამოიყენება მრავალ სფეროში ტესტირებისა და სამეცნიერო ექსპერიმენტებისთვის.

სასამართლო ექსპერტიზა

PCR გამოიყენება ეგრეთ წოდებული "გენეტიკური თითის ანაბეჭდების" შესადარებლად. საჭიროა დანაშაულის ადგილიდან გენეტიკური მასალის ნიმუში - სისხლი, ნერწყვი, სპერმა, თმა და ა.შ. ეს შედარებულია ეჭვმიტანილის გენეტიკურ მასალასთან. დნმ-ის ძალიან მცირე რაოდენობა საკმარისია, თეორიულად ერთი ასლი. დნმ იშლება ფრაგმენტებად და შემდეგ მრავლდება PCR-ის გამოყენებით. ფრაგმენტები გამოყოფილია დნმ ელექტროფორეზის გამოყენებით. დნმ-ის ზოლების მოწყობის შედეგად მიღებული სურათი ე.წ გენეტიკური თითის ანაბეჭდი(ინგლისური) გენეტიკური თითის ანაბეჭდი).

მამობის დადგენა

ბრინჯი. 3: PCR-ით გაძლიერებული დნმ-ის ფრაგმენტების ელექტროფორეზის შედეგები. (1) მამა. (2) ბავშვი. (3) დედა. ბავშვმა მემკვიდრეობით მიიღო ორივე მშობლის გენეტიკური ანაბეჭდის ზოგიერთი თვისება, რამაც ახალი, უნიკალური ანაბეჭდი მისცა.

მიუხედავად იმისა, რომ გენეტიკური თითის ანაბეჭდები უნიკალურია (გარდა იდენტური ტყუპების შემთხვევისა), ოჯახური ურთიერთობების დამყარება მაინც შესაძლებელია რამდენიმე თითის ანაბეჭდის დამზადებით (სურათი 3). იგივე მეთოდი შეიძლება გამოყენებულ იქნას, ოდნავ შეცვლილი, რათა დადგინდეს ევოლუციური ნათესაობა ორგანიზმებს შორის.

სამედიცინო დიაგნოსტიკა

PCR შესაძლებელს ხდის მნიშვნელოვნად დააჩქაროს და ხელი შეუწყოს მემკვიდრეობითი და ვირუსული დაავადებების დიაგნოზს. საინტერესო გენი გაძლიერებულია PCR-ით შესაბამისი პრაიმერების გამოყენებით და შემდეგ სექვენირება ხდება მუტაციების იდენტიფიცირებისთვის. ვირუსული ინფექციები შეიძლება გამოვლინდეს ინფექციის შემდეგ დაუყოვნებლივ, სიმპტომების გამოვლენამდე კვირით ან თვით ადრე.

პერსონალიზებული მედიცინა

ზოგჯერ მედიკამენტები ზოგიერთი პაციენტისთვის ტოქსიკური ან ალერგენული აღმოჩნდება. ამის მიზეზები ნაწილობრივ განპირობებულია ინდივიდუალური განსხვავებებით წამლებისა და მათი წარმოებულების მგრძნობელობასა და მეტაბოლიზმში. ეს განსხვავებები განისაზღვრება გენეტიკურ დონეზე. მაგალითად, ერთ პაციენტში გარკვეული ციტოქრომი (ღვიძლის ცილა, რომელიც პასუხისმგებელია უცხო ნივთიერებების მეტაბოლიზმზე) შეიძლება იყოს უფრო აქტიური, მეორეში - ნაკლები. იმის დასადგენად, თუ რა ტიპის ციტოქრომი აქვს მოცემულ პაციენტს, შემოთავაზებულია PCR ანალიზის ჩატარება პრეპარატის გამოყენებამდე. ამ ანალიზს წინასწარი გენოტიპირება ეწოდება. პერსპექტიული გენოტიპინგი).

გენის კლონირება

გენის კლონირება (არ უნდა აგვერიოს ორგანიზმების კლონირებაში) არის გენების იზოლირების პროცესი და გენეტიკური ინჟინერიის მანიპულაციების შედეგად, მოცემული გენის პროდუქტის დიდი რაოდენობით მიღება. PCR გამოიყენება გენის გასაძლიერებლად, რომელიც შემდეგ ჩასმულია ვექტორი- დნმ-ის ფრაგმენტი, რომელიც გადააქვს უცხო გენს იმავე ან სხვა კულტივირებისთვის ხელსაყრელ ორგანიზმში. მაგალითად, პლაზმიდები ან ვირუსული დნმ გამოიყენება როგორც ვექტორები. გენების უცხო ორგანიზმში ჩასმა ჩვეულებრივ გამოიყენება ამ გენის პროდუქტის - რნმ-ის ან, ყველაზე ხშირად, ცილის წარმოებისთვის. ამ გზით, მრავალი ცილა მიიღება სამრეწველო რაოდენობით, სოფლის მეურნეობაში, მედიცინაში და ა.შ.

ბრინჯი. 4: გენის კლონირება პლაზმიდის გამოყენებით.
(1) ორგანიზმის A ქრომოსომული დნმ. (2) PCR. (3) ორგანიზმის A გენის მრავალი ასლი. (4) გენის ჩასმა პლაზმიდში. (5) პლაზმიდი A ორგანიზმის გენით. (6) პლაზმიდის შეყვანა B ორგანიზმში. (7) A ორგანიზმის გენის ასლების რაოდენობის გამრავლება B ორგანიზმში.

დნმ-ის თანმიმდევრობა

ფლუორესცენტური ეტიკეტით ან რადიოაქტიური იზოტოპით მარკირებული დიდეოქსინუკლეოტიდების გამოყენებით, PCR განუყოფელი ნაწილია, რადგან პოლიმერიზაციის დროს ხდება ფლუორესცენტური ან რადიოაქტიური ეტიკეტით მარკირებული ნუკლეოტიდების წარმოებულები ჩასმული დნმ-ის ჯაჭვში. სინთეზირებულ ჯაჭვში დიდოქსინუკლეოტიდის დამატება წყვეტს სინთეზს, რაც საშუალებას იძლევა განისაზღვროს სპეციფიკური ნუკლეოტიდების პოზიცია გელში გამოყოფის შემდეგ.

მუტაგენეზი

ამჟამად PCR გახდა მთავარი მეთოდი მუტაგენეზის განსახორციელებლად (დნმ-ის ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობის შეცვლა). PCR-ის გამოყენებამ შესაძლებელი გახადა მუტაგენეზის პროცედურის გამარტივება და დაჩქარება, ასევე უფრო საიმედო და გამეორებადი.

ს.ვ. პოსპელოვა, მ.ვ. კუზნეცოვა

Პოლიმერიზაციის ჯაჭვური რეაქციის

ს.ვ. პოსპელოვი– დოქტორი თაფლი. მეცნიერებათა, მიკრობიოლოგიის, ვირუსოლოგიისა და იმუნოლოგიის კათედრის ასოცირებული პროფესორი, მ.ვ. კუზნეცოვა– დოქტორი ბიოლ. მეცნიერებანი, რუსეთის მეცნიერებათა აკადემიის IEGM ურალის ფილიალის თანამშრომელი

პოსპელოვა, ს.ვ.

შექმნილია ყველა ფაკულტეტის სტუდენტების დამოუკიდებელი მუშაობისთვის: სამედიცინო, პედიატრიული, სამედიცინო და პროფილაქტიკური, სტომატოლოგიური და სამედიცინო აკადემიის უმაღლესი საექთნო განათლების ფაკულტეტი (FVSO).

მიმომხილველი:

ხელმძღვანელი ბიოლოგიის, ეკოლოგიისა და სამედიცინო გენეტიკის დეპარტამენტი PGMA, პროფესორი ა.ბ. ვინოგრადოვი

დაბეჭდილია ცენტრალური კოორდინაციის გადაწყვეტილებით
უმაღლესი პროფესიული განათლების სახელმწიფო საგანმანათლებლო დაწესებულების მეთოდური საბჭო PGMA
მათ. აკ. ე.ა. ვაგნერ როსზდრავი

UDC 616-078.33

© Pospelova S.V., Kuznetsova M.V., 2007 წ

© სახელმწიფო საგანმანათლებლო დაწესებულება უმაღლესი პროფესიული განათლების პგმა. აკ. ე.ა. ვაგნერ როსზდრავი, 2007 წ

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია კლინიკურში
მიკრობიოლოგიური დიაგნოსტიკა

თანამედროვე მედიცინა წარმატებით იყენებს საბუნებისმეტყველო მეცნიერებების მიღწევებს და ინტენსიურად იყენებს ახალ ტექნოლოგიებს დაავადებათა დიაგნოსტიკისა და მკურნალობისთვის. ბოლო დროს ინფექციური დაავადებების ლაბორატორიული დიაგნოსტიკის ტრადიციულ მიკრობიოლოგიურ და იმუნოლოგიურ მეთოდებს დაემატა მოლეკულური გენეტიკური ტექნოლოგიების გამოყენებაზე დაფუძნებული ახლები. ამ მეთოდების გამოყენება არა მხოლოდ სამეცნიერო მიზნებისთვის, არამედ პრაქტიკულ ლაბორატორიულ დიაგნოსტიკაშიც დიდწილად გახდა შესაძლებელი 80-იანი წლების შუა პერიოდში დნმ-ის ხელოვნური მრავალჯერადი კოპირების პროცესის შექმნისა და ამ ტექნოლოგიის შემდგომი სწრაფი განვითარების წყალობით. ამჟამად ცნობილია როგორც პოლიმერიზაციის ჯაჭვური რეაქციის(PCR). არსებობის 15 წელზე ნაკლებ დროში, PCR-მ ჩაატარა რუტინული ანალიზი მრავალი პათოგენური მიკროორგანიზმების სპეციფიკური დნმ-ის თანმიმდევრობების შესახებ. მისმა მრავალფეროვნებამ, მაღალმა მგრძნობელობამ და შესრულების შედარებით მარტივმა გახადა PCR მეთოდი შეუცვლელი სხვადასხვა კლინიკური დიაგნოსტიკური პრობლემების გადასაჭრელად, როგორიცაა პათოგენების პირდაპირი გამოვლენა და იდენტიფიკაცია, პათოგენური მიკროორგანიზმების თვისებების მოლეკულური ტიპირება და შესწავლა, გენეტიკურ დაავადებებთან დაკავშირებული მუტაციების ანალიზი. ადამიანებში და ადამიანის პიროვნების იდენტიფიკაცია.

რა არის PCR?

Პოლიმერიზაციის ჯაჭვური რეაქციის(PCR) - განმეორებითი კოპირების ხელოვნური პროცესი (გაძლიერება) განხორციელებული დნმ-ის სპეციფიკური თანმიმდევრობა ინ ვიტრო(ნახ. 1). PCR-ის დროს დნმ-ის კოპირება ხორციელდება სპეციალური ფერმენტით - დნმ პოლიმერაზაროგორც ცოცხალი ორგანიზმების უჯრედებში. დნმ პოლიმერაზა, რომელიც მოძრაობს დნმ-ის ერთი ჯაჭვის გასწვრივ (თარგი), ასინთეზებს მის დამატებით დნმ-ის თანმიმდევრობას. მნიშვნელოვანია, რომ დნმ პოლიმერაზას არ შეუძლია დაიწყოს დნმ-ის ჯაჭვის სინთეზირება „ნულიდან“; მას სჭირდება რნმ-ის ან დნმ-ის მოკლე „თესლოვანი“ ჯაჭვი, რომელზეც მას შეუძლია დაიწყოს ნუკლეოტიდების მიმაგრება. PCR-ის ძირითადი პრინციპია ის, რომ პოლიმერიზაციის რეაქცია (დნმ-ის პოლიმერული ჯაჭვის სინთეზი მონომერული ნუკლეოტიდური ერთეულებიდან) იწყება სპეციფიური გზით. პრაიმერები("თესლის" დნმ-ის მოკლე ფრაგმენტები) თითოეულ მრავალ განმეორებით ციკლში. PCR-ის სპეციფიკა განისაზღვრება პრაიმერების უნარით „აღიცნონ“ დნმ-ის მკაცრად განსაზღვრული მონაკვეთი და დაუკავშირონ მას მოლეკულური პრინციპის მიხედვით. კომპლემენტარულობა.

ტიპიური PCR რეაქცია იყენებს პრაიმერების წყვილს, რომლებიც „ზღუდავენ“ რეგიონს, რომელიც უნდა გაძლიერდეს ორივე მხრიდან დნმ-ის შაბლონის საპირისპირო ჯაჭვებთან შეკავშირებით. ორიგინალური დნმ-ის ასლების რაოდენობის გასამრავლებლად საჭიროა ციკლური რეაქცია. როგორც წესი, თითოეული თანმიმდევრულად განმეორებადი PCR ციკლი შედგება სამი ეტაპისგან:

1)დენატურაცია, ან ორჯაჭვიანი დნმ-ის „დნობა“: რეაქციის დაწყებამდე სამიზნე დნმ ორჯაჭვიანია, 94-95 0 C ტემპერატურაზე დამატებითი დნმ-ის ჯაჭვები განსხვავდება და გარდაიქმნება ერთჯაჭვიან მდგომარეობაში;

2) სავალდებულო (ანილირება) პრაიმერები: შერჩეული პრაიმერებისთვის ოპტიმალურ ტემპერატურაზე ისინი უკავშირდებიან შაბლონის დნმ-ის კომპლემენტარულ რეგიონს;

3)დრეკადობა, ან ჯაჭვის გახანგრძლივება: დნმ პოლიმერაზა ამატებს ნუკლეოტიდებს პრაიმერებს, სინთეზირებს დნმ-ის ახალ ძაფებს, რომლებიც ხდება პრაიმერების სამიზნე შემდგომი PCR ციკლებში.

ყოველი ციკლის ეტაპების შეცვლა ხორციელდება რეაქციული ნარევის ტემპერატურის შეცვლით (იხ. ნახ. 1).

ბრინჯი. 1. PCR ციკლის ძირითადი ეტაპები

თავდაპირველად, პრაიმერებს შეუძლიათ მხოლოდ ორიგინალური დნმ-ის კონკრეტულ თანმიმდევრობასთან დაკავშირება, მაგრამ შემდგომ ციკლებში ისინი უკავშირდებიან წინა ციკლებში სინთეზირებულ ამ თანმიმდევრობის ასლებს. ამ შემთხვევაში, ძირითადი PCR პროდუქტის რაოდენობა (დნმ-ის თანმიმდევრობის ასლი, რომელიც შეზღუდულია პრაიმერებით) თეორიულად ორმაგდება თითოეულ ციკლში. თუ საწყის ციკლში იყო მხოლოდ ერთი დნმ-ის სამიზნე შესასწავლ მასალაში, პირველი ციკლის შემდეგ უკვე იქნება ორი ასლი, ორი ციკლის შემდეგ - 4 ეგზემპლარი, მესამე ციკლის შედეგი იქნება 8 ეგზემპლარი, ხოლო ოცდაათი. მეხუთე – უკვე 68 მილიარდი ეგზემპლარი (ნახ. 2).

ბრინჯი. 2. მრავალჯერადი კოპირების პროცესი
სამიზნე დნმ თანმიმდევრობის დროს
ციკლების შეცვლა

რეაქციის პროდუქტების ანალიზის მთავარი მეთოდი, რომელიც ტრადიციულად გამოიყენება მრავალ ლაბორატორიაში გაძლიერებული დნმ-ის გამოსავლენად და მისი ზომის დასადგენად, არის მეთოდი. გელის ელექტროფორეზი მოჰყვება შეღებვა დნმ-სპეციფიკური საღებავით, როგორიცაა ეთიდიუმის ბრომიდი (ნახ. 3).

კონტროლი - დნმ-ის სხვადასხვა ფრაგმენტები მათი შემადგენელი ნუკლეოტიდების ცნობილი რაოდენობით. ცნობილია, რომ სხვადასხვა ფრაგმენტებს შორის მანძილს აქვს ლოგარითმული დამოკიდებულება მათ ზომასა და მასაზე. ხაზი 1 - PCR ფრაგმენტები დაახლოებით 1850 ბაზის სიგრძის იყო აღმოჩენილი. სტრიქონები 2 და 4 არის 800 ბაზის სიგრძის ფრაგმენტები.

ბრინჯი. 3. რეაქციის პროდუქტების ანალიზი მეთოდით
გელის ელექტროფორეზი

ხაზი 3 - საჭირო ფრაგმენტები არ არის გამოვლენილი, რეაქციის შედეგი უარყოფითია. ხაზი 5 - მრავალი ხაზი ჩამოყალიბდა, რადგან პრაიმერები ავსებდნენ სხვადასხვა სიგრძის დნმ-ის რამდენიმე ფრაგმენტს: დაახლოებით 550, 800 და 1500 ფუძეს.

PCR ტექნოლოგიის გაუმჯობესება

თავდაპირველად PCR-ის ჩასატარებლად გამოიყენებოდა ჩვეულებრივი დნმ პოლიმერაზები, რომლებიც ექვემდებარებოდნენ ტემპერატურის ინაქტივაციას თითოეულ ციკლში დნმ-ის დენატურაციის ეტაპზე. პოლიმერაზას მრავალჯერ უნდა დაემატებინა სარეაქციო ნარევში, რაც საკმაოდ შრომატევადი იყო და პროცესის ავტომატიზირების საშუალებას არ აძლევდა.

რეაქცია იყენებს თერმოსტაბილური დნმ პოლიმერაზები, რომლებიც უძლებენ მაღალ ტემპერატურას PCR ციკლის ყველა ეტაპზე რამდენიმე ათეული ციკლის განმავლობაში. კომერციულად ხელმისაწვდომი თერმოსტაბილური დნმ პოლიმერაზების რაოდენობა, რომლებიც განსხვავდება მათი ზოგიერთი თვისებით, საკმაოდ დიდია. ყველაზე ხშირად გამოიყენება Taq პოლიმერაზა თავდაპირველად იზოლირებულია თერმოფილური მიკროორგანიზმებისგან თერმუს აკვატიკუსი.სხვა პოლიმერაზები უფრო ხშირად გამოიყენება სპეციფიკური PCR აპლიკაციებისთვის. თერმდგრადი პოლიმერაზების თანამედროვე კომერციული პრეპარატები, როგორც წესი, უზრუნველყოფენ სტაბილურ, გამრავლებად აქტივობას, რაც საშუალებას იძლევა გამოიყენოს PCR ტექნოლოგია სტანდარტულ ლაბორატორიულ პრაქტიკაში.

რეაქციის ნარევის ტემპერატურის შეცვლის ტექნიკური დიზაინი ასევე სწრაფად განვითარდა ბოლო დროს. თავდაპირველად, PCR ჩატარდა სამი წყლის აბაზანის გამოყენებით, დაყენებული სხვადასხვა ტემპერატურაზე: დნმ-ის დენატურაციისთვის, პრაიმერის ანეილირებისთვის და პოლიმერიზაციისთვის. საცდელი მილები ერთი წყლის აბანოდან მეორეში გადადიოდა „წრეში“, რის გამოც ტემპერატურა იცვლებოდა ციკლის სხვადასხვა ეტაპზე. ასევე არსებობდა მოწყობილობების ვარიანტები, სადაც სხვადასხვა ტემპერატურის წყალი მონაცვლეობით მიეწოდებოდა წყლის აბაზანას, რომელშიც განლაგებული იყო ტესტის მილები რეაქციის ნარევით. ამ შემთხვევებში ციკლების შეცვლას დიდი დრო დასჭირდა და პროცესის ავტომატიზაცია რთული იყო. PCR-ის ჩასატარებლად ძირითადად გამოიყენება მოწყობილობები (თერმოციკლერები),რომლებიც ავტომატურად ცვლიან ტემპერატურას მოცემული პროგრამის საფუძველზე. თერმოციკლერებში რეაქციული ნარევის მქონე მილები მოთავსებულია ლითონის ბლოკში, რომლის ტემპერატურა იცვლება დიდი სიჩქარით, რაც ამცირებს PCR-ის თითოეული ციკლის ხანგრძლივობას.

თანამედროვე თერმოციკლერები ადაპტირებულია სპეციალური თხელკედლიანი პლასტმასის მილების გამოსაყენებლად სარეაქციო ნარევისთვის, რაც აჩქარებს სითბოს გაცვლას მოწყობილობის ბლოკსა და რეაქციის ნარევს შორის და საბოლოოდ კიდევ უფრო ამცირებს რეაქციის დროს.

ამგვარად, სტანდარტული PCR შეიძლება განხორციელდეს 1-3 საათში.ბევრი მოწყობილობა იძლევა სპეციალური, დახვეწილი ტემპერატურული პროფილების დაპროგრამებას, რომლებიც აუცილებელია PCR პროცესის სპეციფიკური ცვლილებებისთვის.

PCR ტექნოლოგიის გაუმჯობესების პარალელურად განვითარდა რეაქციის პროდუქტების ანალიზის მეთოდებიც. მეთოდი გელის ელექტროფორეზი რასაც მოჰყვება შეღებვა დნმ-სპეციფიკური საღებავით, როგორიცაა ეთიდიუმის ბრომიდი, ტრადიციულად გამოიყენება მრავალ ლაბორატორიაში გაძლიერებული დნმ-ის გამოსავლენად და მისი ზომის დასადგენად. გამოყენება ჰიბრიდიზაცია შიდა დნმ-ის ზონდებით ზოგიერთ შემთხვევაში საშუალებას იძლევა მნიშვნელოვნად გაზარდოს PCR პროდუქტების გამოვლენის მგრძნობელობა და სპეციფიკა. ელექტროფორეზული განცალკევების მომზადებისა და შესრულების აუცილებლობის აღმოფხვრით, დიდი რაოდენობით ნიმუშების ანალიზის ავტომატიზაციის შესაძლებლობით და არარადიოაქტიური გამოვლენის ფორმატის გამოყენებით, ეს მეთოდი სულ უფრო გავრცელებული ხდება. ზოგიერთ შემთხვევაში, სპეციალური ფლუორესცენტური „მარკერების“ გამოყენება შესაძლებელს ხდის აკონტროლოს საბოლოო PCR პროდუქტების გაძლიერება ან გამოვლენა უშუალოდ რეაქციის მილში.

PCR-ის გამოყენება
სამედიცინო მიკრობიოლოგიაში

კლინიკური დიაგნოსტიკის მრავალ სხვადასხვა სფეროს შორის, სამედიცინო მიკრობიოლოგიას, ალბათ, წამყვანი პოზიცია უჭირავს PCR ტექნოლოგიის გამოყენებით აპლიკაციების რაოდენობასა და მრავალფეროვნებაში. ამ მეთოდის პრაქტიკაში დანერგვამ, სეროლოგიურ დიაგნოსტიკასთან ერთად, მნიშვნელოვნად გააფართოვა თანამედროვე კლინიკური მიკრობიოლოგიის შესაძლებლობები, რომელიც ჯერ კიდევ ეფუძნება მიკროორგანიზმების იზოლირებისა და კულტივირების მეთოდებს ხელოვნურ საკვებ გარემოზე ან უჯრედულ კულტურაში.

ტრადიციულის შესაძლებლობები და შეზღუდვები
გაშენების მეთოდები

მიკრობიოლოგიური ლაბორატორიების ტრადიციული კულტურის დიაგნოსტიკური მეთოდი, როგორც წესი, კარგად მუშაობს ისეთი თვისებების იდენტიფიცირებისთვის და შესასწავლად, როგორიცაა ანტიბიოტიკებისადმი მგრძნობელობა და ადვილად კულტივირებული მიკროორგანიზმების ვირუსულობა. თუმცა, ზოგიერთი მიკროორგანიზმი (პნევმოკოკები, ჰემოფილუსი, ნეისერია, მიკოპლაზმები, ობლიგატური ანაერობები და ა. ინ ვიტრომხოლოდ უჯრედულ კულტურაში (ვირუსები, ქლამიდია, რიკეტზია).

მიკროორგანიზმების ნელი ზრდა, როგორიცაა მიკობაქტერიები და სოკოები ხელოვნურ მედიაზე, არის კიდევ ერთი ბუნებრივი შეზღუდვა, რომელიც დაკავშირებულია ამ მიკროორგანიზმების დიაგნოსტიკისთვის კულტურის მეთოდების გამოყენებასთან. გარდა ამისა, იზოლირებული პათოგენების ცოცხალ კულტურებთან მუშაობამ, არა მხოლოდ განსაკუთრებით საშიში, არამედ ზოგჯერ ოპორტუნისტული პათოგენებიც, შეიძლება საფრთხე შეუქმნას ლაბორატორიის პერსონალის ჯანმრთელობას.

ადამიანის დაავადებების გამომწვევ აგენტებს შორის ცნობილია აგრეთვე ბაქტერიების არაკულტურული სახეობები, მაგალითად Mycobacterium leprae, Treponema pallidum,და მრავალი სახის ვირუსი, მათ შორის ადამიანის პაპილომა და C ჰეპატიტის ვირუსები, უჯრედულ კულტურაში მათი ზრდის მცდელობები ჯერჯერობით წარუმატებელია. დაბოლოს, წარმატებული კულტივირების შემთხვევაშიც კი საჭიროა იზოლირებული მიკროორგანიზმების შემდგომი იდენტიფიკაცია.

ტრადიციული მიკრობიოლოგიური იდენტიფიკაციის მეთოდები დაფუძნებულია სხვადასხვა ფენოტიპური ტესტების გამოყენებაზე, როგორიცაა სპეციფიკური ფერმენტული აქტივობის გამოვლენა, შაქრის მეტაბოლიზმის უნარი ან შერჩევითი დანამატებით მედიაზე ზრდის მხარდაჭერა. ასეთი ტესტების პირობების სტანდარტიზაციის სირთულემ, ისევე როგორც მრავალი მიკროორგანიზმისთვის დამახასიათებელი ბუნებრივი ფენოტიპური ცვალებადობა, შეიძლება გამოიწვიოს არასწორი იდენტიფიკაცია.

PCR-ის გამოყენება პირდაპირი დიაგნოზისთვის
და პათოგენების იდენტიფიცირება
ინფექციური დაავადებები

იმ შემთხვევებში, როდესაც კულტურული მეთოდების გამოყენება პრობლემურია ან ასოცირდება არასაკმარისი დიაგნოსტიკური ეფექტურობით, ბიოლოგიური გაძლიერების (ანუ ხელოვნურ გარემოზე ზრდა) ჩანაცვლების შესაძლებლობა ნუკლეინის მჟავების ფერმენტული დუბლიკაციით. ინ ვიტროსთან ერთად PCR-ის გამოყენება განსაკუთრებით მიმზიდველია. ინფექციური აგენტების დიაგნოსტიკისთვის PCR-ის გამოყენების სხვადასხვა მიდგომა არსებობს. ყველაზე გავრცელებული PCR ვარიანტი (სპეციფიკური PCR)მოიცავს დამატებითი პრაიმერების გამოყენებას კონკრეტული თანმიმდევრობადნმ დამახასიათებელია მკაცრად განსაზღვრული ტიპის მიკროორგანიზმებისთვის. მაგალითად, ძირითადი გარე მემბრანის ცილის (MOMP) კოდირების გენის კონკრეტული რეგიონის PCR გაძლიერება. Chlamydia trachomatis,არარადიოაქტიურ ჰიბრიდიზაციასთან ერთად რეაქციის პროდუქტების აღმოსაჩენად, შესაძლებელს ხდის შესწავლილ ნიმუშებში ქლამიდიური დნმ-ის ცალკეული ასლების აღმოჩენას. ამავდროულად, PCR სადიაგნოსტიკო ეფექტურობით მნიშვნელოვნად აღემატება ქლამიდიური ანტიგენის კულტივაციას და უშუალო გამოვლენის მეთოდებს (მიკროიმუნოფლუორესცენცია და ფერმენტთან დაკავშირებული იმუნოსორბენტი), რომელიც ტრადიციულად გამოიყენება C-ის გამოსავლენად. ტრაქომატი.

ასევე შესაძლებელია რამდენიმე წყვილი სახეობის სპეციფიკური პრაიმერის გამოყენება ერთ რეაქციულ მილში სხვადასხვა პათოგენების დნმ-ის ერთდროული გაძლიერებისათვის. ამ მოდიფიკაციას მულტიპლექს PCR ეწოდება. (მულტიპლექს PCR). Multiplex PCR შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვადასხვა მიკროორგანიზმების ეტიოლოგიური როლის დასადგენად, რომლებიც იწვევენ კონკრეტული ტიპის დაავადებას. მაგალითად, მრავალჯერადი PCR-ის გამოყენების ვარიანტები ორის ერთდროული გამოვლენისთვის (S. ტრაქომატიდა N.gonorrhoeaeუროგენიტალური ტრაქტის დაავადებების დროს) ან თუნდაც ოთხი პათოგენი (I. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalisდა ა.ოტიტიდიქრონიკული ჩირქოვანი ოტიტით).

PCR დიაგნოსტიკის ალტერნატიული მიდგომა გულისხმობს უნივერსალური პრაიმერების გამოყენებას, რომლებიც საშუალებას გაძლევთ გააძლიეროთ გენის ფრაგმენტები გარკვეული ტაქსონომიური ჯგუფის ყველა მიკროორგანიზმში. სახეობების რაოდენობა, რომელთა იდენტიფიცირება შესაძლებელია ამ მეთოდის გამოყენებით, შეიძლება შეიზღუდოს როგორც მცირე სისტემატური ჯგუფებით (გვარი, ოჯახი), ასევე დიდი ტაქსონებით რიგის, კლასისა და ფენის დონეზე. ამ უკანასკნელ შემთხვევაში, PCR-ის სამიზნეები ყველაზე ხშირად რიბოსომული გენებია (16S და 23S rRNA), რომლებსაც აქვთ მსგავსი სტრუქტურა სხვადასხვა პროკარიოტულ მიკროორგანიზმებში.

ამ გენების კონსერვირებული რეგიონების შემავსებელი პრაიმერების გამოყენება ბაქტერიების უმეტესი სახეობების დნმ-ის ამპლიფიკაციის საშუალებას იძლევა. შედეგად მიღებული PCR ფრაგმენტები რიბოსომული გენების შემდეგ შეიძლება გაანალიზდეს სხვადასხვა ლაბორატორიული მეთოდების გამოყენებით ბაქტერიების იდენტიფიცირებისთვის, რომლებსაც ისინი მიეკუთვნებიან. „მოლეკულური“ იდენტიფიკაციის ყველაზე ზუსტი მეთოდია გაძლიერებული დნმ-ის სრული ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობის (sequencing) დადგენა და ცნობილი სახეობების შესაბამის თანმიმდევრობებთან შედარება.

მიუხედავად ავტომატური სისტემების ხელმისაწვდომობისა, რომლებიც იყენებენ აღწერილ საიდენტიფიკაციო პრინციპს, პრაქტიკაში ჩვეულებრივ გამოიყენება ნაკლებად შრომატევადი და ძვირადღირებული მეთოდები, რაც, მიუხედავად ამისა, შესაძლებელს ხდის საიმედოდ გამოავლინოს გარკვეული განსხვავებები დნმ-ის ფრაგმენტების თანმიმდევრობაში. ყველაზე გავრცელებული მეთოდები ეფუძნება დნმ-ის დაშლის ადგილების ადგილმდებარეობის ანალიზს რესტრიქციული ფერმენტებით (RFLP მეთოდი - შეზღუდვის ფრაგმენტის სიგრძის პოლიმორფიზმი), ან დნმ-ის ელექტროფორეზული მობილურობის განსაზღვრით ერთჯაჭვიანი ფორმით (SSCP- მეთოდი ერთჯაჭვიანი კონფორმაციული პოლიმორფიზმი).

უნივერსალური პრაიმერების გამოყენებით PCR შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც სუფთა კულტურაში იზოლირებული მიკროორგანიზმების იდენტიფიცირებისთვის, ასევე პათოგენების ფართო სპექტრის უშუალო დიაგნოსტიკისთვის პირდაპირ კლინიკურ ნიმუშებში. თუმცა, უნდა აღინიშნოს, რომ "ფართო სპექტრის" PCR-ის მგრძნობელობა ზოგადად უფრო დაბალია "სპეციფიკური სპეციფიკური" ტესტირების სისტემებთან შედარებით. გარდა ამისა, უნივერსალური პრაიმერებით PCR ჩვეულებრივ არ გამოიყენება ნიმუშებისთვის, რომლებიც შეიძლება შეიცავდეს სხვადასხვა მიკროორგანიზმების დიდ რაოდენობას, სხვადასხვა სახეობის დნმ-ის გაძლიერების შედეგად მიღებული რეაქციის პროდუქტების ანალიზის სირთულის გამო.

მოლეკულური აკრეფის მეთოდები
PCR-ზე დაფუძნებული მიკროორგანიზმები

PCR ფართოდ გამოიყენება არა მხოლოდ დიაგნოსტიკისა და იდენტიფიკაციისთვის, არამედ მიკროორგანიზმების იზოლირებული შტამების გენეტიკური კავშირის (კლონურობის) ქვესახეობების ტიპებისა და ანალიზისთვის, განსაკუთრებით ეპიდემიოლოგიური კვლევების ჩატარებისას. ტრადიციულ ფენოტიპურ მეთოდებთან (ბიო-, ფაგ- და სეროტიპირება) შედარებით, PCR-ზე დაფუძნებული გენოტიპინგი გამოირჩევა მრავალფეროვნებით, დიფერენციაციის უფრო ღრმა დონით, რაოდენობრივი მეთოდების გამოყენების შესაძლებლობით შტამების იდენტურობის შესაფასებლად და მაღალი რეპროდუქციულობით. აღწერილია მრავალი გენოტიპის მეთოდი, რომლებიც შეიძლება ჩაითვალოს PCR ტექნოლოგიის წარმოებულებად.

PCR ტიპების მეთოდების მრავალფეროვნების მიუხედავად, ყველაზე მეტად საერთოა გელის ელექტროფორეზის გამოყენება თითოეული ცალკეული შტამისგან მიღებული სხვადასხვა სიგრძის დნმ-ის ფრაგმენტების გამოსაყოფად. ამავდროულად, ცალკეული ელექტროფორეზული პროფილების შედარებითი ანალიზი, ვიზუალურად ან კომპიუტერის გამოყენებით, საშუალებას იძლევა შეაფასოს შესწავლილი შტამების გენეტიკური კავშირის ხარისხი.

PCR-ის გამოყენება წამლის გამოსავლენად
წინააღმდეგობა მიკროორგანიზმებში

ბოლო დროს, PCR სულ უფრო ხშირად გამოიყენება პათოგენური მიკროორგანიზმების სხვადასხვა თვისებების შესასწავლად, კერძოდ, გარკვეული ტიპის პათოგენების რეზისტენტობის დასადგენად გარკვეული მედიკამენტების მიმართ. როგორც წესი, მიკროორგანიზმების მგრძნობელობის დასადგენად PCR-ის გამოყენება მიზანშეწონილია მხოლოდ იმ შემთხვევებში, როდესაც ტრადიციული ფენოტიპური მეთოდები არ გამოიყენება ან საკმარისად ეფექტური არ არის. მაგალითად, მგრძნობელობის განმარტება ტუბერკულოზის მიკობაქტერიატუბერკულოზის საწინააღმდეგო საშუალებებს კულტურის მეთოდების გამოყენებით ჩვეულებრივ სჭირდება 4-დან 8 კვირამდე. გარდა ამისა, ასეთ შემთხვევებში ფენოტიპური ტესტების შედეგები შეიძლება დამახინჯდეს მიკროორგანიზმების ხანგრძლივი გაშენების დროს ანტიმიკრობული პრეპარატების აქტივობის შემცირების გამო. წამლის წინააღმდეგობის მოლეკულური მექანიზმების შესწავლა M. ტუბერკულოზიდა ზოგიერთმა სხვა პათოგენმა შესაძლებელი გახადა PCR-ზე დაფუძნებული მეთოდების შემუშავება რეზისტენტობის გენეტიკური მარკერების სწრაფი იდენტიფიკაციისთვის.

ასეთი ანალიზისთვის ჩვეულებრივ გამოიყენება სუფთა კულტურაში იზოლირებული პათოგენის დნმ ან რნმ. თუმცა, ზოგიერთ შემთხვევაში არსებობს პირდაპირი PCR ანალიზის შესაძლებლობა ანტიბიოტიკორეზისტენტობისთვის პათოგენის წინასწარი გაშენების გარეშე. კლინიკური მასალის შესწავლილი ნიმუში გამოიყენება PCR-სთვის სამიზნე დნმ-ის წყაროდ, ხოლო ასლი PCR პროდუქტი გაანალიზებულია ანტიბიოტიკებისადმი რეზისტენტობასთან დაკავშირებული მუტაციების დასადგენად. მაგალითად, შემუშავებულია მეთოდი, რომელიც შესაძლებელს ხდის PCR გამოყენებით გამოვლინდეს პათოგენის რეზისტენტობა რიფამპიცინის მიმართ ტუბერკულოზური მენინგიტით დაავადებულ პაციენტებში.

ამასთან, არსებობს ბუნებრივი შეზღუდვები გენეტიკური მეთოდების გამოყენებასთან დაკავშირებით მიკროორგანიზმების წამლის წინააღმდეგობის შესაფასებლად:

მონაცემები რეზისტენტობის სპეციფიკური გენეტიკური მექანიზმების შესახებ შესაძლოა არ იყოს;

გარკვეული მედიკამენტების მიმართ რეზისტენტობა ხშირად ასოცირდება სხვადასხვა მექანიზმებთან და მუტაციებთან სხვადასხვა გენებში, რომლებიც დამოუკიდებლად მოქმედებს ფენოტიპზე.

მაგალითად, გრამუარყოფითი ბაქტერიების რეზისტენტობა ამინოგლიკოზიდური ანტიბიოტიკების მიმართ შეიძლება გამოწვეული იყოს სხვადასხვა ამინოგლიკოზიდის მოდიფიკაციის ფერმენტების წარმოებით ან უჯრედის კედლის გამტარიანობის ცვლილებით. ამ შემთხვევაში, PCR ანალიზის შედეგები, რომელიც ყოველთვის ახასიათებს დნმ-ის მკაცრად განსაზღვრულ სპეციფიკურ მონაკვეთს, არ შეიძლება გახდეს მიკროორგანიზმის მთლიანობაში მგრძნობელობის შეფასების საფუძველი.

გარდა ამისა, ანტიმიკრობული პრეპარატების მიმართ მგრძნობელობის დასადგენად PCR-ის გამოყენების საერთაშორისო სტანდარტებისა და რეკომენდაციების არარსებობა არის დამატებითი ფაქტორი, რომელიც ზღუდავს ამ მიდგომის ფართო გამოყენების შესაძლებლობას პრაქტიკულ დიაგნოსტიკაში.

არც ისე დიდი ხნის წინ შემუშავდა ადამიანის სხვადასხვა ინფექციური დაავადების დიაგნოსტიკის სანდო, ძალიან მგრძნობიარე და სწრაფი მეთოდი. ამ მეთოდს "PCR ანალიზი" ეწოდება. რა არის ის, რა არის მისი არსი, რა მიკროორგანიზმების იდენტიფიცირება შეუძლია და როგორ მივიღოთ ის სწორად, ჩვენს სტატიაში გეტყვით.

აღმოჩენის ისტორია

კიბოს დიაგნოსტიკაში ასევე გამოიყენება PCR მეთოდები.

მეთოდის უპირატესობები

PCR დიაგნოსტიკას აქვს რამდენიმე უპირატესობა:

1. მაღალი მგრძნობელობა. მაშინაც კი, თუ მიკროორგანიზმის დნმ-ის მხოლოდ რამდენიმე მოლეკულა არსებობს, PCR ანალიზი განსაზღვრავს ინფექციის არსებობას. მეთოდი დაგეხმარებათ ქრონიკული და ლატენტური დაავადებების დროს. ხშირად ასეთ შემთხვევებში მიკროორგანიზმი სხვაგვარად არ არის კულტივირებადი.
2. კვლევისთვის შესაფერისია ნებისმიერი მასალა, მაგალითად ნერწყვი, სისხლი, გენიტალური სეკრეცია, თმა, ეპითელური უჯრედები. ყველაზე გავრცელებულია სისხლის და უროგენიტალური ნაცხის PCR ტესტი.

   

3. არ არის საჭირო კულტურების გრძელვადიანი მოყვანა. ავტომატური დიაგნოსტიკური პროცესი საშუალებას გაძლევთ მიიღოთ კვლევის შედეგები 4-5 საათის შემდეგ.
4. მეთოდი თითქმის ასი პროცენტით საიმედოა. დაფიქსირდა ცრუ უარყოფითი შედეგების მხოლოდ ცალკეული შემთხვევები.
5. მასალის ერთი ნიმუშიდან რამდენიმე ტიპის პათოგენის იდენტიფიცირების უნარი. ეს არა მხოლოდ აჩქარებს დაავადების დიაგნოსტიკის პროცესს, არამედ მნიშვნელოვნად ამცირებს მატერიალურ ხარჯებს. ხშირად ექიმი დანიშნავს კომპლექსურ PCR ტესტს. გამოკვლევის ღირებულება, რომელიც შედგება ექვსი პათოგენის იდენტიფიცირებისგან, დაახლოებით 1500 რუბლს შეადგენს.

იმისათვის, რომ შედეგები იყოს სანდო PCR კვლევის ჩატარებისას, თქვენ უნდა გაიაროთ ტესტი დიაგნოზის წინასწარი მომზადების რეკომენდაციების დაცვით:

1. ნერწყვის ჩაბარებამდე მასალის შეგროვებამდე 4 საათით ადრე თავი უნდა შეიკავოთ ჭამისა და მედიკამენტების მიღებისგან. პროცედურის დაწყებამდე დაუყოვნებლივ ჩამოიბანეთ პირი ადუღებული წყლით.
2. ზემოაღნიშნული წესები ასევე უნდა დაიცვან ლოყის შიდა ზედაპირიდან ნიმუშის აღებისას. ჩამობანის შემდეგ რეკომენდებულია კანის მსუბუქი მასაჟის გაკეთება ჯირკვლის სეკრეციის გასათავისუფლებლად.
3. შარდი ჩვეულებრივ გროვდება სახლში. ამისათვის საჭიროა სასქესო ორგანოების საფუძვლიანად გაწმენდა. 50-60 მლ შარდი უნდა შეგროვდეს სტერილურ პლასტმასის კონტეინერში. მასალის სისუფთავის უზრუნველსაყოფად ქალებს რეკომენდირებულია ტამპონის ჩასმა საშოში, მამაკაცებისთვის კი კანის ნაკეცის მაქსიმალურად უკან დახევა. თქვენ არ შეგიძლიათ შესწიროთ მასალა მენსტრუაციის პერიოდში.
4. სპერმის დონაციისთვის მასალის შეგროვებამდე 3 დღით ადრე თავი უნდა შეიკავოთ სქესობრივი კავშირისგან. ექიმები ასევე გვირჩევენ, თავი აარიდოთ საუნაში ვიზიტს და ცხელი აბაზანის მიღებას, ალკოჰოლისა და ცხარე საკვების მიღებას. ტესტირებამდე 3 საათით ადრე თავი უნდა შეიკავოთ შარდვისგან.
5. მაგალითად, თუ ტარდება PCR ტესტი ქლამიდიაზე, როგორც ქალებს, ასევე მამაკაცებს რეკომენდირებულია სქესობრივი დასვენება 3 დღის განმავლობაში. ტესტირებამდე 2 კვირით ადრე არ უნდა მიიღოთ ანტიბაქტერიული პრეპარატები. ერთი კვირის განმავლობაში თქვენ უნდა შეწყვიტოთ ინტიმური გელების, მალამოების, ვაგინალური სუპოზიტორების და დუშის გამოყენება. ტესტირებამდე 3 საათით ადრე თავი უნდა შეიკავოთ შარდვისგან. მენსტრუაციის დროს მასალა არ გროვდება, სისხლდენის შეწყვეტიდან მხოლოდ 3 დღის შემდეგ შეიძლება უროგენიტალური ნაცხის აღება.

PCR ორსულობის დროს

ბავშვის მოლოდინში ბევრი სქესობრივი გზით გადამდები ინფექციური დაავადება უკიდურესად საშიშია ნაყოფის ნორმალური განვითარებისთვის. სგგდ-ებმა შეიძლება გამოიწვიოს საშვილოსნოსშიდა ზრდის შეფერხება, სპონტანური აბორტი ან ნაადრევი მშობიარობა და ბავშვის თანდაყოლილი დეფექტები. ამიტომ ძალზე მნიშვნელოვანია ორსულობის ადრეულ ეტაპზე PCR ტესტის ჩატარება. ტესტი უნდა ჩატარდეს რეგისტრაციისას - 12 კვირამდე.



მასალის შეგროვება ხდება საშვილოსნოს ყელის არხიდან სპეციალური ფუნჯის გამოყენებით. პროცედურა უმტკივნეულოა და არ წარმოადგენს საფრთხეს ბავშვისთვის. როგორც წესი, ორსულობის დროს, ანალიზი ტარდება ქლამიდიაზე PCR მეთოდის გამოყენებით, ასევე ურეთაპლაზმოზის, მიკოპლაზმოზის, ციტომეგალოვირუსის, ჰერპესისა და პაპილომავირუსისთვის. გამოკვლევების ამ კომპლექტს PCR-6 ეწოდება.

PCR აივ დიაგნოზისთვის

იმის გამო, რომ მეთოდი ძალიან მგრძნობიარეა სხეულის ცვლილებებისა და დიაგნოსტიკური პირობების მიმართ, ბევრმა ფაქტორმა შეიძლება გავლენა მოახდინოს შედეგზე. ამიტომ აივ ინფექციის PCR ანალიზი არ არის სანდო მეთოდი, მისი ეფექტურობა 96-98%-ია. დანარჩენ 2-4%-ში ტესტი იძლევა ცრუ დადებით შედეგებს.

მაგრამ ზოგიერთ სიტუაციაში, აივ-ის PCR დიაგნოსტიკის გარეშე შეუძლებელია. ჩვეულებრივ ტარდება ცრუ უარყოფითი ELISA შედეგის მქონე ადამიანებზე. ასეთი მაჩვენებლები მიუთითებს იმაზე, რომ ადამიანს ჯერ არ განუვითარებია ვირუსის საწინააღმდეგო ანტისხეულები და მათი გამოვლენა რიცხვის მრავალჯერადი გაზრდის გარეშე შეუძლებელია. ეს არის ზუსტად ის, რისი მიღწევაც შესაძლებელია PCR მეთოდით სისხლის ანალიზის ჩატარებით.

ასეთი დიაგნოსტიკა აუცილებელია აივ-დადებითი დედისგან დაბადებული ცხოვრების პირველი წლის ბავშვებისთვისაც. მეთოდი ბავშვის სტატუსის საიმედოდ განსაზღვრის ერთადერთი გზაა.

PCR ჰეპატიტის დიაგნოსტიკისთვის

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის მეთოდი საშუალებას გაძლევთ ამოიცნოთ A, B, C ჰეპატიტის ვირუსის დნმ ინფექციის მიმართ ანტისხეულების წარმოქმნამდე ან დაავადების სიმპტომების გამოვლენამდე დიდი ხნით ადრე. განსაკუთრებით ეფექტურია C ჰეპატიტის PCR ტესტი, ვინაიდან 85% შემთხვევაში ეს დაავადება უსიმპტომოდ მიმდინარეობს და დროული მკურნალობის გარეშე ქრონიკული ხდება.



პათოგენის დროული გამოვლენა ხელს შეუწყობს გართულებების თავიდან აცილებას და გრძელვადიან მკურნალობას.

ყოვლისმომცველი PCR გამოკვლევა

ყოვლისმომცველი PCR ანალიზი: გამოკვლევა პოლიმეზური ჯაჭვური რეაქციის მეთოდით, რომელიც მოიცავს ინფექციების რამდენიმე სახეობის ერთდროულ დადგენას: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, ციტომეგალოვირუსი, ჰერპესის ტიპი 1 და 2, გონორეა. ასეთი დიაგნოსტიკის ფასი 2000-დან 3500 რუბლამდე მერყეობს. კლინიკის, გამოყენებული მასალებისა და აღჭურვილობის მიხედვით, ასევე ანალიზის სახეობიდან: ხარისხობრივი ან რაოდენობრივი. ექიმი გადაწყვეტს რომელია საჭირო თქვენს შემთხვევაში. ზოგიერთ შემთხვევაში, საკმარისია უბრალოდ დადგინდეს პათოგენის არსებობა; ზოგიერთში, მაგალითად, აივ ინფექციით, რაოდენობრივი ტიტრი მნიშვნელოვან როლს ასრულებს. ყველა ზემოთ ჩამოთვლილი პათოგენის დიაგნოსტიკისას, გამოკვლევას ეწოდება "PCR-12 ანალიზი".

ანალიზის შედეგების გაშიფვრა

PCR ანალიზის გაშიფვრა არ არის რთული. არსებობს მხოლოდ 2 ინდიკატორის მასშტაბი - "დადებითი შედეგი" და "უარყოფითი შედეგი". თუ პათოგენი გამოვლინდა, ექიმებს შეუძლიათ 99% დარწმუნებით დაადასტურონ დაავადების არსებობა და დაიწყოს პაციენტის მკურნალობა. ინფექციის დადგენის რაოდენობრივი მეთოდით, გამოვლენილი ბაქტერიების რიცხვითი მაჩვენებელი მითითებული იქნება შესაბამის სვეტში. მხოლოდ ექიმს შეუძლია განსაზღვროს დაავადების ხარისხი და დანიშნოს აუცილებელი მკურნალობა.



ზოგიერთ შემთხვევაში, მაგალითად, აივ ინფექციის PCR მეთოდით დადგენისას, თუ შედეგი უარყოფითია, საჭირო ხდება დამატებითი გამოკვლევების ჩატარება მიღებული მაჩვენებლების დასადასტურებლად.

სად შეიძლება გავიკეთო ტესტირება?

სად უნდა გავიაროთ PCR ტესტი: საჯარო კლინიკაში თუ კერძო ლაბორატორიაში? სამწუხაროდ, მუნიციპალურ სამედიცინო დაწესებულებებში აღჭურვილობა და მეთოდები ხშირად მოძველებულია. ამიტომ უმჯობესია უპირატესობა მიენიჭოს კერძო ლაბორატორიებს თანამედროვე აპარატურით და მაღალკვალიფიციური პერსონალით. გარდა ამისა, კერძო კლინიკაში გაცილებით სწრაფად მიიღებთ შედეგს.

მოსკოვში ბევრი კერძო ლაბორატორია გვთავაზობს PCR ტესტირებას სხვადასხვა ინფექციაზე. მაგალითად, ისეთ კლინიკებში, როგორიცაა "ვიტა", "კომპლექსური კლინიკა", "ბედნიერი ოჯახი", "ურო-პრო", ტარდება PCR ანალიზი. შემოწმების ფასი 200 რუბლიდან. ერთი პათოგენის იდენტიფიცირებისთვის.

შეიძლება დავასკვნათ, რომ ინფექციური დაავადებების დიაგნოსტიკა PCR მეთოდით უმეტეს შემთხვევაში არის სწრაფი და საიმედო გზა ორგანიზმში ინფექციის ადრეულ სტადიაზე გამომწვევის გამოსავლენად. მაგრამ მაინც, ზოგიერთ შემთხვევაში ღირს სხვა დიაგნოსტიკური მეთოდების არჩევა. მხოლოდ სპეციალისტს შეუძლია განსაზღვროს ასეთი კვლევის საჭიროება. PCR ანალიზის გაშიფვრა ასევე მოითხოვს პროფესიონალურ მიდგომას. მიჰყევით ექიმის რეკომენდაციებს და თავად ნუ ჩაიტარებთ ზედმეტ ტესტებს.