Anvendelse av proteinteknikk. Lokalisert mutagenese og proteinutvikling Hvilke typer restriktaser kjenner du til
-- [ Side 1 ] --
Utdannings- og metodisk støtte for opplæring av personell til høyere utdanningsprogram
profesjonell utdanning for den tematiske retningen til NNS "Nanobiotechnologies"
Sett 2
PROTEINTEKNIKK
NOUDPO "Institute "IT"
Læremiddel. Del 1: ForelesningsteksterLæremiddel. Del 2: Retningslinjer for studiet av disiplinen
Utdanningsmateriell for praktiske timer, seminarer, laboratoriearbeid og forretningsspill
Didaktisk materiell for arbeidet til lærerstaben. Pedagogisk video- og lydmateriell, lysbilder, skisser av plakater.
Pedagogisk og metodisk støtte for opplæring av personell i programmene for høyere profesjonsutdanning for den tematiske retningen til NNS "Nanobioteknologier"
Sett seksjon 4. Pedagogisk og metodisk støtte for forberedelse av master i programmene for høyere profesjonsutdanning i retning av opplæring "Nanoteknologi"
med treningsprofilen "Nanobioteknologi"
UTDANNINGS- OG METODOLOGISK KOMPLEKS FOR MASTER I DISKIPLINEN
PROTEINTEKNIKK
UTDANNINGS- OG METODOLOGISK HJELP
DEL 1: FORELSNINGSTEKSTER
NOUDPO "Institute "IT" Introduksjon1. Fag og oppgaver for proteinteknikk
2. Problemstilling og eksperiment i proteinteknikk
3. Genteknologiske metoder for proteinutvikling
Cellefritt uttrykkssystem.
5. Genekspresjon og preparativ fremstilling av målproteiner i praktisk proteinteknikk
6. Renaturering av genetisk konstruerte proteiner
Introduksjon av biologisk aktivitet i kunstige proteiner
8. Eliminering av individuell biologisk aktivitet i rekombinante proteiner
Litteratur
UDC 577. LBC 28.
INTRODUKSJON
Oppgaven til disiplinen «Protein Engineering» er å lære studentene grunnleggende kunnskap om emnet, som omfatter både grunnleggende teoretiske begreper og praktiske metoder for å arbeide med gener og rekombinante proteiner, deres rettet endring og forskning. Kursopplegget omfatter områder som genteknologiske grunnleggende for proteinteknikk (kloning og genekspresjon, polymerasekjedereaksjon, mutagenese), grunnleggende metoder for å oppnå rekombinante proteiner i ulike ekspresjonssystemer, isolering og rensing av proteiner (inkludert renaturering), grunnleggende metoder for studere rekombinante proteiner.Emnet skal forberede studentene til å gjennomføre arbeidet med en workshop om proteinteknikk, kurs- og diplomprosjekter knyttet til produksjon og studier av rekombinante proteiner. Delene i kurset dekker emner som emnet og oppgaver innen proteinteknikk, genteknologiske metoder for proteinteknologi, problemstilling og eksperimentering, genekspresjonssystemer og deres bruk i praktisk proteinteknikk, ekspresjonsoptimalisering og preparativ produksjon av proteiner i proteinteknikk , renaturering og rensing genetisk konstruerte proteiner. På konkrete eksempler på arbeidet til Institutt for bioteknikk vurderes slike oppgaver som å skaffe kunstige proteiner med en gitt struktur og egenskaper og å introdusere/eliminere gitte biologiske aktiviteter. Generelt er disiplinen "Protein Engineering" en del av opplæringen av mastere innen "Nanobioteknologi", den er viet til å jobbe med en av de viktigste biologiske nanoobjektene - proteiner og er nært knyttet til andre disipliner av kurset.
Proteinteknikk er en gren av molekylærbiologi og bioteknikk, som har som formål å målbevisst endre strukturen til naturlige proteiner og skaffe nye proteiner med ønskede egenskaper. Proteiner er det viktigste biologiske objektet, uten hvilket liv ikke kan eksistere, derfor er proteinteknologi en integrert del av konstruksjonen av biologiske nanostrukturer. Naturlige proteiner er tilpasset til å fungere i levende organismer, men de er ofte ikke egnet for bruk i bioteknologi og medisin i sin opprinnelige form – de må «optimeres» for menneskelige behov. Det er denne optimaliseringen som utgjør oppgaven med proteinutvikling.
Proteinteknikk oppsto på begynnelsen av 80-tallet av 1900-tallet, da hovedmetodene for genteknologi ble utviklet, som gjorde det mulig å skaffe ulike naturlige proteiner ved hjelp av bakterier eller gjær, samt å endre strukturen til gener på en bestemt måte og følgelig aminosyresekvensen til proteinene kodet av dem. En nødvendig betingelse for fremveksten av proteinteknikk var utviklingen av metoder for kjemisk syntese av oligonukleotider, som gjorde det mulig å lage kunstige genfragmenter og hele gener, samt utvikling av teoretiske metoder for å forutsi og analysere strukturen til proteiner. og fysiske metoder for deres studier. Basert på prinsippene for organisering av proteinmolekyler, forholdet mellom struktur og funksjon av proteiner, vil proteinteknikk skape en vitenskapelig basert teknologi for rettet endringer i deres struktur. Ved hjelp av proteinteknikk vil det være mulig å øke den termiske stabiliteten til proteiner, deres motstand mot denaturerende effekter, organiske løsningsmidler, og endre de ligandbindende egenskapene. Proteinteknologi tillater, ved å erstatte aminosyrer, å forbedre funksjonen til enzymer og deres spesifisitet, endre de optimale pH-verdiene som enzymet virker ved, eliminere uønskede sideaktiviteter, eliminere molekylære områder som hemmer enzymatiske reaksjoner, øke effektiviteten til protein narkotika osv. For eksempel tillot erstatningen av bare én treoninrest med prolin en 50 ganger økning i aktiviteten til tyrosyl-tRNA-syntetaseenzymet, og på grunn av erstatningen av 8 aminosyrerester, fikk den termolysinlignende proteasen fra Bacillus stearothermophilus evne til å opprettholde aktivitet ved 1000C i flere timer. Proteinteknikk inkluderer også arbeid med målrettede endringer i egenskapene til proteiner ved bruk av kjemiske modifikasjoner, for eksempel introduksjon av fotoaktiverte forbindelser som endrer egenskapene til et molekyl under påvirkning av lys, merker forbindelser som gjør det mulig å spore veiene til et protein i en celle eller dirigere den til ulike komponenter i en celle osv. .d. Slikt arbeid utføres hovedsakelig på rekombinante proteiner oppnådd ved bruk av genteknologiske metoder.
Det er to retninger i moderne proteinteknikk:
rasjonell design og rettet molekylær utvikling av proteiner. Den første innebærer bruk av informasjon om de strukturelle-funksjonelle relasjonene i proteiner, oppnådd ved bruk av fysiokjemiske og biologiske metoder, samt datamolekylær modellering, for å bestemme hvilke endringer i primærstrukturen som skal føre til ønsket resultat. For å øke den termiske stabiliteten til et protein, er det derfor nødvendig å bestemme dets romlige struktur og identifisere "svake" områder, for eksempel aminosyrer som ikke er sterkt assosiert med miljøet. Velg deretter de beste alternativene for erstatninger for andre aminosyrer for dem ved å bruke molekylær modellering og optimalisering av energiparametrene til molekylet. Etter det må du mutere det tilsvarende genet, og deretter få og studere mutantproteinet. Hvis dette proteinet ikke oppfyller de angitte parameterne, utfør en ny analyse og gjenta den beskrevne syklusen.
Denne retningen er mest adekvat uttrykt når det gjelder å konstruere kunstige proteiner (proteiner de novo) med ønskede egenskaper, når input er en ny aminosyresekvens av proteinet, hovedsakelig eller fullstendig spesifisert av mennesket, og utgangen er et proteinmolekyl med de ønskede egenskapene. Så langt kan imidlertid bare små de novo-proteiner med en enkel romlig struktur oppnås på denne måten, og enkle funksjonelle aktiviteter kan introduseres i dem, for eksempel metallbindingsseter eller korte peptidfragmenter som bærer en hvilken som helst biologisk funksjon.
I den regisserte molekylære utviklingen av proteiner oppnås et stort sett av forskjellige mutante gener av målproteinet ved hjelp av genteknologiske metoder, som deretter uttrykkes på en spesiell måte, for eksempel på overflaten av fager ("fagvisning") eller i bakterieceller, for å tillate seleksjon av mutanter med de beste egenskapene. For dette formål integreres for eksempel genene til det ønskede proteinet eller dets deler i faggenomet som en del av genet som koder for proteinet lokalisert på overflaten av fagpartikkelen. I tillegg bærer hver enkelt fag sitt eget mutante protein, som har visse egenskaper, i henhold til hvilke seleksjon gjøres. Mutante gener produseres ved å "blande" et sett med gener fra lignende naturlig forekommende proteiner fra forskjellige organismer, typisk ved polymerasekjedereaksjon, slik at hvert resulterende mutantprotein kan inkludere fragmenter av mange av "foreldre"-proteinene. I hovedsak etterligner denne tilnærmingen den naturlige utviklingen av proteiner, men bare i et mye raskere tempo. Hovedoppgaven til en proteiningeniør i dette tilfellet er å utvikle et effektivt seleksjonssystem som gjør det mulig å velge de beste mutante proteinvariantene med de ønskede parameterne. I tilfelle av det nevnte problemet - for å øke den termiske stabiliteten til proteinet, kan seleksjon utføres for eksempel ved å dyrke celler som inneholder mutante gener ved forhøyet temperatur (forutsatt at tilstedeværelsen av et mutant protein i cellen øker dets termisk stabilitet).
Begge disse områdene innen proteinteknikk har samme mål og utfyller hverandre. Dermed gjør studiet av mutante proteinvarianter oppnådd ved hjelp av molekylære evolusjonsmetoder det mulig å bedre forstå den strukturelle og funksjonelle organiseringen av proteinmolekyler og bruke kunnskapen som er oppnådd for målrettet rasjonell design av nye proteiner. Videreutvikling av proteinteknikk gir en mulighet til å løse mange praktiske problemer med å forbedre naturlige og skaffe nye proteiner for behovene til medisin, landbruk og bioteknologi. I fremtiden er det mulig å lage proteiner med funksjoner som er ukjente i naturen.
Dette proteiningeniørkurset inkluderer både grunnleggende teoretiske konsepter og praktiske metoder for å arbeide med gener og rekombinante proteiner, deres rettet modifikasjon og forskning. Dette kurset er uløselig knyttet til andre disipliner i masterprogrammet, først og fremst med disiplinen "Molecular Bioengineering", som det faktisk er. Proteinteknikk og rasjonell design av proteiner inkluderer nødvendigvis elementer av datamodellering, derfor er de assosiert med disiplinen "Molecular modellering av nano- og biostrukturer" og den mer generelle disiplinen "Datateknologi i vitenskap og utdanning". Studiet av egenskapene til rekombinante proteiner oppnådd ved bruk av proteinteknikk krever bruk av moderne metoder for deres studier, for eksempel konfokal og atomkraftmikroskopi, computertomografi og elektronmikroskopi; derfor er proteinteknikk assosiert med de relevante disiplinene viet til disse metoder. Formålet med proteinteknikk er protein-nanostrukturer, så forbindelsen med disiplinen "Fundamentals of Nano- and Biosafety" er åpenbar. Dermed er disiplinen "Protein Engineering" en integrert del av opplæringen av mestere innen "Nanobioteknologi" i retningen "Nanoteknologi".
Kontrolløvelser, spørsmål om innholdet i avsnittet 1. Definer begrepet "Protein engineering" 2. Hvordan skiller protein engineering seg fra andre typer engineering?
3. Hva er forutsetningene for fremveksten av proteinteknikk?
4. Hvilke problemer kan proteinteknikk løse?
5. Hvilke områder innen proteinteknikk kjenner du til?
6. Hva er rettet molekylær utvikling av proteiner?
7. Hvordan er proteinteknikk relatert til andre grener av nanobioteknologi?
2. Sette problemet og gjennomføre et eksperiment i protein engineering Proteiner er den viktigste komponenten i levende organismer, de utfører en rekke funksjoner: katalytisk, regulatorisk, strukturell, transport, og andre. Proteiner består av aminosyrerester koblet i serie (primærstrukturen til et protein), som som regel danner vanlige elementer - en sekundær struktur der aminosyrerester er sammenkoblet med hydrogenbindinger. Hovedelementene i den sekundære strukturen til et protein er alfahelixen og betastrukturen, forskere identifiserer også andre, mindre vanlige regulære elementer - 310 helix, pi helix, beta bend og andre elementer som du kan lære om i en proteinfysikk kurs (A .V.Finkelstein, O.B.Ptitsyn, Protein Physics).
En del av aminosyrerestene i proteinet, noen ganger en svært betydelig del, har en uordnet struktur, som også kalles spirallignende. Vi kan betinget skille tre klasser av proteiner: globulær, fibrillær og membran, og alle tre av disse klassene er gjenstand for proteinutvikling.
Den første figuren viser hierarkiet av strukturer til et proteinmolekyl. I alfahelixstrukturen forbinder hydrogenbindinger restene i og i+3 og danner dermed helixgeometrien. I betastrukturen er tilstøtende lineære områder av aminosyresekvensen forbundet med hydrogenbindinger (en region med hydrogenbindinger vist med en stiplet linje til høyre for alfahelixen uthevet i blått i figur 1). Alfa-, beta- og andre strukturer, stablet på en bestemt måte, danner den romlige eller tertiære strukturen til proteinet. Og til slutt, proteiner kan kobles til hverandre i en kvartær struktur - et virvar av proteiner (merk imidlertid at dette ikke er en kaotisk, men en høyt ordnet floke, der hvert protein har sin egen plass).
Hva kan proteinteknikk gjøre og hvilke egenskaper ved proteiner kan proteiningeniører endre? Moderne proteinteknikk kan gjøre mye. Spesielt for enzymer tillater den følgende (tabell):
øke Vmax, det vil si den maksimale hastigheten for den enzymatiske reaksjonen, redusere Michaelis-konstanten Km, endre de optimale pH-verdiene som enzymet fungerer ved;
eliminere "dårlige" rester og proteinregioner som hemmer den enzymatiske reaksjonen;
endre spesifisiteten til enzymer.
Du kan også endre de strukturelle egenskapene til enzymer og andre proteiner:
forbedre termisk stabilitet;
forbedre stabiliteten til organiske løsningsmidler;
endre de ligandbindende egenskapene.
Til slutt kan nye proteinsystemer fås:
få kimære og polyfunksjonelle proteiner - proteiner med "tags" (fra engelsk "tag" - anheng, fragment), det vil si med spesielle polypeptid-"haler", som for eksempel kan lette isolasjon og rensing, redusere toksisitet løse komplekse problemer av å forbedre effektiviteten av proteinmedisiner for å lage helt nye kunstige ("de novo") proteiner med en gitt struktur og Et stort antall arbeider om proteinteknologi er beskrevet i litteraturen, og videre i dette kurset vil vi vurdere i detalj noen typiske arbeider utført ved Institutt for proteinteknikk. La oss starte med å vurdere hovedstadiene i arbeidet til en proteiningeniør - skjemaet for eksperimentet.
Problemstilling, analyse, modellering Produksjon av et ekspresjonssystem (plasmid, ekspresjonsoptimalisering, proteinproduksjon) Rekombinant proteinforskning Først må forskeren bestemme hvilket proteinobjekt og hvorfor han skal jobbe - dette er stadiet av problemstilling, som krever innhenting av nødvendig informasjon, analysering av litteratur, eventuelt modellering.Deretter må du få genet til proteinet du skal jobbe med. Dette er et ganske enkelt trinn - genet kan fås for eksempel ved kloning med cDNA , det vil si med kunstig (ved hjelp av et spesielt enzym) oppnådd DNA, komplementært til organismens budbringer-RNA, som koder for alle dens proteiner (kromosomalt DNA er verre i denne forstand, fordi gener i det kan bli avbrutt av introner, dvs. ikke-kodende regioner.) Et gen kan også syntetiseres kjemisk, noe som noen ganger er å foretrekke, fordi sjeldne kodoner kan fjernes umiddelbart, og hindrer genuttrykk. Til slutt kan du ganske enkelt spørre kolleger (hvis det allerede er oppnådd et sted) - i full kan gi og til og med sende fra utlandet. Da må du få et uttrykkssystem, det vil si å velge organismen du skal produsere proteinet i og få den til å produsere proteinet ditt effektivt. Vanligvis har vi E. coli, men du kan bruke både gjær- og insektceller - baculovirussystemet - og pattedyrceller og det cellefrie ekspresjonssystemet. Opprettelsen av et ekspresjonssystem inkluderer å oppnå et ekspresjonsplasmid og optimalisering av ekspresjonen, dvs. valg av betingelser under hvilke systemet vil produsere den største mengden proteinprodukt (eller den største andelen løselig protein, eller den største andelen protein i inklusjonslegemer). avhengig av det spesifikke objektet og ytterligere ordninger for dets isolering og rensing). Dette er en vanskeligere oppgave, som ikke alltid er mulig å løse. Problemer kan være forskjellige - et protein som er giftig for cellen, dets raske forfall, feil folding av proteinet og som et resultat mangel på nødvendig aktivitet, etc. Men hvis disse problemene kan overvinnes og proteinet til slutt oppnås, kan det studeres i detalj ved forskjellige fysisk-kjemiske metoder, analyseres, forstå hvordan det fungerer og bestemme hva som må endres og hvorfor, det vil si sette en oppgave for arbeidet av en proteiningeniør. Noen ganger hender det også at ingenting må endres – for eksempel har man fått et protein som er viktig for medisin, som allerede fungerer bra. Men selv i disse tilfellene dukker det ofte opp interessante spørsmål og oppgaver som krever arbeid fra en proteiningeniør. Og når vi vet at vi ønsker å forbedre, hvilken eller hvilke rester som skal endres, bruker vi mutagenese, får mutante gener med nødvendige aminosyresubstitusjoner, og går igjen tilbake til begynnelsen av ordningen. Syklusen gjentas, forskning er i gang igjen, analyse av resultatet, kanskje sette neste oppgave osv. Og derfor må du noen ganger gå gjennom flere slike påfølgende stadier før du kan få noe virkelig nødvendig og interessant.
Kontrolløvelser, spørsmål om innholdet i avsnitt 1. Hvilke elementer av proteinstrukturer kjenner du til?
2. Beskriv opplegget for eksperimentet i proteinteknikk.
3. Kom med en eksempeloppgave for en proteiningeniør.
4. Hvilke egenskaper ved proteiner kan endres ved hjelp av proteinteknikk?
5. Hva er handlingsrekkefølgen til en proteiningeniør for å løse et typisk problem? Dette er først og fremst restriksjon og ligering av plasmider og DNA-fragmenter, bruk av polymeraser, inkludert termostabile polymeraser for polymerasekjedereaksjonen, og mutagenese.
De viktigste enzymene som brukes i gen- og proteinteknikk er spesifikke endonukleaser - restriksjonsenzymer, ved hjelp av hvilke DNA-fragmenter med reproduserbar sammensetning og lengde oppnås, samt DNA-ligaser som kombinerer disse fragmentene.
Restriksjonsenzymer og metylaser I bakterier hydrolyseres (begrenses) fremmed DNA som trenger inn i celler ved hjelp av spesielle endonukleaser - restriksjonsenzymer, som er elementer it. Restriksjonsenzymer gjenkjenner i fremmed DNA visse nukleotidsekvenser som er spesifikke for hvert enzym - gjenkjenningssteder - og deler dette DNA i separate fragmenter. Restriksjonsenzymer ødelegger ikke sitt eget DNA, siden det er modifisert i de samme områdene av stedsspesifikke metylaser. Metylaser er enzymer som fester en metylgruppe til visse nitrogenholdige baser i DNA. De brukes praktisk talt ikke i proteinteknikk, men det er nødvendig å huske deres eksistens under restriksjon, siden de (mer presist, resultatet av arbeidet deres - metylering) kan forhindre DNA-spaltning av restriksjonsenzymer. Restriksjons- og modifikasjonsenzymer er funnet i nesten alle studerte bakteriearter. De kan også kodes av fager og plasmider. Navnet på restriktaser består av den første bokstaven i bakterieslekten, og de to første bokstavene i arten, for eksempel Bacillus subtilis - Bsu, E. coli - Eco. Om nødvendig gis en typekarakterisering av stammen, for eksempel betegner Hinc et enzym fra Haemophilus influenzae-celler med serotype c. Ulike restriksjonssystemer av samme bakterieart er nummerert med romertall (PvuI og PvuII fra Proteus vulgaris, AvaI og AvaII fra Anabaena variabilis). Tatt i betraktning hovedegenskapene tilne, er de delt inn i 4 klasser. Forskjellene relaterer seg til: strukturell underenhet, behov for kofaktorer, symmetri av gjenkjenningssteder; posisjoner til skjæreplasser i forhold til gjenkjennelsessteder.
En mer detaljert beskrivelse av ulike restriktaser finnes i lærebøker om genteknologi, men av hensyn til praktisk proteinteknologi er vi først og fremst interessert i annenrangs restriktaser som gjenkjenner en symmetrisk sekvens på 4-8 nukleotider (de kan også inneholde flere ytterligere nukleotider i form av ikke-spesifikke inserts). Skjæringsstedene faller sammen med gjenkjennelsesstedene eller er plassert ved siden av dem i en strengt definert avstand, noe som gjør det mulig å oppnå begrensninger med en strengt definert lengde. Derfor er de mye brukt til en rekke formål, for eksempel fysisk kartlegging av DNA, analyse av DNA-polymorfisme, genteknologi av rekombinante molekyler in vitro; restriktiv kan brukes som utgangspunkt for DNA-sekvensering mv. Restriksjonsenzymer av den andre klassen er delt inn i 2 typer i henhold til metoden for splitting. Noen utfører et trinnvis kutt av trådene, dvs.
posisjoner av hydrolyserbare bindinger på forskjellige DNA-tråder samsvarer ikke. Som et resultat dannes utstående enkeltstrengsender i DNA-fragmenter. Åpenbart, på steder av kutt, er de utstikkende nukleotidsekvensene relatert til forskjellige DNA-tråder komplementære (klebrige) (Figur 3). I dette tilfellet kan både 5'-ender (for eksempel når DNA behandles med EcoRI-restriktase) og 3'-ender (for eksempel når DNA behandles med PstI-restriktase) stikke ut. Andre restriktaser av den andre klassen utfører et direkte kutt av DNA-tråder - matchende bindinger spaltes. Som et resultat dannes rette (stumpe) ender i DNA-fragmenter (for eksempel når DNA behandles med Smal-restriksjonsenzym).
5'-N-N-С-T-G-C-A-G-N- 3' PstI 5'-N-N- С-T-G-C-A-3' 5'-G-N-3' 3. Klassifisering av restriktaser i henhold til metoden for DNA-spalting.
For praktisk proteinutvikling, det vil si å oppnå DNA-fragmenter og deres påfølgende kryssbinding og/eller innføring i plasmider ved hjelp av et ligaseenzym, brukes begge, men i praksis er det mer praktisk å arbeide med klebrige ender.
Mange restriksjonsenzymer isolert fra forskjellige bakterier gjenkjenner de samme stedene på DNA.
Slike restriksjonsenzymer kalles isomerer. De er delt inn i isoschizomerer og heteroschizomerer. – noen gjenkjenner identiske steder og spalter dem på samme måte (for eksempel HindIII- og HsuI-restriktaser), mens andre spalter disse stedene annerledes (for eksempel Asp718I og KpnI). Hovedbetingelsene for arbeidet med restriktaser er en viss temperatur og sammensetning av bufferen (figur 4).
Den optimale virkningstemperaturen for de fleste restriktaser er 37°C. Men for eksempel foretrekker restriksjonsenzymet Smal 25°C, og restriktaser isolert fra termofile bakterier (for eksempel TaqI) er effektive ved 65°C. For enkelhets skyld i arbeidet, for de fleste restriktaser, er det enhetlige versjoner av bufferløsninger der restriksjonsreaksjonen utføres. En viktig betingelse for driften av restriktaser er riktig ionestyrke til bufferløsningen - ellers den såkalte.
"stjerneaktivitet", hvor restriksjonsenzymet kan miste spesifisitet, dvs.
spalte DNA ikke bare på restriksjonsstedet. Når DNA-spalting utføres av to eller flere restriksjonsenzymer, tilsettes de samtidig, forutsatt at de er i stand til å fungere korrekt i samme buffer. Ellers brukes enzymet som krever den lavere ionestyrken først. Etter dens virkning økes ionestyrken til løsningen og et andre enzym tilsettes. En typisk enzymatisk DNA-hydrolyse utføres i et volum på 20 μl, ved bruk av 0,1-1 μg DNA, 1 enhet av enzymet og en buffer for driften. En enzymenhet (en enhet av enzymaktivitet) er mengden restriksjonsenzym som kreves for å fullstendig spalte 1 µg fag-DNA på 1 time under anbefalte forhold. Men i en rekke tilfeller, når det ikke er noen gjenkjennelsessteder for et gitt restriksjonsenzym i fag-DNA, brukes andre karakteriserte molekyler - pBR322, adenoviralt DNA.
Ulike genetiske prosesser (replikasjon, rekombinasjon, reparasjon) som forekommer i cellen er ledsaget av utseendet til kallenavn i dobbelttrådete DNA-molekyler, dvs. enkelt tråd brudd. I slike molekyler holdes 3'-OH og 5'-p endene av brutte polynukleotidkjeder sammen av hydrogenbindinger til den komplementære tråden. DNA-ligaser er enzymer som forener lignende kjeder ved å gjenopprette en fosfodiesterbinding mellom to tilstøtende polynukleotider.
DNA-ligasene til E. coli og T4 fag har blitt studert mest. Energien som er nødvendig for dannelsen av kovalente bindinger, trekker disse enzymene fra kofaktorer - makroenergi NAD + (bakteriell ligase) eller ATP (fagligase). I begge tilfeller adenylerer enzymene og overfører deretter AMP til 5'-endene av polynukleotidkjedene ved bruddstedene, som er ledsaget av gjenoppretting av makroenergetiske pyrofosfatbindinger. Energien som lagres på denne måten brukes på dannelsen av fosfodiesterbindinger mellom tilstøtende 3'-OH og 5'-p-terminaler, noe som fører til helbredelse av hakk og frigjøring av AMP. Bakterie- og fag-DNA-ligaser brukes for tverrbinding (ligering) av restriksjonen. Den optimale temperaturen for DNA-ligering i hakk er 37 °C, men ved denne temperaturen er energien til hydrogenbindinger mellom de klebrige endene av restriksjonen ikke nok til å holde dem i leddkomplekset på tidspunktet for reaksjonen. Derfor utføres restriksjonsligering ved lave temperaturer (4–12°C). T4-fag DNA-ligase brukes i reaksjonen ved å kombinere dobbelttrådete DNA-fragmenter som inneholder stumpe ender. Det katalyserer dannelsen av fosfodiesterbindinger i begge trådene.
Stumpende ligering utføres vanligvis ved temperaturer på 16-22°C.
DNA-polymeraser er enzymer som leder templat-DNA-syntese i 5'3'-retningen. For dette formålet krever de definitivt en primer med en fri 3'OH-gruppe. La oss bli kjent med DNA-polymeraser mer detaljert ved å bruke eksemplet med E. coli DNA-polymerase I.
E. coli DNA-polymerase I. Dette enzymet består av én polypeptidkjede og har tre typer aktivitet. Polymeraseaktivitet forårsaker syntesen av DNA-tråden i 5'3'-retningen. Det utføres på en enkeltstrenget mal i nærvær av dNTP ved å tilsette nukleotidrester til 3'OH-terminalen av den komplementære tråden, som i dette tilfellet er primeren. Eksonukleaseaktivitet i 5'3'-retningen forårsaker spaltning av nukleotider fra 5'p-endene av dobbelttrådete DNA-molekyler og fører til nedbrytning av dem. Eksonukleaseaktivitet i 3'5'-retningen fører til spaltning av nukleotider fra 3'OH-endene av enkelt- og dobbelttrådete DNA-molekyler. Denne aktiviteten på dobbelttrådet DNA blokkeres av 5'3'-polymeraseaktivitet. Denne DNA-polymerasen kan samtidig polymerisere og hydrolysere nukleotidkjeden i 5'3'-retningen, og starter med et enkeltstrengsbrudd (nick) i dobbelttrådet DNA. I dette tilfellet beveger kallenavnet seg langs DNA-kjeden (denne prosessen kalles kallenavnoversettelse), som brukes til å introdusere merkede nukleotider i DNA in vitro. Tidligere ble det også brukt i syntesen av den andre strengen av cDNA, for tiden brukes revers transkriptase eller Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I til dette formålet. Et domene kalt Klenow-fragmentet, som beholder polymerasen og 3'5' eksonukleaseaktivitet. Fraværet av eksonukleaseaktivitet i 5'3'-lønnefragmentet gjør det mulig å bruke det til å fylle utstående enkelttrådete 5'-ender med nukleotider, som dannes under trinnvis kutting av DNA med restriksjonsenzymer. Klenow-fragmentet brukes 1) for å stumpe klebrige DNA-ender for påfølgende ligering; 2) for syntesen av den andre cDNA-strengen; 3) for terminal inkludering av en markør i DNA-fragmenter; 4) for sekvensering etter Sanger-metoden.
Fag T4 DNA-polymerase. Dette enzymet har de samme aktivitetene som Klenow-fragmentet. Imidlertid er 3'5'-eksonukleaseaktiviteten til denne polymerasen mer effektiv.
Fag T7 DNA-polymerase. Dette enzymet har de samme aktivitetene som Klenow-fragmentet. Den består av to underenheter: T7 faggen 5-produktet og E. coli thioredoxin-aksessørproteinet. Sistnevnte øker stabiliteten til enzymmatrisekomplekset og øker polymeraseprosessiviteten med mer enn 1000 ganger.
På grunn av dette brukes den til å kopiere relativt lange matriser. For Sanger-sekvensering brukes modifikasjoner av denne polymerasen, der eksonukleaseaktiviteten undertrykkes. Disse modifikasjonene kalles sekvensaser.
Termostabile DNA-polymeraser, som vil bli diskutert senere, er mye brukt i genteknologisk praksis.
Polymerasekjedereaksjon Polymerasekjedereaksjon (PCR) er en in vitro DNA-amplifikasjonsmetode som kan isolere og multiplisere en spesifikk DNA-sekvens hundrevis av millioner ganger større enn den opprinnelige DNA-sekvensen innen 2-3 timer. Figur 4 viser skjemaet for polymerasekjedereaksjonen.
Ved amplifisering ved PCR brukes to oligonukleotidprimere, som flankerer DNA-området av interesse for oss. Effekten av multiplikasjon av en spesifikk DNA-sekvens oppnås ved gjentatt repetisjon (25-30 sykluser) av tre suksessive reaksjoner: 1) temperaturdenaturering av DNA, 2) binding (annealing) av primere til komplementære DNA-sekvenser, dvs. dannelsen av dobbelttrådete "komplekser" primer-mal som kreves for å initiere DNA-syntese;
og 3) påfølgende forlengelse av DNA-trådene fra disse primerne i 5'- til 3'-retningen av strengen, med start fra primerfestestedene, ved bruk av en termostabil DNA-polymerase. Primerne på malen er orientert på en slik måte at polymerasesyntese bare fortsetter mellom dem, og dobler antallet kopier av denne DNA-regionen. I dette tilfellet akkumuleres lange fragmenter syntetisert på den opprinnelige DNA-tråden i henhold til den aritmetiske progresjonsformelen, og korte diskrete fragmenter, begrenset i endene av primere, som først vises først på slutten av den andre PCR-syklusen, akkumuleres eksponentielt og veldig snart begynner å dominere blant forsterkningsproduktene.
Endringen i reaksjonstypen settes ved å endre temperaturen på reaksjonsblandingen.
Denatureringstemperaturen bestemmes av ionestyrken til bufferen som brukes og konsentrasjonen av destabiliserende ("denaturerende") DNA-midler (hvis noen). Jo lavere ionestyrke og jo høyere konsentrasjon av "denaturerende" midler, desto lavere temperatur er DNA denaturert. Utglødningstemperaturen bestemmes av strukturen til primeren. Polymerisasjonstemperaturen bestemmes av egenskapene til polymerasen som brukes (for eksempel er den for Taq-polymerase 72°C). For tiden er PCR-metoden automatisert, ganske enkel å utføre og tilgjengelig for ethvert molekylærbiologisk laboratorium. For å få svar på spørsmålene dine, deoksyribonukleosidtrifosfater, DNA-polymerase, konsentrert bufferløsning og plasser reagensrøret i en programmerbar termisk syklus (forsterker), som automatisk endrer temperatur i henhold til et gitt program. Antallet PCR-sykluser er begrenset på den ene siden av delvis inaktivering av polymerasen og uttømming av primere og deoksyribonukleosidtrifosfater involvert i reaksjonen, og på den annen side av det faktum at et for stort antall sykluser fører til produksjon av uspesifikke amplifikasjonsprodukter. I de fleste tilfeller er 25-30 sykluser tilstrekkelig for PCR.
Enkle dataprogrammer som Oligo kan brukes til å velge primere. Kravene til nukleotidsekvensen til primeren kan reduseres til følgende forhold: 1) fravær av en sekundær struktur (primeren må ikke danne løkker); 2) balansert sammensetning av HS, AT-par og jevn fordeling av HS, AT gjennom sekvensen; 3) primere bør ikke være homologe med hverandre.
Valget av primer-annealingstemperatur er sannsynligvis en av nøkkelfaktorene for å sikre svært spesifikk PCR. Hvis temperaturen viser seg å være for høy, vil ikke gløding forekomme, hvis den undervurderes, vil uspesifikk gløding øke kraftig, noe som fører til syntese av uspesifikke produkter.
For nøyaktig å beregne den optimale primer-annealingstemperaturen (i henhold til dens nukleotidsammensetning), er det mange forskjellige programmer og algoritmer.
En forenklet beregning kan utføres ved å bruke følgende formler:
hvis den totale lengden av oligonukleotidet ikke overstiger 20 baser.
Tm = 22 + 1,46( + (A+T)), eller hvor M er ionestyrken til løsningen, L er lengden på oligonukleotidet hvis den totale lengden av oligonukleotidet er 20-30 baser.
PCR bruker termostabile DNA-polymeraser; en av de mest populære av disse er Taq polymerase. Enzymet ble opprinnelig isolert fra den termofile bakterien Thermus aquaticus, så det er i seg selv termostabilt - det replikerer DNA ved 72°C og beholder halvparten av sin funksjonelle aktivitet etter oppvarming til 95°C i én time. Enzymet har 5'3'-eksonukleaseaktivitet, men dets redaksjonelle 3'5'-eksonukleaseaktivitet er svak. Derfor har Taq-polymerase en ganske høy prosentandel av feilaktig (ikke-komplementær) inkludering av nukleotider in vitro. De samme aktivitetene som Taq-polymerase har Tth-polymerase (isolert fra termofile bakterier Thermus thermophilus). Vent og Deep Vent DNA-polymeraser brukes ofte, som kommer fra bakterier som finnes i termiske dyphavskilder.
Polymeraser er svært termisk stabile: de beholder halvparten av sin funksjonelle aktivitet etter oppvarming ved 95 °C i 7 (ventilasjon) og 23 (dyp ventilasjon) timer. Enzymer har 3'5' eksonukleaseaktivitet, så nøyaktigheten av syntesen økes med en størrelsesorden sammenlignet med Taq-polymerase. Pfu-polymerase er et annet enzym isolert fra termofile bakterier. Den har de samme aktivitetene som Vent og Deep Vent DNA-polymeraser, mens nøyaktigheten av syntese er høyere enn for disse polymerasene.
Kloning av PCR-fragmenter. Ved kloning av et PCR-produkt er det nødvendig å huske noen funksjoner ved driften av visse termostabile polymeraser. Taq- og Tth-polymeraser har den spesifikke egenskapen å feste ytterligere adenylrester til 3'-enden av PCR-produktet. Slike fragmenter kan ikke klones, de må forhåndsbehandles. For dette brukes forskjellige metoder: "polering av endene av produkter" - fullføring av det syntetiserte DNA ved hjelp av et Klenow-fragment, etterfulgt av fosforylering, som utføres av en polynukleotidkinase. Det er også mulig å innføre ytterligere restriksjonsseter i primerne som brukes. For dette formålet syntetiseres en ytterligere nukleotidsekvens ved 5'-enden av primerne. I den første syklusen binder primerne seg til DNA kun med sin 3'-terminale del, men allerede i påfølgende sykluser er en tilleggssekvens inkludert i det syntetiserte DNAet og primerne hybridiserer med det langs hele lengden. På denne måten er det syntetiserte PCR-produktet vanligvis forsynt med restriksjonsseter, og gir med deres hjelp muligheten for ytterligere kloning.
Omfanget av PCR er stort og utvides stadig - figur 5.
1. Kloning av nukleotidsekvenser;
Fig. 6. Påvisning av arvestoffet til mikroorganismer. 6. Bruksområder for polymerasekjede reaksjoner.
Kontrolløvelser, spørsmål om innholdet i avsnitt 1. Hvilke genteknologiske metoder brukes i proteinteknikk?
2. Hvilke enzymer kjenner du til som brukes i proteinutvikling?
3. Hvilke typer restriksjoner kjenner du til?
4. Kan restriksjonsenzymer spalte metylerte DNA-regioner?
5. Hva er PCR?
4. Genekspresjonssystemer. Prokaryote og eukaryote systemer.
Som allerede nevnt er det nå ganske enkelt å skaffe et gen, men det er ikke alltid mulig å få et godt ekspresjonssystem for proteinproduksjon. Følgende uttrykksmetoder brukes for tiden:
1. Direkte ekspresjon, når et protein syntetiseres fra sitt eget gen inkludert i plasmidet og plasseres under kontroll av de nødvendige regulatoriske elementene, har ingen hjelpe-"vekter" og forblir i cytoplasmaet;
2. Hybridekspresjon - det samme, men med en ekstra vekt i form av et hjelpeprotein lokalisert ved N-terminalen av polypeptidkjeden og deretter spaltet (eller ikke spaltet);
3. Sekresjon, når proteinet frigjøres i det periplasmatiske rommet (rommet mellom den indre membranen - fosfolipid-dobbeltlaget - og den ytre membranen av cellen, bestående av peptidoglykanlaget og dets fosfolipid-dobbeltlag;
periplasma er viktig for celleosmoregulering, den inneholder noen proteiner) eller Hver av metodene har sine egne egenskaper. Ved direkte ekspresjon plasseres målproteingenet i et plasmid under kontroll av en god promoter, som imidlertid ikke alltid gir effektiv syntese: et heterologt gen kan ha en "feil" sekvens, for eksempel danne en sekundær struktur i mRNA kan synteseproduktet bli ødelagt av cellulære proteaser eller være giftig for vertscellen. Målet med hybridekspresjon er å "overliste" cellen ved å få den til å effektivt begynne syntesen av den N-terminale delen av hjelpeproteinet, som tas som et protein kjent for å være godt uttrykt av vertscellen (den såkalte s.k. husholdningsproteiner). Etter starten av syntesen går hjelpeproteingenet over i målgenet, slik at den resulterende polypeptidkjeden er målproteinet med en liten vekt av bærerproteinet ved N-terminalen. Om nødvendig kan dette vedhenget spaltes av ved hjelp av svært spesifikke proteaser (for dette introduseres en spesiell region mellom genet til hjelpeproteinet og målgenet, som koder for spaltningsstedet til en slik protease. Sekresjon lar deg bringe den nye syntetisert målprotein inn i periplasmaet eller utenfor cellen, noe som kan lette dens påfølgende isolasjon og rensing.I tillegg er det på denne måten noen ganger mulig å oppnå effektiv ekspresjon av proteiner som er giftige for cellen, siden den syntetiserte polypeptidkjeden fjernes fra cytoplasmaet.
I henhold til vertscellene kan ekspresjonssystemer deles inn i prokaryote og eukaryote. Tradisjonelt har prokaryote ekspresjonssystemer blitt utbredt, først og fremst uttrykk i E. coli. Blant fordelene er enkelhet og tilgjengelighet, muligheten for å oppnå et høyt produksjonsnivå av målproteiner, god reproduserbarhet av resultater, relativ billighet og kunnskap om egenskapene til verten - E. coli-celler. Ulempene inkluderer fraværet av ko- og post-translasjonelle modifikasjoner av heterologe proteiner, for eksempel humane proteiner, hvis innfødte og fulle samsvar med naturlige er svært viktig for deres bruk som medikamenter. Dessuten har arbeidet med ekspresjon i gjær pågått ganske lenge - dette eukaryote uttrykkssystemet er også godt studert og utviklet.
Nivået av proteinuttrykk her er vanligvis lavere enn i E. coli, men det er ganske høyt (for eksempel i gjæren Pichia pastoris). Gjær gir noen av ko- og post-translasjonelle modifikasjoner av herterologe proteiner, men disse modifikasjonene kan avvike fra de "native", dvs. de modifikasjonene som et gitt protein har i sin naturlige vertsorganisme. Et annet ganske vanlig brukt eukaryotisk ekspresjonssystem er baculovirussystemet, hvor proteiner uttrykkes i insektceller infisert med et baculovirus som bærer målproteingenet. Nylig har ekspresjonssystemer i pattedyrceller, for eksempel CHO - eggstokkceller fra kinesisk hamster, blitt stadig mer vanlig. Slike ekspresjonssystemer unngår fullstendig problemer med ko- og posttranslasjonelle modifikasjoner av proteinet (som kan være "feil" i gjær og helt fraværende i E. coli). En betydelig del av moderne proteinmedisiner produseres i pattedyrceller, og denne delen vil utvilsomt vokse. Dette til tross for de høye kostnadene ved uttrykk i pattedyrceller.
Årsaken er at i prisen på et legemiddelprotein er andelen av kostnadene ved selve produksjonen av proteinet bare noen få prosent, og alt annet er kostnadene for forskning på utviklingen av legemidlet, dets prekliniske og kliniske testing, markedsføring til markedet osv. Og hvis et proteinlegemiddel relativt sett koster 1000 dollar på markedet, så er det ikke så viktig om kostnadene for produksjonen på et farmasøytisk anlegg er 10 dollar, 50 dollar eller 100 dollar.
Vi skal nå ikke dvele ved de «tradisjonelle» uttrykksmetodene (som kan leses om i lærebøker), men vurdere mer detaljert cellefrie systemer, som ikke er så utbredt, men har unike muligheter.
Cellefrie proteinsyntesesystemer er et av de mest komplekse multikomponent nanosystemene som brukes av molekylærbiologer in vitro. Dette skyldes behovet for nøyaktig å reprodusere alle stadier av proteinbiosyntese, inkludert transkripsjon, aminoacylering av tRNA og translasjon av mRNA med ribosomer. Cellefrie systemer ble i utgangspunktet utviklet spesielt for å studere mekanismene for proteinbiosyntese, og først da ble det klart at de også kan brukes til å produsere rekombinante proteiner og peptider i analytiske og deretter preparative mengder.
Det cellefrie systemet inkluderer nødvendigvis et celleekstrakt oppnådd etter ødeleggelse av celler og frigjøring av supernatanten fra rusk (og inneholder mange komponenter som er nødvendige for syntese, hvis rolle noen ganger er uklar), samt messenger-RNA med genet av målproteinet, aminosyrer, en energikilde (GTP) og andre kjemiske forbindelser, hvis betydning i synteseprosessen tvert imot er velkjent. Cellulært ekstrakt er den viktigste komponenten i et cellefritt system, produksjonen er en slags kunst som krever streng overholdelse av protokoller, nøyaktighet og nøyaktighet; Effektiviteten til systemet avhenger av kvaliteten på ekstraktet. Kjemiske forbindelser hvis rolle i synteseprosessen er kjent kan tilsettes reaksjonen i modifisert form, og dette er en av de betydelige fordelene med det cellefrie systemet. For eksempel, hvis i stedet for konvensjonelle aminosyrer deres isotopisk merkede (15N og/eller 13C) analoger tilsettes, vil effektiviteten til systemet praktisk talt ikke endres, og det syntetiserte proteinproduktet vil være egnet for en detaljert strukturell studie ved NMR.
Tvert imot er det en ganske vanskelig oppgave å oppnå et isotopisk merket produkt i cellulære ekspresjonssystemer. En annen åpenbar fordel med det cellefrie systemet er muligheten for å syntetisere proteiner som er giftige for en levende celle, som kanskje ikke er så giftige for proteinsyntetiseringsmaskinen til det cellefrie systemet.
Cellefrie ekspresjonssystemer, som andre systemer, kan deles inn i prokaryote og eukaryote, avhengig av celleekstraktet som brukes. Blant prokaryote cellefrie proteinsyntesesystemer er systemer basert på ekstrakter av E. coli-celler mest brukt, blant eukaryote systemer basert på kaninretikulocytter og hvetekim. Naturligvis produseres forskjellige proteiner mest effektivt i homologe cellefrie systemer, men fremmede mRNA kan også oversettes med stor suksess. I dette tilfellet kan mRNA enten produseres i de nødvendige mengder in vitro på forhånd og legges til reaksjonen, eller syntetiseres under selve reaksjonen parallelt med translasjon; et slikt system kalles konjugert. Cellefrie ekspresjonssystemer er svært dyre; derfor brukes de oftere i den analytiske versjonen, når prøvevolumet ikke overstiger 100 µl. I dette tilfellet fungerer systemet vanligvis i flere timer, deretter reduseres synteseeffektiviteten på grunn av nedbrytning av komponentene, akkumulering av reaksjonsprodukter som hemmer prosessen, etc. Dette kan unngås ved å bruke et gjennomstrømhvor reaksjonsproduktene kontinuerlig fjernes og forbruksmaterialene som er nødvendige for driften av systemet tilsettes.
Celleekstrakter brukt i cellefrie systemer inneholder mange nukleaser og proteolytiske enzymer som reduserer effektiviteten av proteinsyntese, ødelegger mRNA og de resulterende polypeptidene. For å overvinne disse problemene i cellefrie systemer, kan ekstrakter av mutante celler som er defekte i RNaser og polynukleotidfosforylase brukes, og en RNase-hemmer fra den humane placenta eller proteinasehemmere (leupeptin, pepstatin, chymostatin, etc.) introduseres i cellen. -frie systemer selv. For at cellefrie proteinsyntesesystemer skal fungere, er det nødvendig å gi dem visse ioniske forhold, spesielt konsentrasjonen av Mg2+ ioner. Det er nok å endre den optimale konsentrasjonen av Mg2+ i systemet med 1-2 mM, slik at polypeptider med enzymatisk aktivitet slutter å syntetiseres i det. Påvirkningen av Mg2+-ioner på den totale inkorporeringen av aminosyrer i de syntetiserte polypeptidkjedene manifesteres i mindre grad, noe som tilsynelatende forklares med et brudd på nøyaktigheten av inkorporering av aminosyrer i proteiner ved ikke-optimale konsentrasjoner av Mg2+-ioner. I in vitro-systemer kan Mg2+-ioner erstattes med Ca2+ og til og med Mn2+-ioner, og også delvis erstattet av polyaminer:
spermidin eller spermin, som gunstig påvirker oversettelsen og dannelsen av native proteiner. Proteinbiosyntese i cellefrie systemer forekommer også i nærvær av K+- eller NH4+-ioner, hvis optimale konsentrasjoner er omtrent 100 mM. Na+-ioner hemmer translasjon, og acetatanioner i saltene som brukes er å foretrekke fremfor klanioner. Mg2+, K+ og NH4+ ioner er nødvendige for assosiasjonen av ribosomsubpartikler og deres vedlikehold i en kompakt form.
For produksjon av proteiner hos mennesker og andre høyere organismer brukes eukaryote cellefrie systemer, spesielt systemer fra kaninretikulocytter og hvetekim, samt systemer basert på dyrkede somatiske celler av ulik opprinnelse. Alle tre typer systemer kan brukes med like stor suksess for å oversette en rekke mRNA-er og viser som regel ikke artsspesifisitet. Retikulocytter er kjernefysiske forløpere for erytrocytter fra mennesker og dyr, de utfører aktiv syntese av hemoglobin og har alle nødvendige komponenter i proteinsyntese. Deres fravær av kjerner gjør det mulig å oppnå cellefrie ekstrakter som er minimalt forurenset med genomisk DNA. Cellefrie systemer basert på hvetekim inneholder et ekstrakt isolert fra tørre korn av høsthvete. Muligheten for langtidslagring og tilgjengelighet av dette biologiske materialet sikrer god reproduserbarhet av resultatene.Til tross for at ulike eukaryote cellefrie proteinsyntetiseringssystemer aktivt oversetter heterologe mRNA, blir homologe maler vanligvis oversatt mer effektivt. For eksempel blir globin-mRNA-er oversatt en størrelsesorden bedre av retikulocyttlysater enn av dyrkede eggstokkcelleekstrakter fra kinesisk hamster.
I tillegg kan spesifikke proteinhemmere av translasjonen av visse mRNA-er være tilstede i celler av forskjellige typer differensiert vev.
Kontrolløvelser, spørsmål om innholdet i avsnitt 1. I hvilken form kan målproteiner uttrykkes?
2. Hvilke uttrykkssystemer kjenner du til?
3. Hva er fordelene og ulempene med det bakterielle ekspresjonssystemet i E. coli?
4. Hva er et cellefritt ekspresjonssystem?
5. Hvorfor legges et celleekstrakt til et cellefritt ekspresjonssystem?
6. Er det mulig å lage et "rent" cellefritt system som kun inneholder isolerte og rensede komponenter i en proteinsyntesemaskin?
5. Genekspresjon og preparativ produksjon av målproteiner i praksis Hver metode for genekspresjon har sine egne fordeler og ulemper, og det spesifikke valget av ekspresjonssystemet avhenger selvsagt av oppgaven, d.v.s.
e. egenskapene til proteinet som vi trenger å få. Samtidig er kravene til uttrykkssystemet faktisk de samme: stabilitet (reproduserbarhet), høyt utbytte av produktet, enkel isolasjon, korrekt romlig struktur. Fraværet av den korrekte strukturen til det uttrykte proteinet kan føre til dets nedbrytning og, som et resultat, et lavt utbytte av produktet. Eller det vil være mulig å få tak i tilstrekkelige mengder protein i form av inklusjonslegemer, men det er langt fra alltid mulig å renaturere et slikt protein. Det vil si at det syntetiserte polypeptidet har den korrekte primære strukturen (som lett kan verifiseres ved gensekvensering), som imidlertid ikke kan formes til en naturlig fungerende romlig struktur. Det er klart at vi ikke trenger et slikt protein og det er nødvendig for å oppnå et riktig foldet protein. Det er dette stadiet, opprettelsen av et effektivt ekspresjonssystem og produksjonen av et naturlig protein, som ofte er nøkkelen i arbeidet til en proteiningeniør. En veldig typisk situasjon er når det i lang tid ikke er mulig å lage et slikt system for et sjeldent og komplekst protein, og forskningen utføres veldig sakte på de små mengdene av stoffet som kan fås fra en naturlig kilde ( for eksempel slangegift). Men så snart et effektivt ekspresjonssystem er oppnådd, blir proteinet umiddelbart isolert i store mengder, det studeres intensivt, strukturen dechiffreres, og det blir mulig å studere de strukturelle-funksjonelle relasjonene i proteinmolekylet ved bruk av stedsrettet mutagenese. Som et resultat av dette lærer vi på kort tid mye mer om dette objektet enn i mange tidligere år, da forskerne bare hadde mikromengder av naturlig materiale i hendene. Som et spesifikt eksempel, la oss vurdere nevrotoksin II, et protein fra giften til kobraen Naja oxiana, som det ikke var mulig å oppnå et effektivt ekspresjonssystem for på lenge. Så snart dette problemet ble løst - ikke uten deltakelse fra ansatte ved Institutt for bioingeniørvitenskap - nådde studiet av nervegift et kvalitativt nytt nivå.Ris. Fig. 7. Romlig struktur av nevrotoksin II fra giften til kobraen Naja oxiana Figur 7 viser strukturen - det er et veldig interessant lite protein med 4 disulfidbindinger (det var disse disulfidbindingene som var snublesteinen i uttrykket). Nevrotoksin II interagerer spesifikt med nikotinacetylkolinreseptorer innebygd i cellemembranen, som spiller en rolle i forekomsten og utviklingen av en rekke sykdommer i nervesystemet (Alzheimers sykdom, epilepsi, schizofreni, etc.), samt i forekomsten av nikotinavhengighet hos røykere. Det er klart at muligheten for å blokkere og regulere slike reseptorer er av stor vitenskapelig og praktisk betydning. Nevrotoksin II ble først beskrevet for mer enn 20 år siden, men arbeidet med det gikk sakte på grunn av at proteinet kun kunne fås fra slangegift i svært begrensede mengder i lang tid.
Det var ikke mulig å oppnå et rekombinant protein - det var inaktivt under direkte ekspresjon, siden tilstedeværelsen av fire disulfidbindinger per så lite protein førte til feil folding i cytoplasmaet. Ved hybridekspresjon med tioredoksin var det mulig å oppnå fraksjoner av et milligram per liter kultur, og prosessen med isolering og rensing var svært lang og arbeidskrevende. Problemet ble løst kun ved å bruke et ekspresjonssystem med sekresjon av målproteinet, og nøkkelpunktet i dette tilfellet var valg av riktig leder (signal) sekvens, hvis tilstedeværelse i polypeptidkjeden fører til sekresjon av produktet.
fant også en veldig enkel metode for å isolere dette proteinet, basert på dets høye termiske stabilitet. Faktum er at nervegiften tåler oppvarming opp til grader Celsius i løsning, mens de fleste andre proteiner denaturerer og feller ut ved denne temperaturen. Derfor viste en av de viktigste og mest effektive stadiene av proteinrensing å være oppvarming av en løsning som inneholder cellulære proteiner ved en temperatur på 70 grader, etterfulgt av sentrifugering. Etter det forble ganske rent nevrotoksin i supernatanten. Som et resultat av bruk av dette ekspresjonssystemet ble det oppnådd et utbytte på opptil ~15 mg/L på et dårlig medium og ~150 mg per liter kultur på et rikt medium, dvs. en størrelsesorden mer enn det som ble oppnådd med andre forskere. Det er klart at et slikt uttrykk brakte arbeidet med nevrotoksin til et kvalitativt nytt nivå - det ble mulig å skaffe og studere forskjellige mutanter av dette proteinet, for å sette og løse nye interessante problemer, som er verdt å snakke om her.
Verifikasjon av den korrekte strukturen til neurotoxin II (og renheten til det resulterende produktet) ble utført ved bruk av NMR-spektroskopi. Ved å dyrke den nevrotoksinproduserende stammen på et medium som inneholdt N15-merket ammoniumklorid, var det mulig å sikre at alle nitrogener i proteinet ikke var vanlige N14, men N15-isotoper. De er vist i figur 8 til venstre med blå sirkler.
Ris. 8. Til venstre er et molekyl av N15-merket neurotoxin (blå sirkler), til høyre er NMR-spekteret Et NMR-spektrum ble oppnådd med en korrelasjon av de kjemiske skiftene til N15-kjernene og protonene, og tildeling av signaler ble utført, som viste at signalene til alle kjernene til N15-proteinet er tilstede i dette spekteret, deres posisjon tilsvarer spekteret til det native proteinet og det er ingen signaler fra noen urenheter i spekteret. Kvantitativ analyse tillot oss å si at minst 99 % av proteinet tilstede i prøven tilsvarer det ønskede produktet. Selvfølgelig ble den biologiske aktiviteten til det genmanipulerte proteinet også testet, og det falt sammen med aktiviteten til giftstoffet isolert fra slangegiften. Bruken av sekresjon og vekst av proteinet i et medium som inneholder N15 tillot oss således å oppnå ønsket produkt i store mengder og bruke det til videre studier for å sette oppgaver på nevrotoksinmutagenese, som var helt umulig uten et slikt ekspresjonssystem. Her er en av oppgavene.
Det er kjent at nevrotoksiner fra slangegift er delt inn i to klasser: korte nevrotoksiner og lange nevrotoksiner med en ekstra disulfidbinding på spissen av sentralsløyfen (Figur 9). Lange og korte toksiner viser ulik selektivitet for nikotinacetylkolinreseptorer (nAChRs). Begge typer toksiner samhandler like godt med muskel-type reseptorer (det vil si de som finnes på overflaten av muskelceller), mens bare lange toksiner interagerer effektivt med neuronal-type reseptorer lokalisert på nevroner. En sammenlignende analyse av strukturene til α-nevrotoksiner antydet at den sentrale løkken til β-nevrotoksinmolekylet tilsynelatende spiller en nøkkelrolle i spesifisiteten til gjenkjennelse av en eller annen type reseptor.
Ris. 9. Sammenligning av romlige strukturer av nevrotoksiner. Grønn farge viser den sentrale sløyfen til neurotoxin I med en ekstra disulfidbinding (gul linje).
Det viste seg at denne løkken i sine strukturelle parametere ligner korte molekyler av alfa-konotoksiner, som binder seg godt til reseptorer.
Det ble besluttet å prøve å endre spesifisiteten til nevrotoksin II. Ved å bruke metoden for stedsrettet mutagenese, ble et fragment av den sentrale sløyfen til langt neurotoxin I fra giften til denne kobraen transplantert inn i molekylet av kort neurotoxin II fra giften til Naja oxiana cobra, og en mutant versjon av neurotoxin II med en modifisert sentral sløyfe inneholdende den femte disulfidbindingen ble oppnådd. Studier av den biologiske aktiviteten til det rekombinante proteinet har vist at det modifiserte nevrotoksin II har en lignende aktivitet som nevrotoksin I med hensyn til den nevronale nikotiniske acetylkolinreseptoren, det vil si faktisk de samme Kd-verdiene som det opprinnelige foreldreproteinet. Som et resultat av dette arbeidet lyktes vi med å innpode et kort nevrotoksin fra kobragift evnen til effektivt å samhandle med nAChR-er av nevronaltype. Samtidig er det viktig at nøkkelmomentet som gjorde det mulig å posere og løse dette problemet var å oppnå et effektivt uttrykkssystem. Tross alt uttrykkes mutanter ofte merkbart verre enn det native proteinet (dette var også tilfellet), og uten et godt ekspresjonssystem ville det rett og slett ikke vært mulig å akkumulere de nødvendige mengder av disse proteinene for deres studie. Studiet av strukturen til nervegiften ved NMR har gitt nye utfordringer for proteinutviklingen av dette proteinet. Det ble vist (ved hjelp av metoden for heteronukleær spektroskopi) at under interaksjonen av nevrotoksin II med nAChR, samhandler den første sløyfen av nevrotoksinet også med overflaten av modelllipidbiceller, som består av en blanding av to vaskemidler, DMPC og DHPC, og danner en analog av fosfolipid-dobbeltlaget i cellemembranen. Tilsynelatende skjer prosessen med å blokkere nAChR-kanalen som følger: neurotoksinet sitter først på membranen til den postsynaptiske cellen, deretter, diffunderer langs membranen, finner reseptoren, og reseptoren hemmes av toksinet. Hvordan kan denne hypotesen bekreftes? Åpenbart, ved hjelp av mutagenese av rester involvert i interaksjonen med lipidmiljøet til reseptoren - å studere effekten av mutasjoner i disse posisjonene på interaksjonen med reseptoren i det naturlige miljøet og på interaksjonen med modellmembraner. Det vil si, her ser vi hvordan de nye mulighetene for proteinteknikk lar oss løse nye problemer, som igjen reiser andre spørsmål, for løsningen som igjen er nødvendig med proteinteknikk.
Kontrolløvelser, spørsmål om innholdet i avsnitt 1. Hvilke egenskaper bør et effektivt ekspresjonssystem ha sett fra en proteiningeniørs ståsted?
2. Betyr det å få et polypeptidprodukt med riktig primærstruktur løsningen på problemet med å skape et effektivt ekspresjonssystem?
3. Hva er trekk ved nevrotoksin II som et objekt for preparativ heterolog ekspresjon?
4. Hvordan kan spesifisiteten til interaksjonen mellom et nevrotoksin og en reseptor endres?
5. Hvilken av de fysisk-kjemiske metodene for å studere proteinmolekyler er i stand til å gi mest informasjon om et proteinmolekyl i løsning?
Genetisk konstruerte proteiner uttrykt i heterologe systemer kan ofte ikke erverve den riktige romlige strukturen i vertscellen eller det cellefrie systemet som har biologisk aktivitet. I dette tilfellet kan proteinet være i løselig form, men ikke ha riktig struktur, eller det kan danne uløselige aggregater - inklusjonslegemer. For å bringe slike proteiner til deres opprinnelige tilstand, er det nødvendig å renaturere dem, først konvertere dem til en løselig tilstand ved hjelp av sterke løsningsmidler, og deretter, gradvis fjerning av løsningsmidlene, skape forhold for riktig proteinfolding. Renaturering er ikke en enkel, ett-trinns prosess, det er ofte en ganske ikke-standard oppgave som ikke har en rask løsning. La oss vurdere mer detaljert renatureringen av rekombinante proteiner fra inklusjonslegemer dannet under ekspresjonen av heterologe proteiner i E. coli. Inklusjonslegemer er partikler som hovedsakelig består av aggregater av det rekombinante proteinet, men de kan også inkludere noen av de native bakterielle proteinene "fanget" av det fremmede proteinet. Rekombinante proteiner i inklusjonslegemene er i en denaturert inaktiv tilstand, og for å oppnå dem i en løselig form, må kraftige denatureringsmidler, som urea, guanidinhydroklorid og vaskemidler, brukes. Det rekombinante proteinet solubilisert under disse tøffe forholdene krever ytterligere renaturering for å gjenopprette den native konformasjonen, og derfor er oppgaven med solubilisering ikke bare å oppnå en monomolekylær proteinløsning, men også å minimere unaturlige intra- og interproteininteraksjoner. Valget av et solubiliseringsmiddel (urea, guanidinklorid, detergenter, etc.) bestemmer ikke bare effektiviteten av oppløsningen av legemer, men også strukturen til det denaturerte proteinet i oppløsning, og dermed måtene for dets videre renaturering.
Renaturering induseres vanligvis ved å redusere konsentrasjonen av denatureringsmidlet. I dette tilfellet kan prosessen med dannelse av den native romlige strukturen til proteinet være ledsaget av feil folding av proteinet eller aggregering, noe som fører til produksjon av et inaktivt protein. Forholdet mellom disse prosessene - "riktig" og "feil" - avhenger i stor grad av fremgangsmåten for å redusere konsentrasjonen av denatureringsmidlet og av løsningsmidlets egenskaper. Store muligheter åpner for bruk av spesielle tilsetningsstoffer, osmolytter og kjemiske chaperoner, som stabiliserer riktig foldede proteiner og letter renatureringsprosessen. Proteinproduksjon fra inklusjonslegemer kan deles inn i to faser: oppløsningen av kroppene og den påfølgende renatureringen av proteinet.
De mest brukte for å løse opp inklusjonslegemer er urea, guanidinhydroklorid og sterke ioniske detergenter som for eksempel N-laurylsarcosin. Oppløsning i urea og guanidinklorid fører til at det oppstår en uordnet labil struktur av proteiner, mens strukturen til proteiner i en vaskemiddelløsning kan være svært forskjellig. Det er for eksempel kjent at komplekser av proteiner med SDS inneholder et stort antall alfa-helikser. Ioniske vaskemidler er de sterkeste løsningsmidlene der sannsynligheten for tilslagsdannelse er minimal. Samtidig øker bevaringen av proteinstrukturen i komplekset med vaskemiddelet sannsynligheten for dannelse av intraproteindisulfidbindinger, både native og "feil", unaturlige. Effektiviteten av proteinoppløsning og utfoldelse i nærvær av urea og guanidinklorid avhenger av konsentrasjonen deres. I de fleste tilfeller er det optimalt å bruke 6-8 M urea og 6-7 M guanidinklorid, men selv ved høyere konsentrasjoner kan noen inter- og intramolekylære interaksjoner forbli i proteinet, og disse interaksjonene kan føre til dannelse av uregelmessige strukturer og aggregater under den påfølgende elimineringen av denatureringsmidlet. Det skal bemerkes at naturlige disulfidbindinger kan dannes selv i utfoldede proteiner i nærvær av denatureringsmidler, siden den naturlige strukturen til proteinet er termodynamisk den mest gunstige. For mer effektiv proteinrenaturering kan mellomkonsentrasjoner av denatureringsmidler (urea og guanidinhydroklorid) brukes, hvor bindingen til proteiner blir svekket. Denne teknikken er umulig når det gjelder vaskemidler, siden deres binding til protein bestemmes av den kritiske micellekonsentrasjonen (CMC), dvs. konsentrasjonen av vaskemidlet der det begynner å danne miceller, på overflaten som det utfoldede proteinet er. satt inn. Effektiv oppløsning av proteiner skjer bare ved konsentrasjoner over CMC. Dette betyr at proteinrenaturering må skje i nærvær av et vaskemiddel. Når vaskemiddelet fjernes, faller vanligvis det denaturerte proteinet som ennå ikke har koagulert ut.
Renaturering er prosessen med å sveise et utfoldet proteinmolekyl til den riktige naturlige, biologisk aktive konformasjonen. Proteiner oppløst fra inklusjonslegemer kan ikke koagulere ved høye konsentrasjoner av denatureringsmidler; de er solvatiserte og svært mobile. I kontrast er proteiner i vandige løsninger foldet og kompakt. I ideelle tilfeller bør overføring av proteinmolekyler fra denaturerende løsninger til en vandig løsning føre til folding. Imidlertid, med en rask reduksjon i konsentrasjonen av denatureringsmidler, danner proteiner som regel kompakte, men uregelmessig foldede strukturer, utsatt for aggregering igjen. I dette tilfellet mister proteinet sin mobilitet, noe som hindrer muligheten for disaggregering og folding av den native strukturen. Proteinrenaturering krever en langvarig tilstedeværelse av mellomkonsentrasjoner av denatureringsmiddel, hvor proteinet fortsatt beholder løselighet og mobilitet, men er allerede utsatt for å folde seg. Studier av likevektsprosessene for renaturering har vist at en viktig rolle spilles av mellomtilstandene til proteinet dannet i nærvær av denatureringsmidler. Disse strukturene er ustabile og vellykket renaturering krever overgang til den native strukturen samtidig som løselighet og mobilitet opprettholdes. Disulfidholdige proteiner kan i prinsippet foldes selv ved høye konsentrasjoner av denatureringsmiddel, dersom inkubasjonsforholdene favoriserer dannelsen av disulfidbindinger. Men for å akselerere dannelsen og øke sannsynligheten for dannelsen av "riktige" bindinger, er det fortsatt nødvendig å velge den optimale mellomkonsentrasjonen av denatureringsmidlet. Til og med å få "rett"
disulfidbindinger garanterer ennå ikke dannelsen av en naturlig proteinstruktur ved eliminering av denatureringsmidlet. I dette tilfellet er balansen mellom mobiliteten til proteinet og stabiliteten til den native strukturen avgjørende. Søket etter den optimale renatureringsmåten begynner med valget av en metode for å redusere konsentrasjonen av denatureringsmiddel. To metoder brukes for å redusere konsentrasjonen av denatureringsmiddel i løsningen: dialyse og gelfiltrering.
Dialysemetoden er basert på at proteinmolekyler på grunn av sin størrelse ikke kan passere gjennom semipermeable membraner, mens lavmolekylære stoffer er jevnt fordelt mellom volumet avgrenset av membranen og den omkringliggende løsningen.
Etter å ha byttet utvendig løsning mange ganger, vil sammensetningen av mediet i dialyseposen være den samme som i den omkringliggende løsningen. Den enkleste tilnærmingen er en-trinns dialyse. I dette tilfellet forblir proteinet i løsning i lang tid med en mellomkonsentrasjon av denatureringsmiddel, som sakte avtar. Denne tilnærmingen brukes på proteiner som beholder løselighet i utfoldede eller mellomliggende tilstander. Det er viktig at proteinkonsentrasjonen under dialyse holder seg nesten konstant, bortsett fra en liten økning i volum på grunn av den høye osmolariteten til urea og guanidin. Dette betyr at renatureringsforløpet kan avhenge kritisk av den opprinnelige proteinkonsentrasjonen. I noen tilfeller (for eksempel med renaturering av antistoffer) brukes trinnvis dialyse. Samtidig, ved hvert trinn, etableres en likevekt av proteinet med en viss mellomkonsentrasjon av denatureringsmidlet.
Fordelene med denne tilnærmingen manifesteres i tilfelle av proteiner med disulfidbindinger, så vel som multidomeneproteiner. En variant av denne metoden er dialyse mot en løsning med variabel konsentrasjon av denatureringsmiddel. I dette tilfellet inneholder dialyseløsningen i utgangspunktet en høy konsentrasjon av denatureringsmiddel, som deretter gradvis reduseres.
Med en rask nedgang er denne teknikken nær en-trinns dialyse, og med en langsom nedgang er den nær flertrinns dialyse.
Ved gelfiltrering, for å bli kvitt denatureringsmidler, påføres en løsning av denaturert protein på en kolonne som er ekvilibrert med renatureringsbuffer.
Bruken av kolonner med gel med store porer gjør at du raskt kan separere renatureringsmidlet uten å fraksjonere proteinene. Fine gelkolonner kan gi samtidig størrelsesfraksjonering av proteiner. I begge tilfeller skjer den gradvise nedgangen i konsentrasjonen av denatureringsmidlet på samme måte som ved ett-trinns dialyse. Problemene knyttet til forholdet mellom hastighetene for fjerning av denatureringsmidler og proteinfolding er de samme for begge tilnærminger. Forskjellene bestemmes av effekten av kolonnegelmatrisen på proteinrenaturering. Matrisen kan interagere med proteinet gjennom hydrofobe interaksjoner eller ved å danne hydrogenbindinger ved mellomliggende konsentrasjoner av denatureringsmiddel og dermed forhindre feilfolding og aggregering.
Matrisen kan også fremme proteindispersjon ved å redusere deres aggregering. En slik tilnærming har blitt brukt med hell, for eksempel for å renaturere interleukin-6 fra en løsning av guanidinklorid. I dette tilfellet ble proteinet oksidert i nærvær av et denatureringsmiddel, noe som resulterte i dannelsen av de riktige disulfidbindingene, og deretter ble guanidinet fjernet på en Sephadex G-25-kolonne. Først etter det ble renaturering av det aktive proteinet observert.
Dekan senkes raskt og på enkleste måte ved å fortynne prøven i et stort volum renatureringsbuffer. I dette tilfellet er det praktisk talt ingen mellomkonsentrasjoner av denatureringsmiddel. Ved rask fortynning dannes mest sannsynlig kompakte proteinstrukturer med lav mobilitet, noe som begrenser muligheten for fluktuasjoner og omorganiseringer med dannelsen av en naturlig struktur.
For å redusere denne effekten anbefales det å tilsette små konsentrasjoner av denatureringsmiddel til renatureringsløsningen. Verdien av denne konsentrasjonen bestemmes av stabiliteten til det foldede proteinet. Når det gjelder oligomere proteiner, kan det oppstå problemer på grunn av den lave konsentrasjonen av monomere annealede proteiner i de tidlige stadiene av fortynningen. For å muliggjøre oligomerisering er det mulig å fremskynde fortynningsprosedyren.
Et spesielt tilfelle av fortynning er "tilbakefortynning", hvor en renatureringsbuffer tilsettes en løsning av denaturert protein. Samtidig reduseres konsentrasjonen av protein og denatureringsmiddel samtidig. I dette tilfellet opprettholdes en høy proteinkonsentrasjon ved middels konsentrasjoner av denatureringsmiddel, noe som kan føre til aggregering. På den annen side, hvis mellomtilstandene til proteinet forblir løselige ved middels konsentrasjoner av denatureringsmidlet, er denne protokollen å foretrekke, da den gir proteinet tid til sakte omorganiseringer og folding. En annen fortynningsmetode er basert på blanding av protein og renaturering av bufferløsninger ved et visst volumforhold. Under denne prosedyren forblir protein- og denkonstante, i motsetning til de direkte og omvendte fortynningsteknikkene. Forløpet av proteinfolding og problemene som oppstår er nesten de samme som er karakteristiske for direkte fortynning. Hvis det er nødvendig å opprettholde en lav konsentrasjon av denaturert protein for å forhindre aggregering, anbefales en diskontinuerlig fortynningsprosedyre. Etter tilsetning av en aliquot av denaturert protein til renatureringsløsningen, må en pause gjøres før neste aliquot tilsettes. Denne tilnærmingen er bare fordelaktig hvis det foldede proteinet ikke aggregerer i utfoldede eller mellomliggende former.
Proteinrenaturering kan skje mer effektivt hvis den er assosiert med en affinitetsmatrise (f.eks. Ni-holdig bærer) eller en ionebytterharpiks.
Proteinbinding skjer i nærvær av et denatureringsmiddel, som deretter fjernes ved å vaske kolonnen. Denne prosedyren minimerer risikoen for aggregering av både utfoldede og mellomliggende former av proteinet. Den største ulempen med denne metoden er den steriske hindringen som oppstår under foldingen av proteinet assosiert med matrisen, spesielt hvis denne bindingen er flerpunkts. Disse problemene kan delvis overvinnes hvis renaturering utføres under forhold med delvis dissosiasjon, når det oppstår fluktuasjoner mellom den bundne og frie tilstanden til proteinet under foldeprosessen.
Ulike lavmolekylære stoffer kan akselerere prosessen med proteinrenaturering.
Disse stoffene kan deles inn i to grupper: de som forbedrer proteinfolding og de som hindrer dets aggregering. Disse to typene stoffer kan ha noe motsatt effekt. En økning i proteinfolding betyr generelt en økning i protein-protein-interaksjoner, noe som kan øke aggregeringen. Stoffer som undertrykker aggregering bør fortrinnsvis samhandle med mellomformer av proteiner uten å påvirke foldeprosessen. Disse kravene oppfylles av polyetylenglykol, cyklodekstrin, argininklorid og prolin. Polyetylenglykol og cyklodekstrin ser ut til å binde seg til de hydrofobe områdene av proteinmellomprodukter, og forhindrer deres aggregering. Den mest brukte i praksis er arginin, men virkningsmekanismen er ikke helt klar. Det er vist at arginin ikke stabiliserer strukturen til proteiner og ikke forbedrer folding, men forhindrer aggregering under renaturering. Det er kjent at mange ladede stoffer med lav molekylvekt øker stabiliteten til proteiner og forbedrer deres evne til å folde seg. Disse stoffene inkluderer sukker, polyalkoholer, noen salter (som ammoniumsulfat og magnesiumklorid), og noen aminosyrer (som glycin og alanin). Samtidig øker de kompaktheten til strukturen og reduserer mobiliteten til proteinet. Nedgangen i proteinmobilitet i nærvær av slike stabilisatorer (f.eks. sukrose) har blitt vist direkte ved bruk av isotopbyttemetoder. I nærvær av stabilisatorer øker imidlertid sannsynligheten for feilfoldede proteiner og aggregering. Bruken av dem kan være fordelaktig hvis de denaturerte og mellomformene av proteinet forblir løselige og krever en betydelig mengde tid for å brette seg ordentlig. For eksempel har alfa-synuklein vist seg å være løselig i denaturert form og renatureringseffektiviteten økes i nærvær av en trimetylamin-N-oksidstabilisator.
Noen ganger, for å bekjempe feilfolding og aggregering av rekombinante proteiner, må proteiningeniører endre sin primære struktur, og fjerne "interfererende" aminosyrerester. Som et eksempel på en slik oppgave kan vi nevne arbeidet som er utført ved vår avdeling med modifikasjon av ribonukleasehemmeren barstar. Her var det imidlertid nødvendig å eliminere ikke den grove aggregeringen av produktet, men den fine spesifikke assosiasjonen - dannelsen av dimerer. Barstar er et lite protein (~kDa) som viste seg å være relativt enkelt å få tak i - gode uttrykksnivåer, enkel isolasjon og renseskjema. Men problemet oppsto på et annet stadium, det viste seg at en riktig brettet innfødt barstjerne begynner å dimerisere i de konsentrasjonene som er nødvendige for å utføre fysisk-kjemiske studier av dens struktur og dynamikk. NMR-metoden ble brukt for å finne dimeriseringskonstanten, dannelses- og nedbrytningshastighetene til dimeren, og også for å identifisere dimeriseringsstedet. Og så kom ideen om å endre barstjernen - for å fjerne denne dimeriseringen uten å endre proteinets grunnleggende egenskaper. De. Målet var å utføre en rasjonell stedsrettet mutagenese av barstar for å redusere dens tendens til dimerisering, samtidig som den romlige strukturen til proteinet og dets funksjon (ribonukleasehemmer) opprettholdes. En analyse av dimerstrukturen viste at proteinet dimeriserer ved å danne en antiparallell struktur på grunn av hydrofobe interaksjoner mellom sidekjedene til isoleucin 86 og 87 og leucin 88. For å løse problemet var det nødvendig å forstyrre interproteininteraksjoner og bevare interaksjonen. inne i monomeren. Analysen av forskjellige substitusjoner ved dimeriseringsgrensesnittet ved molekylære modelleringsmetoder ga flere mulige alternativer. Men under uttrykket av genene til disse mutantene oppsto et annet problem: et slikt protein sluttet å bli uttrykt! Hvorfor? Det har blitt antydet at dette skyldes den lavere motstanden til mutantene mot intracellulære proteaser. Og i så fall kan du prøve å redde produktet ved å "klistre" det til proteinbæreren, dvs. ved hybrid uttrykk. En hybrid av tioredoksin og barstar ble oppnådd med suksess, spaltet med enterokinase, og som et resultat ble det oppnådd en isoleucin-87glutaminsyremutant, som beholdt strukturen til det native proteinet, ikke dimeriserer, er stabil og også beholdt sin funksjon, danner et sterkt kompleks med ribonuklease barnase.
Kontrolløvelser, spørsmål om innholdet i avsnitt 1. I hvilke tilfeller er det nødvendig å renaturere rekombinante proteiner?
2. Hva er inkluderingsorganer?
3. Hva er hovedtrinnene involvert i prosessen med renaturering av et rekombinant protein?
4. Hvorfor bruke sterke denatureringsmidler?
5. Er det mulig å oppnå et naturlig protein i renatureringsprosessen uten å bryte proteinets disulfidbindinger?
6. Hvordan kan konsentrasjonen av et denatureringsmiddel reduseres under renatureringen av et rekombinant protein?
7. Kunstige proteiner med ønskede egenskaper.
Introduksjon av biologisk aktivitet i kunstige proteiner Konstruksjonen av kunstige proteiner eller proteiner de novo, det vil si helt nye proteinstrukturer med ønskede egenskaper, er en av de mest ambisiøse oppgavene til proteinteknikk. Det er åpenbart at en fullstendig forståelse av prinsippene for å konstruere strukturen til proteiner og dens forbindelse med de biologiske funksjonene til proteinmolekyler innebærer muligheten for å lage nye proteiner, inkludert slike proteiner som ikke eksisterer (eller ennå ikke er oppdaget) i natur. La oss vurdere problemet med å lage kunstige proteiner på et spesifikt eksempel på arbeidet til de ansatte i vår avdeling - konstruksjonen av et kunstig proteinalbebetin med en gitt romlig struktur og dets biologisk aktive derivater.
Til dags dato har dusinvis av proteinstrukturer blitt designet de novo i verden, for noen av dem har gener blitt kjemisk syntetisert, og disse proteinene er oppnådd og studert. Nesten alle slike proteiner var basert på repetisjon av naturlige proteinstrukturer og ofte på direkte bruk av elementer i aminosyresekvensene deres. Samtidig gjør den moderne teorien om proteinstrukturer, skapt i vårt land av O.B. Ptitsyn og hans skole, det i prinsippet mulig å konstruere proteiner med en ny, det vil si arkitektur som ennå ikke er oppdaget i naturen. Det er en av disse proteinstrukturene, vist i figur 10, som ble valgt for å designe det første kunstige proteinet med en ny arkitektur. Denne strukturen tilsvarer alle kjente prinsipper for dannelsen av strukturen til kuleproteiner, samtidig er den ikke funnet i naturlige proteiner. Dette proteinet ble kalt albebetin fordi det består av to alfa-beta-beta repeterende elementer.
"Den russiske føderasjonens utdannings- og vitenskapsdepartement Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education Amur State University Institutt for design og teknologi for klær UTDANNINGS- OG METODOLOGISK KOMPLEKS AV DISIPLINER Systemer for å designe klær Det viktigste utdanningsprogrammet i spesialiteten 260902.65 Designe plagg Blagoveshchensk 2012 EMCD ble utviklet av en førsteamanuensis ved Institutt for design og teknologi for klær Kiseleva ... "
«Innholdsfortegnelse Studentens tid brukt på å studere disiplinen Innledning..3 1. Disiplinens formål og mål..3 2. Disiplinens plass i spesialitetens utdanningsprosess.4 3. Listen og innholdet i disiplinen. Forelesningskurs.5 4. Liste over praksistimer.10 5. Liste over laboratoriearbeid..10 6. Utdannings- og metodemateriell om faget.11 7. Kart over tilbudet av undervisningslitteratur.12 Vedlegg 1 Eksamensspørsmål Vedlegg 2 Oppgave for kursarbeid Vedlegg 3 Metodisk...»
"Forklarende notat Arbeidsprogrammet i geografi ble satt sammen i samsvar med den føderale komponenten av den statlige standarden for generell utdanning, godkjent av den felles beslutningen fra kollegiet til Russlands utdanningsdepartement og presidiet til det russiske utdanningsakademiet datert desember 23, 2003 nr. 21/12 og godkjent etter ordre fra Utdannings- og vitenskapsdepartementet i den russiske føderasjonen datert 5. mars 2004 nr. 1089, instruktiv-metodisk brev om undervisning i geografi i utdanningsinstitusjoner i Belgorod-regionen i studieåret 2013-2014. Omtrentlig arbeidsstruktur ... "
«SENTER FOR ASSISTANCE TIL URFOLK I NORDEN N.V. Moraleva, E.Yu. Ledovskikh, T. Koehler, D.V. Kirichevskiy, M.Yu. Rubtsova, V.P. Chizhova URFORSØKOTURISME METODOLOGISK HÅNDBOK Russland 2008 Sammenslutningen av urfolk i nord, Sibir og Fjernøsten Senter for bistand til urfolk i nord i den russiske føderasjonen [e-postbeskyttet] [e-postbeskyttet] www.csipn.ru www.raipon.org Moraleva N.V., Ledovskikh E.Yu.,...»
"LAGRANGE EQUATIONS OF THE II KIND Publisert i henhold til den pedagogiske publikasjonen Lagrange Equations of the Second Kind: Methodological Instructions for the Course Assignment in Dynamics / V.I. Drong, G.M. Maksimov, A.I. Ogurtsov / ed. V.V. Dubinina. - M .: Forlag av MSTU im. NE Bauman, 1985. _ 1. Last 1 med masse m1 glir langs et skråplan som danner en vinkel med horisonten. Enden av en ubøyelig tråd er festet til lasten, som kastes gjennom blokk 4 og vikles på en trommel 3 med radius r, stivt forbundet med en rulle 2 med radius R. Rulle 2 ... "
"Den russiske føderasjonens utdanningsdepartement _ RUSSIAN STATE UNIVERSITY OF OIL AND GAS dem. DEM. GUBKINA AVDELING FOR AUTOMATISERING AV TEKNOLOGISKE PROSESSER E.N. BRAGO, O.V. ERMOLKIN Ny informasjonsteknologi og måleutstyr for kontroll av brønnstrømningshastighet. Retningslinjer for praktiske øvelser i faget MÅLING OG KONTROLL AV TEKNOLOGISKE PROSESSER AV OLJE- OG GASSPRODUKSJONER Moskva 2004 UDC 681.518+681.2:622.276. Brago E.N., Ermolkin O.V. Ny informasjon..."
"Moskva statsuniversitet. M.V. Lomonosov Fakultet for beregningsmatematikk og kybernetikk Volkova I.A. Introduksjon til datalingvistikk. Praktiske aspekter ved å lage lingvistiske prosessorer (Lærebok for studenter ved fakultetet for CM&C MGU) Moskva 2006 UDC 519.6+681.3.06 Denne opplæringen ble utviklet til støtte for spesialkurset Computational Linguistics, lest ved fakultetet for CM&C for studenter på 3-5 kurs. Det gis detaljerte forklaringer og anbefalinger. Anmeldere:...»
"Godkjent ved ordre fra departementet for utdanning og vitenskap i Den russiske føderasjonen av 3. september 2009 N 323 (som endret ved bestilling fra departementet for utdanning og vitenskap i Den russiske føderasjonen av 07.06.2010 N 588) den nødvendige prosessen for gjennomføring av utdanningsprogrammene som er erklært for lisensiering § 2. Gi utdanningsprosessen pedagogisk og pedagogisk litteratur i henhold til den erklærte k... "
“Retningslinjer for implementering og anvendelse av sanitære regler og normer SanPiN 2.1.4.559-96 Drikkevann. Hygieniske krav til vannkvalitet i sentraliserte drikkevannsforsyningssystemer. Kvalitetskontroll (godkjent av Statens overlege 20. desember 1997) MU 2.1.4.682-97 Dato for innføring: fra 1. januar 1998 vann. Hygieniske krav til...»
«Organisering av arbeidet med å sammenstille forordet til fortegnelsen over arkivene over midler som er oppbevart i statlige, kommunale og departementale arkiver (metodikkbrev) Informasjons- og metodikkbulletin N 18 for 2002 av 06.01.2002 s. 46 _ Blad l Organisering av arbeid med å sammenstille forordet til inventarsakene av midler som holdes i offentligheten,. kommunale og avdelingsarkiv (metodisk brev) Sorokina V.C. Leder for avdelingen for arkiver for regjeringen i Khabarovsk-territoriet Svyatenkaya ... "
"STATSKOMITEEN FOR USSR OM FOLKES UTDANNELSE EDUCATIONAL AND METHODOLOGICAL UNION N AND E HYDROMETEOROLOGICAL SPECIALTIES / Leningrad Hydrometeorological Institute Odessa Hydrometeorological Institute SPESIALISEREDE VÆRVARSLER Godkjent av lærebok 191'.5RA, Academic Council, D35, 9, 9, 9, 9, 9, 9, 9, 9 Spesialiserte værmeldinger. Opplæringen; L., red. LGMI, 1991, 112 s. Og så er det jeg..."
«Kjære nyutdannede! Publikasjonene som er oppført nedenfor inneholder metodiske anbefalinger som vil bidra til å forberede, arrangere og forsvare det endelige kvalifiseringsarbeidet. Ryzhkov, I. B. Grunnleggende om vitenskapelig forskning og oppfinnelse [Elektronisk ressurs]: [lærebok for universitetsstudenter som studerer i retning av opplæring (spesialiteter) 280400 - Miljøteknikk, 280300 - Vannressurser og vannbruk] / I. B. Ryzhkov.- St. Petersburg [ osv.] : Doe,..."
"MI,IH OFPHAYKIT POC CVTVI @e4epanbuo rocyAapcrBeHHoe e yqpex(AeHlre 6roANerHo o6pasonareJrbuoe e BbrcrrreroupoS eccr4 HElnburo o6pason auvrfl. o6pason auvrfl. o6pason auvrfl. oAc KrfyrHrefi) hAc KrfyrHrefi) HAc Krfrcy. hffiffi) p rro HayrrHofipa6ore oHHOfi AeflTenbHOCTH w(8* (("- B. E. Kyreuon 2011it|AP IIPOTPAMMA BCTyrrr4TenbH oro 3K3aMeHa B acrll4paHTypy n o cleqr4€urbHocTu 05.21.01 - TexsoJrorlrf, vrMarnr4Hbr Jreco3aroroBoK r4 JrecHofo xo3flficrsa IIo...»
«1 Antall navn / informasjon om gribber VolgGTU Type litteratur VPI KTI Total Planned Custom Educational literature Lærebøker. 1/1 – – – 1/1 Opplæring. 67/19 7/3 14/14 31/5 119/41 Elektroniske analoger av trykte publikasjoner. 26/0 – 40/0 – 66/0 Vitenskapelig litteratur Proceedings of VolgGTU. 12 3 – – 15 Proceedings of vitenskapelige konferanser. 5 1 2 2 Monografier (IUNL og andre forlag). 43 – 6 1 108 66 119 Utdanningslitteratur. INNHOLD Tematisk plan for VolgGTU .. Pedagogisk litteratur .. Vitenskapelig ... "
“(UTKAST, IKKE GODKJENT) METODOLOGISKE ANBEFALINGER FOR VURDERING AV EFFEKTIVITETEN AV INVESTERINGSPROSJEKTER _ (Tredje utgave, korrigert og supplert) Moskva - 2008 METODOLOGISKE ANBEFALINGER (ikke godkjent, utkast) .N.LivskhnaGsrovsha,Alivs.hitsha.Livs Deltakere: N. G. Aleshinsky, P. L. Vilensky, I. A. Nikonova, A. A. Pervozvansky, G. P. Pischasov, N. Ya. Ryabikova, S. A. Smolyak, V. P. Trofimov. 2 METODOLOGISKE ANBEFALINGER (ikke godkjent, ... "
"Rømmere av kombinerte overflater av revolusjon Retningslinjer for studenter innen opplæringsområder 262000 Teknologi for lettindustriprodukter, 262200 Design av lettindustriprodukter Ivanovo 2012 Ministry of Education and Science of the Russian Federation Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education Ivanovo State Tekstilakademiet (IGTA) Institutt for ingeniørgrafikk Kombinerte reamer-overflater..."
«Saint-Petersburg State University Graduate School of Management METODOLOGISKE INSTRUKSJONER FOR FORBEREDELSE AV KURSARBEID PÅ PROFILEN AV TRENING I BACHELORPROGRAMMET I RETNING 080500 - LEDELSE Satt sammen av: Assoc. Baranov I.N., Assoc. Zenkevich N.A., Assoc. Fedotov Yu.V. Publisert i henhold til vedtak fra utdannings- og metodologisk kommisjon ved Graduate School of Management, St. Petersburg State University St. Petersburg 2009 1. GENERELLE BESTEMMELSER 1.1. Forberedelse og forsvar av kursarbeid med profilen til opplæringen (heretter referert til som semesteroppgave) er ... "
"Den russiske føderasjonens utdannings- og vitenskapsdepartement Federal State Autonome Educational Institution of Higher Professional Education Ural Federal University oppkalt etter den første presidenten i Russland B.N. Jeltsin-instituttet for offentlig administrasjon og entreprenørskap METODOLOGISKE ANBEFALINGER FOR SKRIVING OG REGISTRERING AV KONTROLL- OG KURSARBEID, BACHELORS KVALIFIKASJONSARBEID, SPESIALISTS DIPLOMAPROSJEKT, MASTEROPPGAVE Ekaterinburg...»20
”Metodologiske retningslinjer for å føre budsjettregnskap og utarbeide budsjettrapportering av finansmyndigheter Innhold INNLEDNING 1. GENERELLE BESTEMMELSER 2. BUDSJETTREGNSKAP I FINANSIELLE MYNDIGHETER 2.1. Regnskap for midler i budsjettregnskap 2.1.1. Konto 0.202.00.000 Midler på budsjettregnskap. 2.1.2. Konto 0.202.01.000 Midler til den enhetlige budsjettkontoen. 2.1.3. Konto 0.202.02.000 Budsjettmidler er på vei. 2.1.4. Konto 0.202.03.000 Budsjettmidler i utenlandsk valuta.37 2.1.5. Refleksjon av indikatorer for saldo og omsetning etter ... "
Protein i kjemiske termer er et molekyl av samme type, som er en polyaminosyrekjede eller polymer. Den er sammensatt av aminosyresekvenser av 20 typer. Etter å ha lært strukturen til proteiner, stilte folk seg selv spørsmålet: er det mulig å designe helt nye aminosyresekvenser slik at de utfører funksjonene som en person trenger mye bedre enn vanlige proteiner? For denne vågale ideen er navnet best egnet proteinteknikk.
De begynte å tenke på slik konstruksjon tilbake på 50-tallet av XX-tallet. Dette skjedde umiddelbart etter dekodingen av de første proteinaminosyresekvensene. I mange laboratorier i verden har det blitt gjort forsøk på å duplisere naturen og kjemisk syntetisere polyaminosyresekvenser gitt helt vilkårlig.
Mest av alt lyktes kjemikeren B. Merrifield med dette. Denne amerikaneren klarte å utvikle en ekstremt effektiv metode for syntese av polyaminosyrekjeder. Merrifield ble tildelt Nobelprisen i kjemi i 1984 for dette.
Amerikaneren begynte å syntetisere korte peptider, inkludert hormoner. Samtidig bygde han en automat – en «kjemisk robot» – som hadde som oppgave å produsere kunstige proteiner. Roboten skapte en sensasjon i vitenskapelige kretser. Imidlertid ble det snart klart at produktene hans ikke kunne konkurrere med det naturen produserer.
Roboten kunne ikke nøyaktig reprodusere aminosyresekvensene, det vil si at den var feil. Han syntetiserte en kjede med en sekvens, og den andre med en litt annen. I en celle er alle molekyler av ett protein ideelt sett like hverandre, det vil si at sekvensene deres er nøyaktig de samme.
Det var også et annet problem. Selv de molekylene som roboten syntetiserte riktig tok ikke den romlige formen som er nødvendig for enzymets funksjon. Dermed har forsøket på å erstatte naturen med de vanlige metodene for organisk kjemi ført til svært beskjeden suksess.
Forskere måtte lære av naturen og lete etter de nødvendige modifikasjonene av proteiner. Poenget her er at det hele tiden forekommer mutasjoner i naturen, noe som fører til en endring i aminosyresekvensene til proteiner.
Hvis vi velger mutanter med de nødvendige egenskapene, for eksempel mer effektivt behandle dette eller det substratet, kan vi isolere fra en slik mutant et endret enzym, på grunn av hvilket cellen får nye egenskaper. Men denne prosessen tar veldig lang tid.
Alt endret seg da genteknologi dukket opp. Takket være henne begynte de å lage kunstige gener med hvilken som helst sekvens av nukleotider. Disse genene ble satt inn i preparerte vektormolekyler og disse DNA-ene ble introdusert i bakterier eller gjær. Der ble en kopi av RNA fjernet fra det kunstige genet. Som et resultat ble det ønskede proteinet produsert. Feil i syntesen ble ekskludert. Hovedsaken var å velge riktig DNA-sekvens, og så gjorde det enzymatiske systemet til selve cellen jobben sin feilfritt.
Dermed kan vi konkludere med at genteknologi har åpnet veien for proteinutvikling i sin mest radikale form. For eksempel valgte vi et protein og ønsket å erstatte en aminosyrerest i den med en annen.
Før du starter arbeidet med erstatningen, er det nødvendig å forberede en DNA-vektor. Dette er viralt eller plasmid-DNA med genomet til proteinet som interesserer oss innebygd i det. Du må også kjenne til nukleotidsekvensen til genet og aminosyresekvensen til det kodede proteinet. Sistnevnte bestemmes fra førstnevnte ved hjelp av den genetiske kodetabellen.
Ved hjelp av tabellen er det også enkelt å fastslå hvilke minimumsendringer som bør gjøres i sammensetningen av genet slik at det begynner å kode ikke originalen, men proteinet endret etter vår forespørsel. La oss si at i midten av genet må du erstatte guanin med tymin.
På grunn av en slik bagatell er det ikke nødvendig å re-syntetisere hele genet. Bare et lite fragment av nukleotider syntetiseres, komplementært til stedet, i midten av hvilket guanin-nukleotidet som er valgt for erstatning er lokalisert.
Det resulterende fragmentet blandes med en DNA-vektor (sirkulært DNA), som inneholder genet vi trenger. DNA-ringen og det syntetiserte fragmentet lager en del av Watson-Crick-dobbelthelixen. I den blir det sentrale paret "skjøvet ut" av den doble helixen, siden den er dannet av gjensidig ikke-komplementære nukleotider.
Tilsett fire dNTP-er og DNA-polymerase til løsningen. Sistnevnte, ved å bruke et fragment som fester seg til en enkelt ring, fullfører den til en komplett ring i full overensstemmelse med komplementaritetsprinsippet.
Resultatet er nesten normalt vektor-DNA. Det kan injiseres i en gjær- eller bakteriecelle for reproduksjon. Det eneste er at dette DNA skiller seg fra den opprinnelige vektoren med et ikke-komplementært par. Helixen til DNA-vektoren er med andre ord ikke helt perfekt.
Ved den aller første handlingen med å doble den resulterende vektoren, sammen med bakterien som bærer den, vil hvert av datter-DNA-molekylene bli en perfekt dobbelhelix langs hele lengden. Imidlertid bærer ett av dattermolekylene det opprinnelige nukleotidparet, og det andre har en mutantvektor på dette stedet, på grunnlag av hvilken det mutante proteinet som er interessant for oss, oppnås.
Dermed skaper proteinteknikk en blanding av celler. Noen av dem bærer den opprinnelige vektoren med villtypegenet, mens andre celler bærer det muterte genet. Det gjenstår å velge fra denne blandingen nøyaktig de cellene der mutantgenet er lokalisert.
PROTEIN ENGINEERING, en gren av molekylærbiologi og bioteknikk, hvis oppgaver inkluderer målrettet endring av strukturen til naturlige proteiner og produksjon av nye proteiner med ønskede egenskaper. Proteinteknikk oppsto på begynnelsen av 1980-tallet, da det ble utviklet genteknologiske metoder som gjorde det mulig å oppnå ulike naturlige proteiner ved bruk av bakterier eller gjær, samt endre strukturen til gener på en bestemt måte og følgelig aminosyresekvensen ( primær struktur) av proteinene de koder for. Basert på prinsippene for organisering av proteinmolekyler, forholdet mellom strukturen og funksjonen til proteiner, skaper proteinteknikk en vitenskapelig basert teknologi for rettede endringer i deres struktur. Ved hjelp av proteinteknikk er det mulig å øke den termiske stabiliteten til proteiner, deres motstand mot denaturerende effekter, organiske løsningsmidler og å endre deres ligandbindende egenskaper. Proteinteknikk gjør det mulig å forbedre funksjonen til enzymer og deres spesifisitet ved å erstatte aminosyrer, endre de optimale pH-verdiene som enzymet fungerer ved, eliminere uønskede sideaktiviteter, eliminere molekylære områder som hemmer enzymatiske reaksjoner, øke effektiviteten til protein narkotika og så videre. For eksempel tillot erstatningen av bare én treoninrest med en alanin- eller prolinrest en 50 ganger økning i aktiviteten til tyrosyl tRNA-syntetase-enzymet, og på grunn av erstatningen av 8 aminosyrerester, den såkalte termolysin-lignende protease fra Bacillus stearothermophilus fikk evnen til å opprettholde aktivitet ved 120 ° C i flere timer. . Proteinteknikk inkluderer også arbeid med rettet endring i egenskapene til proteiner ved bruk av kjemiske modifikasjoner, for eksempel introduksjonen av fotoaktiverte forbindelser som endrer egenskapene til et molekyl under påvirkning av lys, merker forbindelser som gjør det mulig å spore veiene til et protein i en celle eller dirigere den til ulike komponenter i en celle, og så videre lignende. Slikt arbeid utføres hovedsakelig på rekombinante proteiner oppnådd ved bruk av genteknologiske metoder.
To retninger kan skilles i proteinteknikk: rasjonell design og rettet molekylær utvikling av proteiner. Den første innebærer bruk av informasjon om de strukturelle-funksjonelle relasjonene i proteiner, oppnådd ved bruk av fysiokjemiske og biologiske metoder, samt datamolekylær modellering, for å bestemme hvilke endringer i primærstrukturen som skal føre til ønsket resultat. For å øke den termiske stabiliteten til et protein, er det derfor nødvendig å bestemme dets romlige struktur, identifisere "svake" områder (for eksempel aminosyrer som ikke er sterkt forbundet med miljøet), velge de beste alternativene for erstatninger for andre aminosyrer. syrer ved hjelp av molekylær modellering og optimalisering av energiparametrene til molekylet; muter deretter det korresponderende genet, og innhent og analyser mutantproteinet. Hvis dette proteinet ikke oppfyller de angitte parameterne, utfør en ny analyse og gjenta den beskrevne syklusen. Denne tilnærmingen brukes oftest når det gjelder utforming av kunstige proteiner (de novo-proteiner) med ønskede egenskaper, når inngangen er en ny aminosyresekvens, for det meste eller fullstendig spesifisert av et menneske, og utgangen er et proteinmolekyl med ønsket kjennetegn. Så langt kan imidlertid bare små de novo-proteiner med en enkel romlig struktur oppnås på denne måten, og enkle funksjonelle aktiviteter kan introduseres i dem, for eksempel metallbindingsseter eller korte peptidfragmenter som bærer en hvilken som helst biologisk funksjon.
I den regisserte molekylære utviklingen av proteiner oppnås et stort sett av forskjellige mutante gener av målproteinet ved hjelp av genteknologiske metoder, som deretter uttrykkes på en spesiell måte, spesielt på overflaten av fager («fagvisning») eller i bakterieceller, for å gjøre det mulig å velge mutanter med de beste egenskapene. For dette formål integreres for eksempel genene til det ønskede proteinet eller dets deler i faggenomet - i sammensetningen av genet som koder for proteinet lokalisert på overflaten av fagpartikkelen. Samtidig bærer hver enkelt fag sitt eget mutante protein, som har visse egenskaper, som seleksjon gjøres etter. Mutante gener produseres ved å "blande" et sett med gener fra lignende naturlige proteiner fra forskjellige organismer, vanligvis ved å bruke polymerasekjedereaksjonsmetoden, slik at hvert resulterende mutantprotein kan inkludere fragmenter av mange av "foreldre"-proteinene. I hovedsak etterligner denne tilnærmingen den naturlige utviklingen av proteiner, men bare i et mye raskere tempo. Hovedoppgaven til en proteiningeniør i dette tilfellet er å utvikle et effektivt seleksjonssystem som gjør det mulig å velge de beste mutante proteinvariantene med de ønskede parameterne. Når det gjelder oppgaven ovenfor - for å øke den termiske stabiliteten til proteinet - kan seleksjon utføres for eksempel ved å dyrke celler som inneholder mutante gener ved forhøyet temperatur (forutsatt at tilstedeværelsen av et mutant protein i cellen øker dets termisk stabilitet).
Begge disse områdene innen proteinteknikk har samme mål og utfyller hverandre. Dermed gjør studiet av mutante proteinvarianter oppnådd ved hjelp av molekylære evolusjonsmetoder det mulig å bedre forstå den strukturelle og funksjonelle organiseringen av proteinmolekyler og bruke kunnskapen som er oppnådd for målrettet rasjonell design av nye proteiner. Videreutvikling av proteinteknikk gjør det mulig å løse mange praktiske problemer med å forbedre naturlige og skaffe nye proteiner for behovene til medisin, landbruk og bioteknologi. I fremtiden er det mulig å lage proteiner med funksjoner som er ukjente i naturen.
Lit.: Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Protein engineering 20 år på // Nature Reviews. Molekylær cellebiologi. 2002 Vol. 3. nr. 12; Patrushev L. I. Kunstige genetiske systemer. M., 2004. Vol. 1: Gen- og proteinteknologi.
Metoder for genteknologi, spesielt kloning av individuelle gener eller deres deler, samt DNA-sekvensering, har gjort det mulig å forbedre metodikken for mutagenese betydelig, og eliminere hovedulempene med klassiske metoder for å indusere mutasjoner i genomer. Klassisk genetisk analyse antar effekten av en mutagen faktor in vivo på hele genomet, noe som resulterer i tilfeldige mutasjoner, ofte multiple, noe som i stor grad kompliserer identifiseringen av mutanter. Identifikasjonen av mutanter utføres av endrede fenotypiske egenskaper, og arten av mutasjonen kan bestemmes etter DNA-sekvensering. Moderne lokalisert mutagenese involverer faktisk de omvendte handlingene: først klones genet eller dets segment av interesse, dets struktur bestemmes under sekvensering, og deretter gjøres de nødvendige endringene in vitro i sammensetningen. Konsekvensene av den induserte mutasjonen bestemmes etter introduksjonen av mutantgenet i den opprinnelige organismen.
Den enkleste varianten av lokalisert mutagenese er behandling av et klonet DNA-fragment med en av de mutagene faktorene, men slik eksponering vil også resultere i tilfeldige endringer i strukturen til fragmentet. Mer pålitelige og mer vanlig brukte metoder for lokalisert mutagenese utføres uten bruk av mutagene faktorer. Blant typene mutasjoner dominerer slettinger, innsettinger og nukleotidsubstitusjoner.
Slettinger. Disse typene mutasjoner produseres av endonukleaser ved lokalisert mutagenese. Både restriktive og ikke-spesifikke endonukleaser brukes. Den enkleste bruken av restriksjonsenzymer er å spalte et genom med et restriksjonsenzym som introduserer flere brudd med dannelse av klebrige ender. De resulterende fragmentene lukkes igjen i en ring med DNA-ligase, noe som kan føre til dannelse av molekyler som ikke inneholder et av DNA-segmentene. Denne tilnærmingen produserer store delesjoner og brukes vanligvis i foreløpige eksperimenter for å bestemme funksjonene til relativt store deler av klonet DNA.
Små slettinger oppnås som følger. Det klonede fragmentet spaltes i vektoren på det passende stedet med et restriksjonsenzym (fig. 21.1). Det resulterende lineære molekylet behandles med eksonuklease III, som hydrolyserer en tråd i DNA,
starter fra 3'-enden. Resultatet er et sett med molekyler med enkelttrådete 5'-haler av forskjellig lengde. Disse halene hydrolyseres av enkelttrådet DNA-spesifikk S1-nuklease, og delesjoner dannes i DNA. Det er også mulig å bruke eksonuklease Bal 31, som katalyserer nedbrytningen av begge trådene, med utgangspunkt i endene av lineære DNA-molekyler. Forløpet av nukleotiske reaksjoner reguleres ved å variere inkubasjonstiden, temperaturen og enzymkonsentrasjonen, noe som induserer dannelsen av delesjoner av forskjellige lengder. De resulterende lineære DNA-delesjonsvariantene er ofte forsynt med linkere før cyklisering slik at restriksjonsseter er tilstede i området for delesjonen. Det er andre modifikasjoner av de beskrevne metodene.
Innlegg (innlegg). For å oppnå innsettinger fordøyes det klonede DNAet med et restriksjonsenzym eller en ikke-spesifikk endonuklease, og deretter ligeres de resulterende fragmentene i nærvær av segmentet som skal settes inn i DNA. Oftest brukes kjemisk syntetiserte polylinkere som slike segmenter (kapittel 20).
Innsettinger, som slettinger, kan forstyrre integriteten til genet eller strukturen til dets regulatoriske regioner, noe som resulterer i syntese av et defekt protein (i tilfelle av utvidede slettinger eller en rammeskift, vanligvis inaktiv) eller endringer i transkripsjonsprosessen til gen av interesse. Regulatoriske mutanter oppnås ofte på denne måten og uttrykte vektorer konstrueres (kapittel 20).
Punktmutasjoner . Disse mutasjonene er nukleotidsubstitusjoner. Flere tilnærminger kan brukes for å oppnå dem: cytosin-deaminering, inkludering av nukleotidanaloger, feil inkludering av nukleotider under reparasjon av gap, etc.
Den første metoden er basert på at cytosinrester i enkelttrådet DNA kan deamineres til uracil ved behandling med bisulfittioner. Enkeltrådede regioner i DNA oppnås vanligvis nær restriksjonsseter, for eksempel ved virkningen av eksonuklease III. Etter behandling med bisulfitt fylles de enkelttrådede hullene med DNA-polymerase og endene ligeres. På steder hvor uridylat ble dannet i stedet for cytidylat under deaminering, vil adenylat innta den komplementære posisjonen, og under replikasjonen av et slikt molekyl vil GC-paret bli erstattet av AT-paret.
En annen tilnærming til induksjon av substitusjoner er å behandle klonet DNA med noe restriksjonsenzym i nærvær av etidiumbromid, som setter inn mellom baseparplanene og introduserer forstyrrelser i dupleksstrukturen. Som et resultat dannes bare et enkelt-tråds DNA-brudd. Et lite gap dannes på stedet for enkelttrådbruddet og bygges deretter opp i nærvær av DNA-polymerase, dATP, dGTP, dCTP og N-4-hydroksycytosintrifosfat i stedet for dTTP. Hydroksycytosintrifosfat er inkludert i kjeden i stedet for tymidylat, men under DNA-replikasjon pares det like godt med både adenylat og guanylat. Som et resultat av inkorporeringen av guanylat, etter en ekstra runde med replikering, vil AT → GC-substitusjonen skje på dette stedet (fig. 21.2). Siden i denne metoden utføres nukleotiderstatning på innsiden
restriksjonssted, blir det mulig å enkelt skille mellom vektorer med den opprinnelige sekvensen og muterte. For å gjøre dette er det nok å behandle dem med restriksjonsenzymet som ble brukt i eksperimentet: mutantmolekylene vil ikke gjennomgå spaltning.
En lignende metode er basert på bruk av kun tre av de fire mulige nukleotidene når man fyller et enkelt-trådet gap med DNA-polymerase. I de fleste tilfeller stopper enzymet på stedet for molekylet der det møter et komplementært nukleotid til det manglende. Men av og til tar DNA-polymerasen feil og inkluderer en av de tre tilstedeværende nukleotidene. Dette fører til dannelsen av ringmolekyler, som inneholder uparrede ikke-komplementære nitrogenholdige baser. Når slike vektorer introduseres i bakterieceller, vil noen av molekylene reparere slike skader. Som et resultat vil den opprinnelige sekvensen gjenopprettes i halvparten av molekylene etter replikasjon, og mutasjonen vil bli fikset i den andre halvdelen. Mutante molekyler kan skilles ut ved metoden beskrevet ovenfor.
Stedspesifikk mutagenese. De lokaliserte mutagenesemetodene som er karakterisert er karakterisert ved at stedene hvor mutasjoner oppstår er valgt tilfeldig. Samtidig gjør teknikken med stedsspesifikk mutagenese det mulig å introdusere mutasjoner i en nøyaktig definert region av et gen. Dette utføres ved bruk av syntetiske (oppnådd ved kjemisk syntese) oligonukleotider med en gitt sekvens. Fremgangsmåten er hensiktsmessig ved at den ikke krever tilstedeværelse av hensiktsmessige restriksjonsseter. Metoden er basert på dannelsen av heteroduplekser mellom et syntetisk oligonukleotid som inneholder en mutasjon og komplementært enkelttrådet DNA i vektoren.
Fortsett som følger. Det syntetiseres et lite oligonukleotid (8-20 monomerer) som er komplementært til den delen av genet de ønsker å få en mutasjon i. I sammensetningen av oligonukleotidet i den sentrale regionen er en eller flere nukleotidsubstitusjoner tillatt. Det undersøkte genet eller dets fragment klones i vektoren basert på M13-fagen for å oppnå sirkulært enkelttrådet rekombinant DNA. Produser blanding og annealing av rekombinante vektorer med oligonukleotider. Oligonukleotidet hybridiserer med den komplementære regionen, mens ikke-komplementære nukleotider forblir uparrede. Oligonukleotidet fungerer som en primer i polymerasereaksjonen som involverer DNA-polymerase in vitro. Ringen er lukket med ligaser. Det resulterende sirkulære molekylet introduseres i E. coli-celler, hvor delvis reparasjon av mutante replikasjonssteder skjer. Mutasjonsraten varierer vanligvis fra 1 til 50 %. Seleksjonen av celler som inneholder mutante DNA-molekyler kan utføres på flere måter, blant annet har fremgangsmåten ved bruk av et radioaktivt merket oligonukleotid, som brukes til mutagenese, fordelen. I dette tilfellet fungerer dette nukleotidet som en sonde. Prinsippet for å bruke en slik probe er basert på det faktum at den er fullstendig komplementær til mutant DNA og delvis komplementær til villtype DNA. Det er mulig å velge slike hybridiseringsbetingelser (først og fremst temperatur) at hybridisering av den merkede proben vil være stabil kun med mutant-DNA-sekvensen, som kan påvises ved radioautograf.
Metoden for stedsspesifikk mutagenese er spesielt verdifull fordi den lar en isolere mutasjoner uten å kontrollere deres fenotypiske manifestasjon. Denne metoden åpner for nye muligheter for å studere funksjonene til genregulerende elementer, lar deg endre "styrken" til promotorer, optimalisere bindingssteder med ribosomer, etc. En av hovedapplikasjonene til denne metodikken er proteinteknikk.
Proteinteknikk. Denne frasen refererer til et sett med metodiske teknikker som tillater rekonstruksjon av et proteinmolekyl ved målrettet introduksjon av passende mutasjoner i et strukturelt gen (stedspesifikk mutagenese) og følgelig de ønskede aminosyresubstitusjonene i proteinets primærstruktur.
Et illustrerende eksempel på konstruksjon av mer aktive proteiner er eksperimentene til Fersht og medarbeidere med enzymet tyrosyl-tRNA-syntetase fra bakterien Bacillus stearothermophilus. En analyse av konsekvensene av aminosyresubstitusjoner i det aktive sentrum av dette enzymet førte til konklusjonen at fjerning av grupper som danner svake hydrogenbindinger med substratet kan forbedre dets affinitet for substratet. Det ble funnet at treonin-51 (det opptar den 51. posisjonen i peptidet) danner en lang og svak hydrogenbinding med oksygenet i riboseringen når tyrosyladenylat bindes. Samtidig ble det funnet at prolin inntar samme posisjon i E. coli-bakterier. Stedspesifikk mutagenese av genet som bestemmer strukturen til B.stearothermophilus tyrosyl-tRNA-syntetase gjorde det mulig å gi en erstatning thr-51→pro-51 i et peptid. Som et resultat ble bindingen av ATP i det aktive senteret av enzymet dramatisk forbedret, og dets katalytiske aktivitet økte 25 ganger.
Et annet like viktig eksempel på proteinrekonstruksjon av praktisk betydning er modifikasjonen av subtilisin fra Bacillus amyloliquefaciens, utført av Estelle et al. Subtilisiner er serinproteinaser som skilles ut av basiller til miljøet. Disse enzymene produseres i stor skala av bioteknologiindustrien og er mye brukt i vaskemiddelformuleringer. Ulempen med subtilisiner er en kraftig reduksjon i proteolytisk aktivitet under virkningen av oksidasjonsmidler, inkludert de som finnes i vaskepulver. Oppgaven med å rekonstruere BPN-subtilisinmolekylet var å stabilisere det mot kjemisk oksidasjon.
I foreløpige eksperimenter ble det funnet at i nærvær av hydrogenperoksid reduserer subtilisin raskt aktiviteten på grunn av oksidasjonen av metionin-222-resten, som blir til det tilsvarende sulfoksidet. Metoder for stedsspesifikk mutagenese sikret erstatning av denne metioninresten med alle de andre 19 proteinaminosyrene. Plasmider med mutante gener ble introdusert i stammer med delesjoner i de tilsvarende gener og egenskapene til de produserte subtilisinene ble analysert. Mutanter med serin og alanin viste seg å være tilstrekkelig stabile for virkningen av peroksid222. Mutanten som inneholdt cystein-222-resten viste seg å være den mest aktive; dens spesifikke aktivitet oversteg villtype-stammen med 38%.
På lignende måte var det mulig å øke aktiviteten til b-interferon. Blant andre prestasjoner innen proteinteknikk kan man nevne studier for å belyse den transformerende aktiviteten til onkoproteiner; å endre termostabiliteten til enzymer, for eksempel oppnå termolabilt renin og termostabil a-amylase; en økning i effektiviteten av insulinbinding av den tilsvarende plasmamembranreseptoren på grunn av erstatning av histidin med aspartat i posisjon 10 i b-kjeden til hormonet, så vel som mange andre eksempler. Et stort antall proteintekniske produkter har allerede funnet praktiske anvendelser i produksjonsprosesser.
Proteiningeniørteknologi brukes (ofte i kombinasjon med metoden for rekombinant DNA) for å forbedre egenskapene til eksisterende proteiner (enzymer, antistoffer, cellereseptorer) og skape nye proteiner som ikke finnes i naturen. Slike proteiner brukes til å lage legemidler, matforedling og industriell produksjon.
For tiden er den mest populære anvendelsen av proteinteknikk å modifisere de katalytiske egenskapene til enzymer for å utvikle "miljøvennlige" industrielle prosesser. Fra et miljøsynspunkt er enzymer den mest akseptable av alle katalysatorer som brukes i industrien. Dette sikres av biokatalysatorers evne til å løse seg opp i vann og fungere fullt ut i et miljø med nøytral pH og ved relativt lave temperaturer. I tillegg, på grunn av deres høye spesifisitet, resulterer bruken av biokatalysatorer i svært få uønskede biprodukter fra produksjonen. Miljøvennlige og energibesparende industrielle prosesser som bruker biokatalysatorer har lenge vært aktivt introdusert i kjemiske, tekstil-, farmasøytiske, tremasse og papir-, mat-, energi- og andre områder av moderne industri.
Noen egenskaper ved biokatalysatorer gjør imidlertid bruken av dem i noen tilfeller uakseptabel. For eksempel brytes de fleste enzymer ned når temperaturen stiger. Forskere prøver å overvinne slike hindringer og øke stabiliteten til enzymer under tøffe produksjonsforhold ved å bruke proteinteknikker.
I tillegg til industrielle applikasjoner har proteinteknikk funnet sin rettmessige plass i medisinsk utvikling. Forskere syntetiserer proteiner som kan binde seg til virus og mutante tumorfremkallende gener og gjøre dem ufarlige; lage svært effektive vaksiner og studere celleoverflatereseptorproteiner, som ofte er mål for farmasøytiske legemidler. Matforskere bruker proteinteknikk for å forbedre kvalitetene til proteiner som bevarer plantemat, samt geleringsmidler eller fortykningsmidler.
Et annet anvendelsesområde for proteinteknikk er å lage proteiner som kan nøytralisere stoffer og mikroorganismer som kan brukes til kjemiske og biologiske angrep. For eksempel er hydrolase-enzymer i stand til å nøytralisere både nervegasser og plantevernmidler som brukes i landbruket. Samtidig er produksjon, lagring og bruk av enzymer ikke farlig for miljø og menneskers helse.
Biblioteker av peptider og epitoper
I en levende organisme styres de fleste biologiske prosesser av spesifikke protein-protein- eller protein-nukleinsyreinteraksjoner. Slike prosesser inkluderer for eksempel regulering av gentranskripsjon under påvirkning av ulike proteinfaktorer, interaksjonen av proteinligander med reseptorer på celleoverflaten og den spesifikke bindingen av antigener av de tilsvarende antistoffene. Å forstå de molekylære mekanismene for interaksjonen mellom proteinligander og reseptorer er av stor grunnleggende og anvendt betydning. Spesielt begynner utviklingen av nye medikamenter av proteinkarakter vanligvis med identifiseringen av den innledende aminosyresekvensen som har den ønskede biologiske aktiviteten (den såkalte "hoved" (hoved)sekvensen). Imidlertid kan peptider med en basisk aminosyresekvens også ha uønskede biologiske egenskaper: lav aktivitet, toksisitet, lav stabilitet i kroppen, etc.
Før bruken av peptidbiblioteker ble forbedringen av deres biologiske egenskaper utført ved sekvensiell syntese av et stort antall analoger og testing av deres biologiske aktivitet, noe som krevde mye tid og penger. De siste årene har det blitt mulig å lage tusenvis av forskjellige peptider på kort tid ved hjelp av automatiske synthesizere. De utviklede metodene for stedsrettet mutagenese gjorde det også mulig å dramatisk utvide antallet proteiner oppnådd samtidig og sekvensielt testet for biologisk aktivitet. Imidlertid har bare nylig utviklede tilnærminger for å lage peptidbiblioteker ført til produksjon av millioner av aminosyresekvenser som kreves for effektiv screening for å identifisere blant dem peptidene som best oppfyller kriteriene. Slike biblioteker brukes til å studere interaksjonen mellom antistoffer og antigener, for å utvikle nye enzymhemmere og antimikrobielle midler, for å designe molekyler med ønsket biologisk aktivitet, eller for å gi nye egenskaper til proteiner, som antistoffer.
Peptidbiblioteker er delt inn i tre grupper i henhold til metodene for å oppnå. Den første gruppen inkluderer biblioteker oppnådd ved bruk av kjemisk syntese av peptider, der individuelle peptider er immobilisert på mikrobærere. Med denne tilnærmingen, etter tilsetning av de neste aminosyrene i individuelle reaksjonsblandinger til peptider immobilisert på mikrobærere, blir innholdet i alle reaksjonsblandinger kombinert og delt inn i nye porsjoner, som brukes i neste trinn med tilsetning av nye aminosyrerester. Etter en rekke slike trinn syntetiseres peptider som inneholder sekvensene av aminosyrer som brukes i syntesen i alle slags tilfeldige kombinasjoner.
Biblioteker av peptider immobilisert på mikrobærere har en betydelig ulempe: de krever bruk av rensede reseptorer i løselig form for screening. Samtidig, i de fleste tilfeller, i biologiske tester utført for grunnleggende og farmakologisk forskning, brukes membranassosierte reseptorer oftest. I henhold til den andre metoden oppnås peptidbiblioteker ved bruk av fastfase peptidsyntese, hvor ekvimolare blandinger av alle eller noen forløperaminosyrer brukes på hvert trinn av den kjemiske addisjonen av den neste aminosyren til voksende peptidkjeder. På siste trinn av syntesen separeres peptidene fra bæreren, dvs. konvertere dem til en løselig form. Den tredje tilnærmingen til konstruksjon av peptidbiblioteker, som vi nå skal beskrive, har blitt reell nettopp på grunn av utviklingen av genteknologiske metoder. Det illustrerer perfekt mulighetene for slike metoder og er utvilsomt en stor prestasjon i deres anvendelse. I denne forbindelse, la oss vurdere mer detaljert resultatene av bruk av peptidbiblioteker i studiet av epitoper (antigene determinanter) av proteiner.
Genteknologi for å oppnå hybridproteiner har gjort det mulig å utvikle en effektiv metode for produksjon av korte peptider for analyse av deres biologiske aktivitet. Som i tilfellet med genbiblioteker, representerer genmanipulerte peptidbiblioteker et stort (ofte uttømmende) sett med korte peptider. To nyere observasjoner gjør det mulig å vurdere et peptidbibliotek samtidig som et bibliotek av proteinepitoper. For det første kan korte peptider inkludere alle de viktigste aminosyrerestene som spiller en stor rolle i interaksjon med antistoffer, og de er i stand til å etterligne de store antigene determinantene til proteiner. For det andre, i de fleste tilfeller utgjør ikke-kovalente bindinger dannet mellom de få viktigste aminosyrerestene til proteinligander og deres reseptorer hovedbidraget til den totale energien til ligand-reseptorinteraksjonen. Med dette i tankene kan ethvert peptid betraktes som en potensiell ligand, hapten eller en del av den antigene determinanten til større polypeptider, og ethvert peptidbibliotek kan betraktes som et bibliotek av proteinepitoper eller potensielle ligander for de tilsvarende proteinreseptorene.
Peptidbiblioteket oppnådd som et resultat av implementeringen av den tredje tilnærmingen, i sin moderne form, er et sett med titalls eller til og med hundrevis av millioner av korte forskjellige aminosyresekvenser som uttrykkes på overflaten av bakteriofagvirioner som en del av deres egne strukturelle proteiner. Dette blir mulig på grunn av introduksjonen av hybride rekombinante gener som koder for endrede strukturelle proteiner av dets virioner i bakteriofaggenomet ved hjelp av genteknologi. (Denne metoden er kjent som fagvisning.) Som et resultat av ekspresjonen av slike gener dannes hybridproteiner, ved N- eller C-terminalen hvor det er ytterligere aminosyresekvenser.
Biblioteker av peptider og epitoper vil også finne sin anvendelse i studier av mekanismene for den humorale immunresponsen, samt sykdommer i immunsystemet. Spesielt er de fleste autoimmune sykdommer ledsaget av dannelsen av autoantistoffer mot kroppens egne antigener. Disse antistoffene fungerer i mange tilfeller som spesifikke markører for en bestemt autoimmun sykdom. Ved å bruke et epitopbibliotek er det i prinsippet mulig å oppnå peptidmarkører som det vil være mulig å overvåke spesifisiteten til autoantistoffer under utviklingen av en patologisk prosess både i en individuell organisme og i en gruppe pasienter og i tillegg, å bestemme spesifisiteten til autoantistoffer i sykdommer med ukjent etiologi.
Biblioteker av peptider og epitoper kan potensielt også brukes for screening av immunsera for å identifisere peptider som spesifikt interagerer med beskyttende antistoffer. Slike peptider vil etterligne de antigene determinantene til patogene organismer og tjene som mål for kroppens beskyttende antistoffer. Dette vil tillate bruk av slike peptider for vaksinasjon av pasienter som mangler antistoffer mot de respektive patogenene. Studiet av epitoper ved bruk av peptidbiblioteker er et spesielt tilfelle av et av de mange bruksområdene i anvendte og grunnleggende studier av samspillet mellom ligander og reseptorer. Ytterligere forbedring av denne tilnærmingen bør bidra til å lage nye medisiner basert på korte peptider og være nyttig i grunnleggende studier av mekanismene for protein-protein-interaksjoner.