Pagkuha ng interferon sa pamamagitan ng genetic engineering. Paraan para sa pagkuha ng human immune interferon. Mycotoxins at antibiotics

10267 0

Biosynthesis ng somatotropin at iba pang mga hormone ng tao

Ang human growth hormone, o somatotropin, ay na-synthesize sa utak ng tao sa anterior pituitary gland. Ito ay unang nahiwalay mula sa cadaveric na materyal at nalinis noong 1963. Sa kakulangan ng growth hormone, ang pituitary dwarfism ay bubuo, ang saklaw nito ay tinatayang nasa 7 hanggang 10 kaso bawat milyong tao.

Ang hormone ay partikular sa species, ibig sabihin, hindi tulad ng insulin, ang mga hormone sa paglaki ng hayop ay walang aktibidad sa katawan ng tao. Samakatuwid, ang tanging lunas para sa pituitary dwarfism ay pituitary hormone, na nakahiwalay sa mga bangkay. Ipinakita ng mga pag-aaral na sa intramuscular injection ng somatotropin sa mga dosis na 10 mg bawat 1 kg ng timbang ng katawan sa loob ng isang taon, tatlong iniksyon bawat linggo ay nagbibigay ng pagtaas sa paglago ng mga 8-18 cm bawat taon.

Ang mga batang may sakit na apat hanggang limang taong gulang, na may patuloy na paggamot, ay nahuli sa paglaki kasama ng kanilang mga kapantay hanggang sa pagdadalaga (14-16 taon). Kung isasaalang-alang natin ang katotohanan na ang 4-6 mg ng somatotropin ay maaaring makuha mula sa isang bangkay, pagkatapos ay mauunawaan natin na ang paggamot sa sakit na ito na may natural na somatotropin ay ganap na walang pag-asa. Bilang karagdagan sa kakulangan ng gamot, may iba pang mga problema na nauugnay sa heterogeneity ng hormone na nakahiwalay sa cadaveric material.

Nagkaroon din ng panganib na ang pituitary material ay nahawaan ng dahan-dahang pagbuo ng mga virus. Ang ganitong mga virus ay may hindi pangkaraniwang mahabang panahon ng pagpapapisa ng itlog, kaya ang mga bata na nakatanggap ng gamot ay nangangailangan ng maraming taon ng pangangasiwa ng medisina.

Ang hormone ng paglago ng tao, na synthesize sa mga espesyal na idinisenyong bacterial cell, ay may malinaw na mga pakinabang: ito ay magagamit sa maraming dami, ang mga paghahanda nito ay biochemically purong at libre mula sa viral contamination.

Ang biosynthesis ng somatotropin (binubuo ng 191 residue ng amino acid) ng mga espesyal na idinisenyong bakterya batay sa Escherichia coli ay isinagawa ng Genentech. Dahil sa panahon ng synthesis ng DNA para sa mRNA, ang isang gene ay nakuha na nag-encode ng isang somatotropin precursor na hindi nahati sa bacterial cells upang bumuo ng isang aktibong hormone, nagpatuloy kami sa mga sumusunod: sa unang yugto, isang double-stranded DNA na kopya ng mRNA ay na-clone at, sa pamamagitan ng digestion na may restriction endonucleases, nakuha ang isang sequence na nag-encode sa buong sequence ng amino acid ng hormone, maliban sa unang 23 amino acid. Pagkatapos ay nag-clone ng isang sintetikong polynucleotide na naaayon sa mga amino acid mula 1 hanggang 23. Susunod, ang dalawang mga fragment ay pinagsama at "nakatuon" sa isang E. coli plasmid, pagkatapos nito ang mga bacterial cell ay nagsimulang synthesize ang hormone na ito.

Pagsapit ng 1980, natapos ang mga klinikal na pagsubok ng gamot at toxicity test, at sinimulan ang mga mass experiment sa mga batang malapit sa edad hanggang sa pagdadalaga. Ang mga resulta ay nakapagpapatibay, at mula noong 1982 ang synthetic growth hormone ay nagsimulang gawin sa isang pang-industriyang sukat.

Ang isa pang hormone, β-endorphin, isang 31-amino acid brain opiate, ay na-synthesize sa genetically engineered E. coli cells. Noong 1980, matagumpay na na-clone ng Australian scientist na si Shine at ng American scientists na sina Fettes, Lan, at Baxter ang DNA encoding β-endorphin sa E. ooli cells at nakuha ang polypeptide na ito bilang fusion protein na may enzyme β-galactosidase. Sa unang yugto, na-clone nila ang isang fragment ng DNA na nakuha bilang resulta ng reverse transcription ng mRNA encoding β-endorphin, at pagkatapos ay ipinasok ito sa E .coli plasmid sa likod ng β-galactosidase gene, habang nakakakuha ng hybrid na protina na binubuo ng β- galactosidase at - endorphin; karagdagang, β-galactosidase ay enzymatically cleaved, pagkuha ng biologically aktibong β-endorphin.

Pagkuha ng mga interferon

Ang isa pang kahanga-hangang tagumpay ng genetic engineering ay ang synthesis ng interferon.

Ang Interferon ay unang nakuha noong 1957 sa National Institute for Medical Research malapit sa London. Ito ay isang protina na inilalabas sa napakababang halaga ng mga selula ng hayop at tao kapag ang mga virus ay pumasok sa katawan at naglalayong labanan ang mga ito. Ang mga unang pag-aaral ay nagsiwalat ng mataas na biological na aktibidad ng interferon sa paggamot ng trangkaso, hepatitis at kahit na kanser (pinipigilan ang pagpaparami ng mga abnormal na selula).

Ang interferon, tulad ng somatotropin, ay may pagtitiyak ng mga species: ang mga interferon ng hayop ay hindi aktibo sa katawan ng tao at kahit na tinatanggihan nito.

Ang katawan ng tao ay gumagawa ng ilang uri ng interferon: leukocyte (a), fibroblast (P) at immune (y) (T-lymphocytic).

Ang mga natural na interferon ay nakuha mula sa dugo ng tao na may napakababang ani: noong 1978, sa Central Health Laboratory sa Helsinki (sa oras na iyon ang pinuno ng mundo sa paggawa ng leukocyte interferon), 0.1 g ng purong interferon ay nakuha mula sa 50 libong litro ng dugo.

Ang proseso ng pagkuha ng mga interferon ay karaniwang pareho para sa lahat ng uri ng mga selula na lumaki sa mga kultura at bumubuo ng interferon. Ang mga selula ng dugo ay nahawahan ng Sendai virus at pagkatapos ng 24 na oras ay na-filter sa isang supercentrifuge. Ang supernatant ay naglalaman ng isang krudo na paghahanda ng interferon, na sumailalim sa chromatographic purification.

Ang halaga ng gamot ay napakataas - 400 g ng interferon ay nagkakahalaga ng 2.2 bilyong dolyar. Gayunpaman, ang pangako ng paggamit nito sa parmasyutiko (kabilang ang laban sa apat na uri ng kanser) ay naging dahilan upang maghanap ng mga bagong paraan upang makuha ito, pangunahin sa tulong ng genetic engineering.

Noong Enero 1980, ang interferon ng tao ay nakuha sa genetically engineered E. coli cells. Ang unang kahirapan sa mga pamamaraang ito ay ang interferon mRNA ay mahirap makuha kahit na sa mga leukocytes na pinasigla ng impeksyon sa virus, at ang mga ani ay napakababa: 1-2 interferon molecule bawat bacterial cell ang iniulat.

Noong 1981, nagawa ng kumpanyang Genentech na magdisenyo ng recombinant DNA encoding y-interferon at ipakilala ito sa genome ng bacteria, yeast, at kahit mammalian cells, at naging may kakayahang mag-synthesize ng interferon na may mataas na ani - 1 litro ng yeast cell culture na naglalaman 1 milyong yunit ng interferon (isang yunit ng interferon ay tumutugma sa ganoong halaga na nagpoprotekta sa 50% ng mga selula sa kultura mula sa impeksyon sa virus). Ang proseso ay isinagawa tulad ng sumusunod: ang mga mananaliksik ay nagbukod ng pinaghalong mRNA molecule mula sa human lymphocytes, nakakuha ng mga molekula ng kaukulang mga kopya ng DNA, at ipinakilala ang mga ito sa E. coli cells. Susunod, napili ang mga bakterya na gumagawa ng interferon.

Pagkuha ng mga immunogenic na paghahanda at bakuna

Ang isa pang lugar ng aplikasyon ng genetic engineering ay nauugnay sa paggawa ng mga bagong epektibo, ligtas at murang mga bakuna.

Ang mga bakuna ay isa sa mga pinakamahalagang tagumpay ng medisina, at ang paggamit ng mga ito ay napakabisa rin mula sa isang pang-ekonomiyang punto ng view. Sa mga nagdaang taon, ang pagbuo ng mga bakuna ay nakatanggap ng espesyal na pansin. Ito ay dahil sa ang katunayan na sa ngayon ay hindi pa posible na makakuha ng lubos na epektibong mga bakuna upang maiwasan ang maraming karaniwan o mapanganib na mga nakakahawang sakit.

Ang pagtaas ng interes sa mga bakuna ay lumitaw pagkatapos na maitatag ang papel ng mga pathogenic microorganism sa pag-unlad ng mga sakit na iyon na hindi dating itinuturing na nakakahawa. Halimbawa, gastritis, gastric at duodenal ulcers, malignant neoplasms ng atay (hepatitis B at C virus).

Samakatuwid, sa nakalipas na 10-15 taon, ang mga pamahalaan ng maraming mga bansa ay nagsimulang gumawa ng mga hakbang na naglalayong masinsinang pag-unlad at paggawa ng panimula ng mga bagong bakuna.

Ang mga bakunang ginagamit ngayon ay maaaring nahahati sa mga sumusunod na uri, depende sa mga paraan ng kanilang paghahanda:
- mga live attenuated na bakuna;
- mga inactivated na bakuna;
- mga bakuna na naglalaman ng mga purified na bahagi ng mga microorganism (protina o polysaccharides);
- mga recombinant na bakuna na naglalaman ng mga bahagi ng mga microorganism na nakuha ng genetic engineering

Ginagamit din ang teknolohiya ng recombinant DNA upang lumikha ng isang bagong uri ng mga live attenuated na bakuna, na nakakamit ng attenuation sa pamamagitan ng direktang mutation ng mga gene na nag-encode ng mga virulent na protina ng pathogen. Ginagamit din ang parehong teknolohiya upang makagawa ng mga live na recombinant na bakuna sa pamamagitan ng pagpasok ng mga gene na nag-encode ng mga immunogenic na protina sa mga live na non-pathogenic na virus o bacteria (vectors) na ini-inject sa mga tao.

Ang prinsipyo ng paggamit ng mga bakuna sa DNA ay ang isang molekula ng DNA na naglalaman ng mga gene na naka-encode ng mga immunogenic na protina ng isang pathogenic microorganism ay ipinapasok sa katawan ng pasyente. Ang mga bakuna sa DNA ay tinatawag na gene o genetic.

Upang makakuha ng mga bakuna sa DNA, isang gene na naka-encode sa paggawa ng isang immunogenic na protina ng isang microorganism ay ipinasok sa isang bacterial plasmid. Bilang karagdagan sa gene na nag-encode sa pagbabakuna ng protina, ang mga genetic na elemento ay ipinasok sa plasmid na kinakailangan para sa pagpapahayag ("pagbukas") ng gene na ito sa mga eukaryotic cell, kabilang ang mga tao, upang matiyak ang synthesis ng protina. Ang ganitong plasmid ay ipinakilala sa isang kultura ng mga bacterial cell upang makakuha ng isang malaking bilang ng mga kopya.

Pagkatapos ang plasmid DNA ay ihiwalay mula sa bakterya, pinadalisay mula sa iba pang mga molekula ng DNA at mga dumi. Ang purified DNA molecule ay nagsisilbing bakuna. Ang pagpapakilala ng isang bakuna sa DNA ay nagsisiguro sa synthesis ng mga dayuhang protina ng mga selula ng nabakunahang organismo, na humahantong sa kasunod na pag-unlad ng kaligtasan sa sakit laban sa kaukulang pathogen. Kasabay nito, ang mga plasmid na naglalaman ng kaukulang gene ay hindi sumasama sa DNA ng mga chromosome ng tao.

Ang mga bakuna sa DNA ay nag-aalok ng ilang mga pakinabang kaysa sa mga karaniwang bakuna:
- mag-ambag sa paggawa ng mga antibodies sa katutubong molekula ng mga viral protein;
- mag-ambag sa paggawa ng cytotoxic T-lymphocytes;
- maaaring piliing makaapekto sa iba't ibang subpopulasyon ng T-lymphocytes;
- mag-ambag sa pagbuo ng pangmatagalang kaligtasan sa sakit;
- alisin ang panganib ng impeksyon.

L.V. Timoshchenko, M.V. Chubik

Ang mga interferon ay mga molekula ng protina na may molekular na timbang na 15,000 hanggang 21,000 dalton na ginawa at itinago ng mga selula bilang tugon sa isang impeksyon sa viral o iba pang mga pathogen.

Interferon (IFN) - isang pangkat ng mga autogenous glycoproteins, ang biomekanismo ng pagkilos na nauugnay sa isang sabay-sabay na antiviral effect - pag-activate ng mga cellular genes, na nagreresulta sa synthesis ng mga protina na pumipigil sa synthesis ng viral DNA (RNA) at may immunomodulatory epekto - ang kakayahang pahusayin ang pagpapahayag ng mga antigens sa mga lamad ng cell at pataasin ang aktibidad ng mga cytotoxic T cells at natural killer cells.

Ang mga IFN ay inuri sa dalawang uri. Ang unang uri, na gumaganap bilang mga inhibitor ng viral replication at may pangunahing antiviral effect, ay may kasamang 22 iba't ibang subtype ng IFN-α at isang subtype ng IFN-β. Ang pangalawang uri, na nagpapakita ng aktibidad ng immunomodulatory, ay kinabibilangan ng IFN-γ.

Mayroong tatlong immunologically natatanging klase ng IFN: IFN-α, IFN-β, IFN-γ.

Ang natural na nagaganap na IFN ay kinabibilangan ng lymphoblastoid at leukocyte IFN (IFN-α), ayon sa pagkakabanggit, na synthesize ng mga stimulated na monocyte ng tao at B-lymphocytes, na pagkatapos ay kinukuha at dinadalisay; fibroblastic IFN (IFN-β) na nagmula sa kultura ng fibroblast ng tao; at T-lymphocytic IFN (IFN-γ).

Kasama sa artificially synthesized na IFN ang recombinant na IFN-α, na isang napaka-purified na solong subtype ng IFN-α na nakuha ng recombinant molecular technology.

Mga kilalang pamamaraan para sa paggawa ng interferon ng leukocyte ng tao mula sa mga leukocyte ng tao na dulot ng mga virus at iba pang inducers.

Ang pangunahing kawalan ng mga pamamaraang ito para sa paggawa ng mga interferon ay ang posibilidad ng kontaminasyon ng panghuling produkto sa mga virus ng tao, tulad ng hepatitis B at C virus, immunodeficiency virus, atbp.

Sa kasalukuyan, ang paraan ng pagkuha ng interferon sa pamamagitan ng microbiological synthesis ay kinikilala bilang mas promising, na ginagawang posible na makuha ang target na produkto na may mas mataas na ani mula sa isang medyo murang hilaw na materyal. Ang mga diskarte na ginamit sa kasong ito ay ginagawang posible na lumikha ng mga variant ng structural gene na pinakamainam para sa pagpapahayag ng bacterial, pati na rin ang mga elemento ng regulasyon na kumokontrol sa pagpapahayag nito.

Ang iba't ibang disenyo ng Pichia pastoris, Pseudomonas putida at Escherichia coli strains ay ginagamit bilang mga paunang mikroorganismo.

Ang kawalan ng paggamit ng P. pastoris bilang isang tagagawa ng interferon ay ang napakahirap na kondisyon ng pagbuburo para sa ganitong uri ng lebadura, ang pangangailangan na mahigpit na mapanatili ang konsentrasyon ng inducer, sa partikular na methanol, sa panahon ng biosynthesis.

Ang kawalan ng paggamit ng mga strain ng Ps. putida ay ang pagiging kumplikado ng proseso ng pagbuburo sa mababang antas ng pagpapahayag (10 mg ng interferon bawat 1 litro ng medium ng kultura). Mas produktibo ang paggamit ng mga strain ng Escherichia coli.

Ang isang malaking bilang ng mga plasmids at interferon-expressing E. coli strains ay kilala: E. coli strains ATCC 31633 at 31644 na may plasmids Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 o Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35 - AHL6 (SU 1764515), E. coli strain pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli strain pINF-F-Pa (AU 1312962), E. coli strain SG 20050 na may p280/21FN plasmid (Kravchenko V.V. et al. chemistry, 1987, vol. 13, No. 9, p. 1186-1193), E. coli SG 20050 strain na may pINF14 plasmid (SU 1703691), E. coli SG 20050 strain na may pINF16 plasmid (RU 2054041) at iba pa. Ang kawalan ng mga teknolohiya batay sa paggamit ng mga strain na ito ay ang kanilang kawalang-tatag, pati na rin ang isang hindi sapat na antas ng interferon expression.

Kasama ang mga katangian ng mga strain na ginamit, ang kahusayan ng proseso ay higit na nakasalalay sa teknolohiyang ginamit para sa paghihiwalay at paglilinis ng interferon.

Isang kilalang paraan para sa paggawa ng interferon, na kinabibilangan ng paglilinang ng mga cell Ps. putida, biomass destruction, polyethyleneimine treatment, ammonium sulphate fractionation, hydrophobic chromatography sa phenylsilochrome C-80, pH fractionation ng lysate, konsentrasyon at diafiltration nito, ion-exchange chromatography sa DE-52 cellulose, pH gradient elution, chromatography ng chromatography nagreresultang eluent sa CM cellulose -52, konsentrasyon sa pamamagitan ng pagpasa sa isang filter cassette at gel filtration sa Sephadex G-100 (SU 1640996). Ang kawalan ng pamamaraang ito, bilang karagdagan sa kumplikadong multi-stage fermentation, ay ang multi-stage na proseso sa pagkuha ng huling produkto.

Mayroon ding kilala na paraan para sa paggawa ng interferon, na kinabibilangan ng paglilinang ng E. coli SG 20050/pIF16 strain sa LB broth sa mga flasks sa isang thermostated shaker, centrifuging ang biomass, paghuhugas nito ng buffer solution at sonicating para sirain ang mga cell. Ang resultang lysate ay centrifuged, hugasan ng 3 M urea sa buffer, dissolved sa guanidine chloride sa buffer, sonicated, centrifuged, oxidative sulfitolysis, dialysis laban sa 8 M urea, renaturation, at final two-stage chromatography sa CM-52 cellulose at Sephadex G -50 ( RU 2054041).

Ang mga disadvantages ng pamamaraang ito ay ang relatibong mababang produktibidad ng mga pangunahing yugto ng proseso ng paghihiwalay at paglilinis. Sa partikular, nalalapat ito sa pagproseso ng ultrasonic ng produkto, dialysis at oxidative sulfitolysis, na humahantong sa kawalang-tatag sa ani ng interferon, pati na rin ang imposibilidad ng paggamit ng pamamaraang ito para sa pang-industriyang produksyon ng interferon.

Bilang ang pinakamalapit na analogue (prototype), ang isang paraan para sa paggawa ng human leukocyte interferon ay maaaring ipahiwatig, na binubuo sa paglilinang ng isang recombinant strain ng E. coli, pagyeyelo ng nagresultang biomass sa isang temperatura na hindi hihigit sa -70 ° C, pagtunaw, pagsira sa mga selula ng microorganism. na may lysozyme, nag-aalis ng DNA at RNA sa pamamagitan ng pagpapasok sa DNase lysate at pagdalisay ng nakahiwalay na hindi matutunaw na anyo ng interferon sa pamamagitan ng paghuhugas gamit ang buffer solution na may mga detergent, pagtunaw ng precipitate ng interferon sa solusyon ng guanidine hydrochloride, renaturation at one-stage purification sa pamamagitan ng chromatography ng pagpapalitan ng ion. Bilang isang producer, ang E. coli SS5 strain na nakuha gamit ang recombinant pSS5 plasmid na naglalaman ng tatlong promoter: Plac, Pt7 at Ptrp, at ang alpha-interferon gene na may ipinakilala na mga pagpapalit ng nucleotide ay ginagamit.

Ang pagpapahayag ng interferon ng E. coli SS5 strain na naglalaman ng plasmid na ito ay kinokontrol ng tatlong promoter: Plac, Pt7 at Ptrp. Ang antas ng pagpapahayag ng interferon ay humigit-kumulang 800 mg bawat 1 litro ng suspensyon ng cell.

Ang kawalan ng pamamaraang ito ay ang mababang manufacturability ng paggamit ng enzymatic na pagkasira ng mga cell, DNA at RNA ng microorganism at isang yugto ng chromatographic purification ng interferon. Nagiging sanhi ito ng kawalang-tatag ng proseso ng paghihiwalay ng interferon, humahantong sa pagbaba sa kalidad nito at nililimitahan ang posibilidad na gamitin ang pamamaraan sa itaas para sa pang-industriyang produksyon ng interferon.

Ang mga disadvantages ng plasmid na ito at ang strain batay dito ay ang paggamit sa plasmid ng isang malakas na unregulated T7 phage promoter sa E. coli BL21 (DE3) strain, kung saan ang T7 RNA polymerase gene ay nasa ilalim ng lac operon promoter at kung saan laging "daloy". Dahil dito, ang synthesis ng interferon ay patuloy na nangyayari sa cell, na humahantong sa dissociation ng plasmid at isang pagbawas sa viability ng mga cell ng strain, at bilang isang resulta, isang pagbawas sa ani ng interferon.

Upang makakuha ng malaking halaga ng IFN, ginagamit ang anim na araw na single-layer na kultura ng mga cell ng chick embryo o mga kulturang leukocyte ng dugo ng tao na nahawaan ng isang partikular na uri ng virus. Sa madaling salita, upang makakuha ng IFN, isang partikular na virus-cell system ang nilikha.

Ang gene na responsable para sa biosynthesis ng IFN ay nahiwalay sa isang selula ng tao. Ang exogenous human IFN ay nakuha gamit ang recombinant DNA technology. Ang pamamaraan para sa paghihiwalay ng cDNA ng mga IFN ay ang mga sumusunod:

1) Ang mRNA ay nakahiwalay mula sa mga leukocytes ng tao, ito ay fractionated sa laki, ang reverse transcription ay isinasagawa, at ito ay ipinasok sa site ng binagong plasmid.

2) Ang resultang produkto ay binago sa E. coli; ang mga resultang clone ay nahahati sa mga grupo na natukoy.

3) Ang bawat pangkat ng mga clone ay na-hybrid sa IFN - mRNA.

4) Mula sa mga nagresultang hybrid na naglalaman ng cDNA at xRNA, ang mRNA ay nakahiwalay, ito ay isinalin sa sistema ng synthesis ng protina.

5) Tukuyin ang interferon antiviral na aktibidad ng bawat halo na nagreresulta mula sa pagsasalin. Ang mga pangkat na nagpakita ng aktibidad ng interferon ay naglalaman ng cDNA clone na na-hybrid sa IFN - mRNA; muling tukuyin ang isang clone na naglalaman ng buong IFN - human cDNA.

2. Mga mekanismo ng pagkilos ng mga interferon

Ang mga IFN ay nagpapakita ng ilang uri ng aktibidad bilang mga lymphokines at immunomodulators. Ang Type I IFNs, na pangunahing kumikilos bilang mga inhibitor ng viral replication sa cell, ay napagtanto ang kanilang epekto sa pamamagitan ng pagpapasigla sa paggawa ng mga cellular enzymes ng ribosomes ng mga host cell, na pumipigil sa paggawa ng mga virus, nakakagambala sa pagsasalin ng viral mRNA at ang synthesis ng mga viral protein.

Ang IFN ay ginawa ng karamihan sa mga species ng hayop, ngunit ang pagpapakita ng kanilang aktibidad ay partikular sa species, i.e. kumikilos lamang sila sa mga species ng hayop kung saan sila ginawa.

Ang IFN ay nagiging sanhi ng induction ng tatlong enzymes:

protina kinase, na nakakagambala sa paunang yugto ng pagbuo ng isang peptide chain;

oligoisoadenylate synthetase, na nagpapagana ng RNase, na sumisira sa viral RNA;

phosphodiesterase, na sumisira sa mga terminal nucleotides ng tRNA, na humahantong sa isang paglabag sa peptide elongation.

Isinasaalang-alang ang mga antiviral at immunomodulating effect ng IFN, ang NPO Biomed ay iminungkahi at matagumpay na sinubukan ang mga suppositories na may IFNn1 at probiotics sa paggamot ng dysbacteriosis ng viral at bacterial etiology, candidiasis; sa gynecological practice para sa paggamot ng endometritis, colpitis, vaginitis at gynecological herpes.

3. Therapeutic application ng human INF

Mayroong dalawang henerasyon ng mga paghahanda ng interferon. Ang unang henerasyon ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang natural na pinagmulan, kung saan ito ay nakuha mula sa dugo ng mga donor. Ang dry human leukocyte interferon ay nakuha mula dito, na ginagamit para sa paglanghap at instillation sa mga daanan ng ilong. Gumagawa din sila ng interferon sa mga suppositories, purified concentrated dry interferon at Leukinferon.

Ang pamamaraang ito ng pagkuha ng mga paghahanda batay sa interferon ay medyo mahal at hindi naa-access, samakatuwid, sa pagtatapos ng ika-20 siglo, ang mga paghahanda ng pangalawang henerasyon na interferon ay nilikha gamit ang genetic engineering.

Kaya, posible na bumuo ng mga gamot na Viferon, Interal at iba pa na naglalaman ng recombinant human interferon alfa-

Dahil sa kanilang mga natatanging katangian, ang mga paghahanda ng interferon ay ginagamit sa paggamot at pag-iwas sa lahat ng mga sakit sa paghinga, karamihan sa mga kanser, at para sa paggamot ng maraming mga sakit na viral at trangkaso. Ang mga paghahanda ng interferon ay malawakang ginagamit sa paggamot ng hepatitis B at C: nililimitahan ng interferon ang pag-unlad ng virus, pinipigilan ang paglitaw ng cirrhosis at inaalis ang kamatayan.

Ang ilang paghahanda ng interferon ay may mga side effect, tulad ng mga pantal sa balat, allergy, at mga sakit ng hematopoietic system.

Sa matagal na paggamit ng interferon, ang mga antibodies sa interferon ay ginawa sa katawan, na ginagawang hindi nito kayang labanan ang mga virus. Ang dahilan para sa mga phenomena na ito ay nakasalalay sa pagkakaroon ng albumin sa mga paghahanda batay sa interferon.

Ang albumin ay nakukuha mula sa dugo, kaya may panganib (kahit minimal) ng impeksyon sa hepatitis at iba pang mga sakit na nakukuha sa pamamagitan ng dugo.

Pangalan ng gamot	Subtype INF	Paano makakuha	epekto ng pharmacological	Mga pahiwatig para sa paggamit
Interferon		Biosynthesis sa kultura ng donor blood leukocytes sa ilalim ng impluwensya ng mga virus	Antiviral, immunomodulatory, antiproliferative	Mga sakit sa viral, leukemia, malignant melanoma, kanser sa bato, carcinoid syndrome
Interlock		Biosynthesis sa kultura ng donor blood leukocytes sa ilalim ng impluwensya ng paramycoviruses	Pinipigilan ang aktibidad ng isang bilang ng mga virus	Mga sakit sa mata ng viral, hepatitis		Recombinant	Ang antiviral, immunomodulatory, ay pumipigil sa paglaganap ng isang malawak na hanay ng mga selula ng tumor	Epithelial form ng talamak at paulit-ulit na impeksyon sa mata ng viral; mga sakit sa oncological
Interferon alfa-2a		Recombinant. Protein na naglalaman ng 165 amino acids	Antiviral, aktibidad ng antitumor	Leukemic reticuloendotheliosis, Kaposi's sarcoma, kanser sa bato, kanser sa pantog, melanoma, herpes zoster
Reaferon		Recombinant IFN na ginawa ng bacterial strain ng Pseudomonas, sa genetic apparatus kung saan ipinasok ang human leukocyte IFNα2 gene. Kapareho ng leukocyte ng tao IFN α2.		Viral, mga sakit sa tumor
Interferon alpha - n1		Highly purified human INF	Antiviral	Talamak na aktibong nakakahawang hepatitis B
Inreferon beta		Superproduction ng mga fibroblast ng tao sa pamamagitan ng isang stimulator sa pagkakaroon ng mga inhibitor ng metabolic na proseso	Antiviral, immunomodulatory, aktibidad na antitumor	Mga talamak na impeksyon sa viral sa ophthalmology, gynecology at urology, dermatology, hepatology, oncology
Interferon gamma		Recombinant	Antiviral, immunomodulatory, aktibidad na antitumor	Mga malalang sakit na granulomatous

1. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml

2. www.interferon.su/php/content.php?id=71

3. www.pharmvestnik.ru

4. Pansamantalang pharmacopoeial na artikulo 42U-23/60-439-97. Interferon human recombinant alpha-two.

5. Gavrikov A.V. Pag-optimize ng biotechnological na produksyon ng mga sangkap ng recombinant human interferon - M., 2003,

6. Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology / B. Glick, J. Pasternak. - M., Mir, 2002.

7. State Pharmacopoeia ng USSR. XI ed., isyu 1.- P. 175.

8. Rehistro ng Estado ng mga Gamot / Ed. A.V. Katlinsky at iba pa - M., 2002.

9. Naroditsky B.S. Molecular biotechnology ng interferon. // koleksyon ng pang-agham at praktikal na kumperensya "Interferon - 50 taon". - M., 2007, pp. 17-23

10. Mga Batayan ng pharmaceutical biotechnology: Textbook / T.P. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhalev. - Rostov-on-Don.: Phoenix; Tomsk: NTL Publishing House, 2006.

11. Frolov A.F., Vovk A.D., Dyadyun S.T. Kahusayan ng recombinant alpha-two-interferon sa viral hepatitis B//Medikal na negosyo.- Kyiv, 1990.- No. 9.- P. 105–108.

Mga interferon- glycoproteins na ginawa ng mga cell bilang tugon sa impeksyon sa viral at iba pang stimuli. Hinaharang nila ang pagpaparami ng virus sa ibang mga selula at nakikilahok sa pakikipag-ugnayan ng mga selula ng immune system. Mayroong dalawang serological na grupo ng mga interferon: uri I - IFN-α at IFN-β; Type II - IFN-.γ Type I interferon ay may antiviral at antitumor effect, habang ang type II interferon ay kinokontrol ang isang partikular na immune response at nonspecific na resistensya.

Ang α-interferon (leukocyte) ay ginawa ng mga leukocyte na ginagamot sa mga virus at iba pang mga ahente. Ang β-interferon (fibroblast) ay ginawa ng mga fibroblast na ginagamot sa virus.

Ang Type I IFN ay nagbubuklod sa malusog na mga selula at pinoprotektahan ang mga ito mula sa mga virus. Ang antiviral effect ng type I IFN ay maaaring dahil din sa katotohanang nagagawa nitong pigilan ang paglaganap ng cell sa pamamagitan ng panghihimasok sa synthesis ng mga amino acid.

Ang IFN-γ ay ginawa ng T-lymphocytes at NK. Pinasisigla ang aktibidad ng T- at B-lymphocytes, monocytes / macrophage at neutrophils. Nagdudulot ito ng apoptosis ng mga activated macrophage, keratinocytes, hepatocytes, bone marrow cells, endotheliocytes at pinipigilan ang apoptosis ng peripheral monocytes at herpes-infected neurons.

Ang genetically engineered leukocyte interferon ay ginawa sa prokaryotic system (E. coli). Biotechnology para sa paggawa ng leukocyte interferon kasama ang mga sumusunod na hakbang: 1) paggamot ng leukocyte mass na may interferon inducers; 2) paghihiwalay ng pinaghalong mRNA mula sa ginagamot na mga cell; 3) pagkuha ng kabuuang komplementaryong DNA gamit ang reverse transcriptase; 4) pagpasok ng cDNA sa Escherichia coli plasmid at pag-clone nito; 5) pagpili ng mga clone na naglalaman ng mga interferon genes; 6) pagsasama sa plasmid ng isang malakas na tagataguyod para sa matagumpay na transkripsyon ng gene; 7) pagpapahayag ng interferon gene, i.e. synthesis ng kaukulang protina; 8) pagkasira ng mga prokaryotic cells at paglilinis ng interferon gamit ang affinity chromatography.

Mga interferon mag-apply para sa pag-iwas at paggamot ng isang bilang ng mga impeksyon sa viral. Ang kanilang epekto ay tinutukoy ng dosis ng gamot, ngunit ang mataas na dosis ng interferon ay may nakakalason na epekto. Ang mga interferon ay malawakang ginagamit para sa trangkaso at iba pang mga talamak na sakit sa paghinga. Ang gamot ay epektibo sa mga unang yugto ng sakit, na inilapat nang topically. Ang mga interferon ay may therapeutic effect sa hepatitis B, herpes, at gayundin sa malignant neoplasms.

Interferon ay isa sa mga mahalagang proteksiyon na protina ng immune system. Natuklasan ito kapag pinag-aaralan ang interference ng mga virus, ibig sabihin, ang phenomenon kapag ang mga hayop o cell culture na nahawaan ng isang virus ay naging insensitive sa impeksyon ng isa pang virus. Ito ay lumabas na ang pagkagambala ay dahil sa nagresultang protina, na may proteksiyon na antiviral property. Ang protina na ito ay pinangalanang interferon.

Ang Interferon ay isang pamilya ng mga glycoprotein na protina na na-synthesize ng mga selula ng immune system at connective tissue. Depende sa kung aling mga cell ang nag-synthesize ng interferon, mayroong tatlong uri: α, β at γ-interferon.

Alpha interferon ginawa ng mga leukocytes at ito ay tinatawag na leukocyte; beta interferon tinatawag na fibroblastic, dahil ito ay synthesize ng fibroblasts - connective tissue cells, at gamma interferon- immune, dahil ito ay ginawa ng activated T-lymphocytes, macrophage, natural killers, i.e., immune cells.

Ang interferon ay patuloy na na-synthesize sa katawan, at ang konsentrasyon nito sa dugo ay pinananatili sa halos 2 IU / ml (1 internasyonal na yunit - ME ay ang halaga ng interferon na nagpoprotekta sa kultura ng cell mula sa 1 CPD 50 ng virus). Ang produksyon ng interferon ay tumataas nang husto kapag nahawaan ng mga virus, gayundin kapag nalantad sa mga interferon inducers, tulad ng RNA, DNA, mga kumplikadong polimer. Ang ganitong mga interferon inducers ay tinatawag interferonogens.

Bilang karagdagan sa antiviral effect, ang interferon ay may proteksyon laban sa antitumor, dahil inaantala nito ang paglaganap (pagpaparami) ng mga selula ng tumor, pati na rin ang aktibidad ng immunomodulatory, pagpapasigla ng phagocytosis, natural na mga pumatay, pag-regulate ng produksyon ng antibody ng mga selulang B, pag-activate ng pagpapahayag ng pangunahing histocompatibility. kumplikado.

Mekanismo ng pagkilos Ang interferon ay kumplikado. Ang interferon ay hindi direktang kumikilos sa virus sa labas ng cell, ngunit nagbubuklod sa mga espesyal na receptor ng cell at nakakaapekto sa proseso ng pagpaparami ng virus sa loob ng cell sa yugto ng synthesis ng protina.

Ang paggamit ng interferon. Ang pagkilos ng interferon ay mas epektibo, mas maaga itong nagsisimulang ma-synthesize o pumasok sa katawan mula sa labas. Samakatuwid, ginagamit ito para sa mga layuning pang-iwas sa maraming mga impeksyon sa viral, tulad ng trangkaso, pati na rin para sa mga layuning panterapeutika sa mga talamak na impeksyon sa viral, tulad ng parenteral hepatitis (B, C, D), herpes, multiple sclerosis, atbp. Nagbibigay ng positibo ang Interferon nagreresulta sa paggamot ng mga malignant na tumor at mga sakit na nauugnay sa immunodeficiencies.

Ang mga interferon ay partikular sa mga species, ibig sabihin, ang interferon ng tao ay hindi gaanong epektibo para sa mga hayop at vice versa. Gayunpaman, ang pagtitiyak ng species na ito ay kamag-anak.

Pagkuha ng interferon. Ang interferon ay nakuha sa dalawang paraan: a) sa pamamagitan ng pag-infect ng mga leukocytes o lymphocytes ng tao na may ligtas na virus, bilang isang resulta kung saan ang mga nahawaang selula ay nag-synthesize ng interferon, na pagkatapos ay nakahiwalay at ang mga paghahanda ng interferon ay itinayo mula dito; b) sa pamamagitan ng genetic engineering - sa pamamagitan ng paglaki sa ilalim ng mga kondisyong pang-industriya recombinant bacterial strains na may kakayahang gumawa ng interferon. Karaniwan, ginagamit ang mga recombinant strain ng Pseudomonas, Escherichia coli na may mga interferon gene na naka-embed sa kanilang DNA. Ang interferon na nakuha sa pamamagitan ng genetic engineering ay tinatawag na recombinant. Sa ating bansa, ang recombinant interferon ay nakatanggap ng opisyal na pangalan na "Reaferon". Ang produksyon ng gamot na ito ay mas mahusay at mas mura kaysa sa leukocyte na gamot.

Ang recombinant interferon ay natagpuan ng malawak na aplikasyon sa medisina bilang isang prophylactic at therapeutic agent para sa mga impeksyon sa viral, neoplasms, at immunodeficiencies.

Ang mga fungi ng amag ay gumagawa ng mga antibiotic. Mga tampok ng istraktura ng cell at cycle ng pag-unlad sa panahon ng pagbuburo. Mga antibiotic na ginawa ng fungi.

Biotechnology (Bykov 2009) pp.28-40.

Mould mushroom, o magkaroon ng amag- iba't ibang fungi (pangunahin ang zygo- at ascomycetes) na bumubuo ng sumasanga na mycelia na walang malaki, madaling nakikita ng mata, namumunga na mga katawan.

Mga pamilya at uri ng fungi

• Penicillium spp.
• Aspergillus
• Moniliaceae
• Dematiaceae
• Fusarium
• Acremonium
• Scytalidium dimidiatum (Nattrassia magniferae)
• Onychocola canadensis

Pamamahagi sa kalikasan

Ang mga fungi ng amag ay nasa lahat ng dako. Karaniwan, ang malawak na mga kolonya ay lumalaki sa mainit, mahalumigmig na mga lugar, sa nutrient media.

Pilitin(galing sa kanya. Stammen, literal - mangyari) - isang purong kultura ng mga virus, bakterya, iba pang microorganism o kultura ng cell, na nakahiwalay sa isang tiyak na oras at sa isang tiyak na lugar. Dahil maraming mga mikroorganismo ang nagpaparami sa pamamagitan ng mitosis (dibisyon), nang walang pakikilahok ng sekswal na proseso, sa esensya, ang mga species ng naturang mga microorganism ay binubuo ng mga clonal na linya na genetically at morphologically na magkapareho sa orihinal na cell. Ang strain ay hindi isang taxonomic na kategorya, ang pinakamababang taxon sa lahat ng organismo ay isang species, ang parehong strain ay hindi maaaring ihiwalay sa pangalawang pagkakataon mula sa parehong pinagmulan sa ibang pagkakataon.

Ang pagtatalaga ng isang microorganism sa isang partikular na species ay nangyayari sa batayan ng medyo malawak na mga tampok, tulad ng uri ng nucleic acid at ang istraktura ng capsid sa mga virus; ang kakayahang lumaki sa ilang partikular na hydrocarbon at ang uri ng mga produktong metabolic na ginawa, pati na rin ang mga nakatipid na genome sequence sa bakterya. Sa loob ng mga species, may mga pagkakaiba-iba sa laki at hugis ng mga plake (negatibong "mga kolonya" ng virus) o mga kolonya ng microorganism, ang antas ng paggawa ng enzyme, ang pagkakaroon ng mga plasmid, virulence, atbp.

Walang pangkalahatang kinikilalang katawagan para sa mga pangalan ng mga strain sa mundo, at ang mga pangalan na ginamit ay sa halip arbitrary. Bilang isang patakaran, binubuo sila ng mga indibidwal na titik at numero, na nakasulat pagkatapos ng pangalan ng species. Halimbawa, isa sa mga pinakatanyag na strain ng Escherichia coli - E. coli K-12.

Ang mga fungi ng amag ay malawakang ginagamit ng mga tao.

• mga strain ng fungus Aspergillus niger ginagamit para sa paggawa ng sitriko acid mula sa mga matamis na sangkap
• Mga strain Botrytis cinerea("Noble rot") ay kasangkot sa pagkahinog ng ilang mga alak (sherry).
• Ang iba pang mga uri ng amag (ang tinatawag na "noble mold") ay ginagamit para sa paggawa ng mga espesyal na uri ng keso (Roquefort, Camembert).
• Kadalasan, naaapektuhan ng amag ang mga namumungang katawan ng mga nakakain na kabute at ginagawa itong hindi angkop para sa pag-aani. Ngunit kung minsan ang gayong mga kabute ay nagiging mga espesyal na bagay ng pangangaso ng kabute, tingnan ang artikulo tungkol sa "mga lobster mushroom" Hypomyces lactifluorum.

Pinsala mula sa fungi

Panganib ng tao

Mycotoxins at antibiotics

Maraming mold fungi ang gumagawa ng pangalawang metabolites - mga antibiotic at mycotoxin, na may nakakapanlulumo o nakakalason na epekto sa ibang mga buhay na organismo. Ang mga sumusunod na sangkap ay pinakamahusay na kilala

• Mycotoxins:
• Aflatoksin
• Antibiotics:
• Penicillin
• Cephalosporins
• Cyclosporine

Maraming antibiotic ang pinipilit na gamitin sa mga konsentrasyon na malapit sa nakakalason. Kaya, ang mga antibiotic na gentamicin, streptomycin, dihydrostreptomycin, kanamycin at iba pa ay maaaring magkaroon ng nephro- at ototoxic effect.

mga pathogen

Ang ilang mga fungi ng amag ay maaaring maging sanhi ng mga sakit sa mga hayop at tao - aspergillosis, onychomycosis at iba pa.

Mga amag at agrikultura

Ang ilang mga fungi ng amag, na makabuluhang binabawasan ang ani, ay maaaring magkaroon ng masamang epekto sa kalusugan ng mga hayop sa bukid.

Ang mga mushroom ay nakakahawa sa mga stock ng butil, kumpay, dayami at dayami. Minsan ang mga produkto ay nagiging hindi magagamit dahil sa toxicity ng fungus metabolites.

Sa isang malakas na pag-unlad ng fungi ng amag sa dayami, posible ang pagpainit sa sarili at kahit na pag-aapoy ng mga haystack.

Mga mekanismo ng paglaban

• Maaaring kulang ang mikroorganismo sa istruktura kung saan kumikilos ang antibiotic (halimbawa, bacteria ng genus Mycoplasma (lat. Mycoplasma) ay insensitive sa penicillin, dahil wala silang cell wall);
• Ang microorganism ay hindi tinatablan ng antibiotic (karamihan sa gram-negative bacteria ay immune sa penicillin G dahil ang cell wall ay protektado ng karagdagang lamad);
• Nagagawa ng microorganism na i-convert ang antibiotic sa isang hindi aktibong anyo (maraming staphylococci (lat. Staphylococcus) naglalaman ng enzyme β-lactamase, na sumisira sa β-lactam ring ng karamihan sa mga penicillin)
• Dahil sa mutation ng gene, ang metabolismo ng microorganism ay maaaring mabago sa paraang ang mga reaksyon na hinarangan ng antibiotic ay hindi na kritikal para sa buhay ng organismo;
• Nagagawa ng microorganism na i-pump ang antibiotic palabas ng cell [ hindi tinukoy ang pinagmulan 85 araw] .

Aplikasyon

antibiotics(mula sa ibang Greek ἀντί - anti - laban, βίος - bios - buhay) - mga sangkap ng natural o semi-synthetic na pinagmulan na pumipigil sa paglaki ng mga buhay na selula, kadalasang prokaryotic o protozoan.

Ayon sa GOST 21507-81 (ST SEV 1740-79)

Antibiotic - isang sangkap ng microbial, pinagmulan ng hayop o halaman, na may kakayahang pigilan ang paglaki ng mga microorganism o maging sanhi ng kanilang pagkamatay.

Ang mga antibiotic na natural na pinagmulan ay kadalasang ginagawa ng actinomycetes, mas madalas ng nonmycelial bacteria.

Ang ilang mga antibiotics ay may malakas na epekto sa pagbabawal sa paglaki at pagpaparami ng bakterya at sa parehong oras ay medyo maliit o walang pinsala sa mga selula ng macroorganism, at samakatuwid ay ginagamit bilang mga gamot.

Ang ilang mga antibiotic ay ginagamit bilang mga cytotoxic (antineoplastic) na gamot sa paggamot ng kanser.

Ang mga antibiotic ay hindi nakakaapekto sa mga virus at samakatuwid ay walang silbi sa paggamot ng mga sakit na dulot ng mga virus (halimbawa, trangkaso, hepatitis A, B, C, bulutong-tubig, buni, rubella, tigdas).

Terminolohiya

Ang mga ganap na synthetic na gamot na walang natural na analogues at may suppressive effect na katulad ng antibiotics sa paglaki ng bacteria ay tradisyonal na tinatawag na hindi antibiotics, ngunit antibacterial chemotherapy na gamot. Sa partikular, kapag ang mga sulfonamides lamang ang kilala sa mga antibacterial chemotherapy na gamot, kaugalian na sabihin ang buong klase ng mga antibacterial na gamot bilang "antibiotics at sulfonamides". Gayunpaman, sa mga nakalipas na dekada, na may kaugnayan sa pag-imbento ng maraming napakalakas na antibacterial chemotherapy na gamot, sa partikular na mga fluoroquinolones, na lumalapit o lumampas sa "tradisyonal" na antibiotic sa aktibidad, ang konsepto ng "antibiotic" ay nagsimulang lumabo at lumawak at ngayon ay madalas na ginagamit hindi. lamang na may kaugnayan sa natural at semi-synthetic compound, ngunit din sa maraming malakas na antibacterial chemotherapy na gamot.

Synthesis ng iba't ibang klase ng interferon ng tao sa genetically engineered microorganism cells. Pagpapahayag ng mga gene na ipinasok sa plasmid.

Ang mga cytokine ay isang pangkat ng mga polypeptide mediator ng mga intercellular na pakikipag-ugnayan, na pangunahing kasangkot sa pagbuo at regulasyon ng mga tugon ng depensa ng katawan sa pagpapakilala ng mga pathogens at pagkagambala sa integridad ng tissue, pati na rin sa regulasyon ng isang bilang ng mga normal na physiological function. Ang mga cytokine ay maaaring ihiwalay sa isang bagong independiyenteng sistema ng regulasyon na umiiral kasama ng mga nervous at endocrine system para sa pagpapanatili ng homeostasis, at lahat ng tatlong mga sistema ay malapit na magkakaugnay at magkakaugnay.

Ang kasaysayan ng pag-aaral ng mga cytokine ay nagsimula noong 1940s. Noon ay inilarawan ang mga unang epekto ng cachectin - isang salik na naroroon sa serum ng dugo at may kakayahang magdulot ng cachexia o pagbaba ng timbang. Kasunod nito, ang tagapamagitan na ito ay nahiwalay at ipinakita na magkapareho sa tumor necrosis factor (TNF). Sa nakalipas na dalawang dekada, ang mga gene ng karamihan sa mga cytokine ay na-clone at ang mga recombinant na analogue ay nakuha na ganap na inuulit ang mga biological na katangian ng mga natural na molekula. Ngayon higit sa 200 indibidwal na mga sangkap na kabilang sa pamilya ng mga cytokine ay kilala.

Kasama sa mga cytokine ang interferon, colony-stimulating factors (CSF), chemokines, transforming growth factors; tumor necrosis factor; interleukin na may itinatag na makasaysayang mga serial number at ilang iba pang endogenous mediator. Ang mga interleukin na may mga serial number na nagsisimula sa 1 ay hindi kabilang sa isang subgroup ng mga cytokine na nauugnay sa isang karaniwang function. Ang mga ito, sa turn, ay maaaring nahahati sa mga pro-inflammatory cytokine, growth at differentiation factor ng lymphocytes, at mga indibidwal na regulatory cytokine.

Ang pag-uuri ng mga cytokine ay maaaring isagawa ayon sa kanilang biochemical at biological na mga katangian, pati na rin ayon sa mga uri ng mga receptor kung saan isinasagawa ng mga cytokine ang kanilang mga biological function. Sa ibaba ay isang pinagsamang structural at functional classification, kung saan ang lahat ng cytokine ay nahahati sa mga grupo, lalo na isinasaalang-alang ang kanilang biological na aktibidad, pati na rin ang mga tampok na istruktura sa itaas ng mga cytokine molecule at ang kanilang mga receptor [Simbirtsev A.S., 2004].

Pag-uuri ng mga cytokine

1. Uri I interferon (IFN a, b, d, k, w, t, IL-28, IL-29 (IFN l));

2. Colony stimulating factors, hematopoietins:

– Stem cell factor;

– gp140 ligand (IL-3, IL-5, GM-CSF);

- Erythropoietin, thrombopoietin.

3. Tumor necrosis factor family (TNF, lymphotoxins α at β);

4. Superfamily ng interleukin-1 at fibroblast growth factor (FGF):

– Pamilya ng FRF

– Pamilyang IL-1 (IL-1α, IL-1β, IL-33, atbp.).

5. Pamilyang Interleukin-6 (IL-6, IL-11, IL-31).

6. Pamilyang Interleukin-10 (IL-10,19,20,22,24,26)

7. Pamilyang Interleukin-12 (IL-12,23,27)

8. Mga cytokine ng T-helper clone at mga regulatory function ng lymphocytes (IL-2, IL-4-5, IL-7, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-21, IFNg)

9. Pamilya ng Interleukin 17 (IL-17A, B, C, D, E, F)

10. Mga chemokines.

11. Mga salik ng paglago:

– Superfamily ng nerve growth factor, platelet growth factor at transforming growth factor

– Pamilya ng epidermal growth factor (ERF, TRFα, atbp.);

– Pamilya ng insulin-like growth factors (IGF-I, IGF-II).

Ang mga cytokine ay maaaring ihiwalay sa isang bagong independiyenteng sistema ng regulasyon ng mga pangunahing pag-andar ng katawan, na umiiral kasama ng regulasyon ng nerbiyos at endocrine at pangunahing nauugnay sa pagpapanatili ng immune homeostasis sa panahon ng pagpapakilala ng mga pathogen at paglabag sa integridad ng tissue. Sa loob ng immune system, ang mga cytokine ay nagsasagawa ng dalawang-daan na relasyon sa pagitan ng hindi tiyak na mga salik ng pagtatanggol at tiyak na kaligtasan sa sakit.

Sa klinikal na kasanayan, mayroong tatlong pangunahing lugar ng paggamit ng mga cytokine:

1. cytokine therapy upang maisaaktibo ang mga reaksyon ng depensa ng katawan, immunomodulation, o upang mapunan ang kakulangan ng mga endogenous na cytokine;

2. anticytokine immunosuppressive therapy na naglalayong hadlangan ang biological action ng mga cytokine at ang kanilang mga receptor;

3. cytokine gene therapy upang mapahusay ang antitumor immunity o itama ang mga genetic defect sa cytokine system.

Ang mga cytokine ay ginagamit sa klinikal na kasanayan para sa parehong sistematiko at pangkasalukuyan na paggamit. Ang systemic administration ay nagbibigay-katwiran sa sarili nito sa mga kaso kung saan kinakailangan upang matiyak ang pagkilos ng mga cytokine sa ilang mga organo para sa mas epektibong pag-activate ng kaligtasan sa sakit, o upang maisaaktibo ang mga target na cell na matatagpuan sa iba't ibang bahagi ng katawan. Ang mga cytokine mula sa pangkat ng mga interferon (IFN), pangunahin ang alpha-IFN at beta-IFN, at sa mas mababang lawak ay natagpuan ng gamma-IFN ang pinakamalaking klinikal na paggamit sa kasalukuyan.

Ang mga interferon ay isang pangkat ng mga protina na may isang antiviral effect na ginawa ng mga eukaryotic cell bilang tugon sa pagpapakilala ng isang bilang ng mga biological na ahente sa kanila - interferonogens (RNA genomic virus, double-stranded RNA, iba't ibang polyanion, bacterial LPS).

Ang IFN ay nagdudulot ng iba't ibang epekto, na ipinakita sa parehong antas ng cellular at systemic. Ang IFN ay nailalarawan sa pagkakaroon ng tatlong pangunahing epekto - nonspecific antiviral, antitumor at immunomodulatory. Ang mga interferon ay may kakayahang pigilan ang pagpaparami ng maraming mga virus. Ang antiviral effect ng interferon ay batay sa pagsugpo sa koneksyon ng viral RNA sa mga ribosome ng cell, na humahantong sa imposibilidad ng pagpaparami ng virus sa cell.

Noong 1970s, ang lahat ng IFN ay nahahati sa 2 uri: yaong sapilitan ng mga virus (leukocytic at fibroblast), na inuri bilang unang uri, at yaong sapilitan ng mutagens (immune) - bilang pangalawa. Sa kasalukuyan, ang pag-uuri na ito ay nawala ang kahulugan nito. Noong 1980, isang komite ng mga eksperto mula sa World Health Organization ang nagpatibay at nagrekomenda para sa paggamit ng isang pag-uuri ayon sa kung saan ang lahat ng mga IFN ng tao ay nahahati sa 3 klase. Ang mga ito ay naka-encode ng iba't ibang mga gene at may pagkakasunod-sunod ng mga amino acid na katangian ng bawat klase, kung saan nabuo ang kanilang mga molekula. Kung mayroong mga recombinant na variant ng IFN, kadalasang tinutukoy ang mga ito ng mga titik na Romano.

Talahanayan 11 - Pag-uuri ng mga interferon ng tao

Sa kasalukuyan, ang lahat ng kaalamang natamo tungkol sa IFN ay maaaring gawing pangkalahatan sa agham ng "interphenology", na kinabibilangan ng teoretikal at praktikal (medikal at parmasyutiko) na aspeto ng problemang ito. Sa huling dekada, mayroong 4 na pangunahing kaganapan sa interphenology (na-highlight ni Prof. F. I. Ershov, 1996):

Ang konsepto ng "interferon system" ay nabuo at ang direkta at feedback na koneksyon nito sa immune system at neuroendocrine system ay ipinahayag;

Ang multiplicity ng IFN-ct genes (higit sa 20 sa mga cell ng tao) ay natuklasan;

Sa tulong ng mga modernong teknolohikal na pamamaraan, ang mga umiiral na paghahanda ng IFN ay napabuti at isang bagong henerasyon ng mga paghahanda ng IFN ay nilikha, ang mga orihinal na IFN inducers ay nasubok;

Ang mga indikasyon at contraindications para sa klinikal na paggamit ng IFN at ang kanilang mga inducers sa viral at non-viral na sakit ay natukoy.

Bilang isang inducer ng interferonogenesis, ginagamit ang isang strain ng bakuna ng Newcastle disease virus o ang Sendai virus. Ang pre-cultivation ng mga virus ay isinasagawa sa pagbuo ng 9-11 araw. mga embryo ng manok. Ang mga pangunahing teknolohikal na operasyon: ovoscopy, pagtanggi, pagpapapisa ng itlog ng mga embryo ng manok, ang pagpapakilala ng isang nakakahawang suspensyon sa allantoic cavity, na sinusundan ng pagpapapisa ng itlog para sa 48-72 na oras at ang pag-urong ng nahawaang likido mula sa mga patay na embryo ng manok. Ang virus-containing allantoic fluid ay centrifuge

Ang isang napakahalagang operasyon na tumutukoy sa kalidad ng tapos na produkto ay ang pag-alis ng mga impurities ng erythrocyte mula sa leucoconcentrate (yugto 1). Ang pinakakumpletong pag-aalis ng pagkakaroon ng mga erythrocytes sa leukoconcentrate ay ang kanilang selective lysis na may solusyon ng ammonium chloride sa isang physiological concentration.

Talahanayan 12 - Technological scheme para sa biosynthesis ng IFN-a

Teknolohikal na yugto	Mga tuntunin
1. Paghihiwalay ng mga leukocytes	Fractionation ng leukomas na may dextra-
	nom at polyvinyl alcohol na may after-
	pamumulaklak ng hemolysis. Nagbubunga ito ng 3
	layer. Ang pinakamataas na 2 layer ay centrifuge
	gyration at resuspension ng sediment in
	nutrient medium.
2. Priming (pag-activate	Leukocytes 10-20 milyon/ml sa medium No. 199 na may
metabolismo ng leukocyte)	5% donor blood plasma, 3 units/ml,
2-10 h, 37.5°C	0.0015 U/ml insulin, 200 IU/ml native
	IFN
3. Pagpapakilala ng virus inducer
3.1.Induction 1 h, 37.5°C	Newcastle disease virus (NDV), sa dosis na 5
	RCC 50 bawat 1 leukocyte
3.2 Paghihiwalay ng hindi nasisipsip	Centrifugation 600x d- 15 minuto.,
nabakunahang virus	pagkolekta ng precipitate ng sapilitan na mga cell.
4. Biosynthesis 18 h, 37.5°C	Kultura ng suspensyon Leukocytes 6 milyon/ml sa medium No. 199 na may 5% gamma globulin plasma, 5 ml ng sodium succinate, sodium bikarbonate hanggang pH 7.5, antibiotics. Ang output ng IFN-a ay 3-4 ME kada 1 libong leukocytes.
5. Hindi aktibo ang interferon virus	Dinadala ang pH ng medium sa 2.2-2.4 at pagkakalantad ng semi-tapos na produkto nang hindi bababa sa 7 araw.
6. Pagdalisay ng interferon	Sted: clarifying, ultrafiltration, sterilizing filtration

Sa yugto ng pag-culture ng mga leukocytes (yugto 2), ang leukocyte concentrate ay muling sinuspinde sa likido ng kultura, na, bilang karagdagan sa mga pangunahing bahagi, ay naglalaman ng ilang mga protina ng serum ng dugo, kung wala ang IFN biosynthesis ay halos hindi nangyayari. Natagpuan din na sa panahon ng paglilinang ng mga leukocytes, lalo na sa isang mataas na density ng suspensyon (10 7 mga cell / ml), ang mga metabolic na proseso ay isinaaktibo sa kanila, na sinamahan ng pagbuo ng mga acidic na produkto. Kaugnay nito, mahalagang mapanatili ang pH ng medium sa loob ng pinakamainam na limitasyon sa panahon ng priming at IFN biosynthesis. Upang mapanatili ang pH ng daluyan sa kinakailangang antas, iba't ibang mga sangkap na may kapasidad na buffer ay idinagdag sa daluyan.

Ang mga pinakamainam na kondisyon para sa paggawa ng IFN (stage 4) ay nilikha sa pamamagitan ng pag-culture ng mga leukocyte sa 37-37.5°C. Ang pagbabawas ng temperatura ng incubation sa 35°C at mas mababa, o, sa kabaligtaran, ang pagtaas nito sa 38°C at pataas ay humantong sa isang makabuluhang pagbaba sa produksyon ng IFN.

Ang IFN-a ay maaaring gawin pareho sa ilalim ng nakatigil na mga kondisyon ng paglilinang at sa mga kultura na may patuloy na paghahalo ng cell. Ito ay pinaniniwalaan na ang mga cell sa isang suspendido na estado ay gumagawa ng IFN-a nang mas intensively. Ang malaking kahalagahan para sa kaligtasan ng mga cell sa mga kultura ng suspensyon ay ang hugis ng mga sisidlan, ang taas ng likidong layer at sapat na dami ng oxygen sa hangin. Ang mga pinakamainam na kondisyon para sa pagkuha ng mga titer ng IFN-a ay nilikha sa pamamagitan ng pag-culture ng mga leukocytes sa mga round-bottom flasks na natatakpan ng foil, kalahati ay puno ng cell suspension, na may patuloy na paghalo. Ang pretreatment ng mga leukocytes na may maliliit na dosis ng IFN-a ay humantong sa pagtaas ng ani ng IFN ng 3-10 beses.

Pagkatapos ng resuspension, ang mga leukocyte ay na-induce ng allantoic (non-enveloped) Newcastle o Sendai disease virus. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog sa loob ng 20 oras sa 37.5° C., kung saan ang pagpapanatili ng kakayahang kunin ng kultura at mataas na metabolismo ng cell sa isang pare-parehong pH ay pangunahing kahalagahan, ang mga selula ay pinaghihiwalay ng mababang bilis ng sentripugasyon (2000 rpm) sa loob ng 40 minuto. Ang aktibidad ng interferon sa mga paghahanda na nakuha bilang isang resulta ng inilarawan na pamamaraan ay 30-200,000 IU / ml.

Sa modernong biotechnology, ang mga pamamaraan ng genetic engineering ay lalong ginagamit. Nasa maraming laboratoryo na sa buong mundo, ang mga gene na naka-encode sa pagbuo ng isang bilang ng mga biologically active substance ay matagumpay na nakuha at isinama sa genetic apparatus ng cultivated bacterial o somatic cells.

Ang mga functional na gene para sa biotechnological na produksyon ay muling nilikha sa pamamagitan ng reverse transcription o synthesize mula sa mga indibidwal na nucleotides, na nakahiwalay sa DNA ng mga kaukulang chromosome.

Nagsimula ang mga eksperimento sa paglipat ng mga gene ng IFN ng tao sa mga bacterial cell noong huling bahagi ng 1970s. Halos sabay-sabay sa 3 pangkat ng pananaliksik: sa Institute of Molecular Biology I ng Unibersidad ng Zurich sa ilalim ng pamumuno ni Weismann, sa Department of Biochemistry ng Institute for Cancer Research sa Tokyo sa ilalim ng pamumuno ni T. Taniguchi at sa USA ni ang sangay ng kumpanyang "Genentech" sa ilalim ng direksyon ni J. Geddel.

Ang lahat ng tatlong grupo ng mga mananaliksik ay gumamit ng paraan ng reverse transcription ng interferon mRNA para sa pag-clone. Bilang halimbawa, isaalang-alang ang kurso ng mga eksperimento ng grupong Weisman.

Para sa pag-clone ng α-IFN gene, isang bahagi ng 12 S poly(A) mRNA (adenylated messenger RNA) na nakuha mula sa mga leukocyte cells na sapilitan ng Sendai virus ay ginamit bilang panimulang materyal. Sa batayan ng messenger RNA, ang DNA na pantulong dito ay nakuha, na binubuo ng 2 chain. Ang nagresultang double-stranded na DNA ay hinukay gamit ang mga restriction enzymes upang mabuo ang malagkit na dulo ng oligo-dG. Ang isang katulad na operasyon ay isinagawa kasama ang plasmid na may pagbuo ng isang malagkit na oligo-dC-end. Ginamit ang mga ligase upang magpasok ng pantulong na DNA na naglalaman ng impormasyon tungkol sa istruktura ng α-IFN sa pBR322 plasma.

Ang plasmid na ito ay nagdadala ng mga gene ng komposisyon nito na tumutukoy sa paglaban sa dalawang antibiotic: tetracycline at ampicillin. Ang pagpasok ng interferon DNA ay hindi aktibo ang gene na responsable para sa paglaban sa ampicillin, kaya ang pangunahing pagpili ng mga cell na nakatanggap ng mga hybrid na plasmid ay batay sa paglaban sa tetracycline.

Ang sumusunod na pamamaraan ay ginamit upang piliin ang nais na mga clone: ​​isang halo ng ilang mga plasmid mula sa iba't ibang mga clone, ang isa ay maaaring naglalaman ng interferon DNA, ay na-denatured at nakatali sa isang solidong suporta. Ang mga sample ng RNA na nagmula sa mga cell ng tao na gumagawa ng IFN ay na-hybrid sa DNA na ito, ang mga filter ay hinuhugasan, ang RNA ay na-eluted sa ilalim ng mga kondisyon ng denaturing, at ang eluate ay na-injected sa African green frog oocytes upang makita ang interferon mRNA. Kabilang sa mga hybridizing clone, isa ang napili, pinangalanang Hif-2h, na may insert na tumutugma sa laki ng buong α-IFN gene.

Ang mga selulang E. coli na naglalaman ng mga hybrid na plasmid na nagdadala ng naturang insert ay may kakayahang mag-synthesize ng polypeptide na may biological na aktibidad ng interferon.

Ang trabaho sa interferon gene cloning ay paulit-ulit at binuo ng mga may-akda na pinangalanan sa itaas at ng iba pang mga grupo ng mga mananaliksik sa maraming mga bansa. Sa USSR, ang unang matagumpay na pag-clone ng leukocyte interferon gene ay inilarawan noong 1982. acad. Ovchinnikov, fibroblast noong 1983 - Yu.I. Kozlov, immune - noong 1985 E.D. Sverdlov.

Sa kasalukuyan, ang pagpapahayag ng mga gene ng IFN ay ginawa hindi lamang sa mga selula ng E. coli, kundi pati na rin sa mga selula ng iba pang mga gramo-negatibong bakterya (Pseudomonas) - pinagbabatayan nito ang pang-industriyang produksyon ng IFN sa Russia. Sa kasalukuyan ay pinaniniwalaan na ang paggamit ng lebadura para sa mga layuning ito ay pinaka-epektibo.

Ang mga yeast ng genus Saccharomyces ay hindi pathogenic para sa mga tao, mayroon silang mga siglo ng karanasan sa kanilang paggamit. Ang mga yeast ay hindi napapailalim sa lysis, autolysis, madaling nahiwalay, at gumagamit ng murang mga substrate. Ang yeast biomass ay hindi naglalaman ng nakakalason at pyrogenic na mga kadahilanan, tulad ng mga cell ng gram-negative na bakterya.

Ang isang napakahalagang pangyayari ay ang pagkakatulad din ng mga mekanismo ng pagtatago ng lebadura at mas mataas na eukaryotes, na nagmumungkahi na ang mga na-clone na preinterferon na gene ay makakagawa ng mature na IFN bilang resulta ng wastong pagproseso.

Ang teknolohiya ng mass cultivation ng mga cell-producer ng recombinant IFN ay nagawa na. Kaya, para sa domestic paghahanda ng reaferon, kabilang dito ang:

Paglilinang ng isang bacterial strain na gumagawa ng reaferon sa 100 l fermenters na may ani na 5-7x103 ME mula sa 1 l ng culture liquid,

pagkasira ng biomass sa pamamagitan ng isang pamamaraan na nagbibigay-daan upang madagdagan ang proseso na may 60-70% na ani ng target na produkto,

Preliminary purification ng reaferon sa isang ion exchanger; ang pangwakas na paglilinis ng gamot ay isinasagawa sa isang immunosorbent na may monoclonal antibodies sa leukocyte IFN-a type 5AC.

Ang pangunahing producer ng recombinant IFN ay bacterial strains, sa cytoplasm, na IFN ay synthesize at bumubuo lamang ng isang fraction ng isang porsyento ng kabuuang masa ng bacterial proteins. Pagkatapos ng akumulasyon sa mga espesyal na fermenter ng isang sapat na mataas na konsentrasyon ng mga cell, sila ay inalis mula sa fermenter at nawasak (lysed). Ang mga pangunahing pamamaraan ng lysis ay: osmotic shock, freezing-thawing, homogenization, paggamot na may detergents. Pagkatapos, gamit ang sunud-sunod na mga pamamaraan ng pagsasala, centrifugation, ion exchange chromatography at gel chromatography, ang paunang paglilinis ng IFN ay nangyayari, na nagreresulta sa isang transparent na bacterial extract, kung saan ang IFN ay bumubuo pa rin ng hindi hihigit sa 1-2% ng kabuuang protina. Panghuling paglilinis ng gamot sa immunosorbent na may monoclonal antibodies sa IFN.

Ang mga monoclonal antibodies sa IFN ay "sewn" sa carrier beads at inilagay sa isang chromatographic column. Pagkatapos ay inilapat ang isang bacterial extract na naglalaman ng recombinant IFN sa column. Ang IFN lamang ang nagbubuklod sa mga antibodies, habang ang iba pang bahagi ng katas, kabilang ang lahat ng bacterial toxins, ay malayang dumaan sa column at inaalis ng washing solution. Upang kunin mula sa column, ang recombinant na IFN na na-adsorb sa mga antibodies ay ipinapasa sa column na may eluting buffer solution na may bahagyang acidic na reaksyon. Sa kasong ito, ang koneksyon sa pagitan ng mga molekula ng IFN at mga antibodies ay nasira. Ang IFN ay dumadaan mula sa ibabaw ng mga particle ng Sepharose papunta sa buffer solution at maaaring kolektahin bilang isang purong substance na walang mga kontaminadong protina.

Ang mabilis na pagpapalawak ng paggamit ng mga recombinant na IFN at ang kamakailang kahanay na pagbawas sa paggamit ng mga natural na gamot ay higit sa lahat dahil sa kakulangan ng mga hilaw na materyales para sa paggawa ng huli (donor na dugo), pati na rin ang pagkalat ng mga sakit na viral na nakukuha sa pamamagitan ng dugo (HIV, hepatitis C). Sa koneksyon na ito, sa kabila ng pagkakaroon ng ilang mga pakinabang ng natural na paghahanda ng IFN, halos mga recombinant na paghahanda lamang ang ginagamit sa klinika.

Ang pamilya ng IFN-a ay naglalaman ng humigit-kumulang 20 subtypes, kaya natural na paghahanda - Human leukocyte interferon, Egiferon, Velferon ay multicomponent at naglalaman ng lahat o hindi bababa sa karamihan ng mga subtype. Ang mga natural na IFN ay walang mga antigenic na katangian at hindi nagiging sanhi ng sensitization sa matagal na paulit-ulit na pangangasiwa. Ang ilang mga recombinant na IFN, sa kabaligtaran, kapag pinangangasiwaan sa pamamagitan ng iniksyon, ay maaaring maging sanhi ng pagbuo ng neutralizing o binding antibodies.

Ang pinakakaraniwang ginagamit na mabilis (non-pegylated) at pegylated alpha at beta IFNs. Halimbawa, ang recombinant IFN-a2a (Reaferon, Roferon, Pegasys), recombinant IFN-a2b (Intron A, Realdiron, Peg-Intron), na mga analogue ng natural na mga subtype na may mga point mutations sa istruktura ng protina lis-his, arg-his , arg-arg, ayon sa pagkakabanggit, na may maliit na epekto sa aktibidad, ngunit makabuluhan mula sa punto ng view ng sensitization. Kaya, ang mga paghahanda ng IFN-a2a, na hindi katangian ng populasyon ng tao, ay may mataas na panganib na magdulot ng sensitization at pagbuo ng mga antibodies, na, sa mataas na titers, ay magbabawas ng kanilang potensyal na therapeutic.

Ang immuno interferon (IFN gamma) ay maaaring ituring bilang isang bahagi ng mga gamot na inilaan para sa paggamot ng mga sakit na viral, oncological at autoimmune. Ang isang bilang ng mga paghahanda batay dito ay nilikha sa ibang bansa: Immuneron (USA), Immunomax (Japan), Imukin (Germany). Sa Russia, isang mahusay na pamamaraan para sa pagkuha ng mataas na purified Deltaferon ay binuo, batay sa dalawang sunud-sunod na chromatography sa parehong sorbent, ngunit sa magkaibang mga halaga ng pH. Ginagawang posible ng scheme na ito na makakuha ng recombinant Deltaferon sa mga dami ng paghahanda na may katanggap-tanggap na nilalaman ng mga high-polymer na impurities. Ang mga pagbabago sa molekula ng protina (pagpapaikli sa molekula ng 10 amino acid at 3 pagpapalit ng amino acid) ay humantong sa isang 20-tiklop na pagkawala ng aktibidad na antiviral kumpara sa buong IFN-γ, ngunit hindi nakaapekto sa mga katangian ng immunomodulatory nito. Bilang resulta ng pagbabagong ito, ang deltaferon ay nakabuo ng paglaban sa mga proteolytic enzymes. Ang mga pang-eksperimentong anyo ng dosis ng deltaferon ay binuo na nagbibigay-daan sa pagpapanatili ng protina sa kanyang katutubong estado nang walang pagkawala ng partikular na aktibidad. Ang LF ng deltaferon ay may mga katangian ng immunomodulatory na likas sa orihinal na gamma-interferon.

Mula sa isang pharmacological point of view, ang mga paghahanda ng IFN ay dapat isaalang-alang, una sa lahat, bilang mga immunomodulators na nakakaapekto sa functional na aktibidad ng mga effector cells ng immune system, lalo na ang T-lymphocytes at monocytes (macrophages). Sa ilalim ng pagkilos ng IFN, ang kahusayan ng immune recognition ng antigen ay tumataas at ang phagocytic at cytolytic function ay pinahusay, na naglalayong alisin ang pathogen o antigenically altered na mga cell. Ang interferon ay nagpapalipat-lipat sa katawan ng halos 2 linggo, na dapat isaalang-alang kapag ginagamit ito bilang isang prophylactic agent.

Ipinakita ng maraming taon ng karanasan na ang intranasal administration ng IFN ay may malinaw na prophylactic efficacy laban sa iba't ibang mga virus ng trangkaso at parainfluenza. Ang proteksiyon na epekto ay pinaka-binibigkas sa araw-araw na paggamit ng gamot gamit ang mga inhaler o nebulizer. Maramihang mga pag-install ng intranasal o paglanghap ng isang solusyon ng gamot sa pamamagitan ng ilong at bibig sa anyo ng isang aerosol sa unang dalawang araw ng sakit na humantong sa isang mas mabilis na pagbaba sa mga phenomena ng pagkalasing at febrile reaksyon. Ang kalubhaan ng pamamaga sa itaas na respiratory tract ay mas mabilis ding bumaba. Ipinakita ng mga kamakailang pag-aaral na pinipigilan ng IFN ang paglaganap ng mga selula ng tumor, na ginagawang epektibo ito sa paggamot ng mga sakit sa tumor. Ang epekto ng antitumor ng IFN ay maaaring ipaliwanag sa pamamagitan ng pagpapasigla ng mga natural na mekanismo ng depensa ng katawan, lalo na sa mga lymphocytes, na pumapatay sa mga selula ng kanser o bumubuo ng mga antibodies.

Sa ngayon, ang isang hanay ng mga sakit ay natukoy kung saan ang paggamit ng IFN ay epektibo. Sa mga impeksyon sa viral, ito ay ang SARS, influenza, encephalitis, viral hepatitis, herpetic lesions ng mata (conjunctivitis, keratoconjunctivitis), mucous membrane at mata. Ayon sa mga clinician, sa kaso ng herpetic lesions ng balat at mauhog lamad, ang lokal na aplikasyon ng gamot ay dapat na mas gusto. Natagpuan ng IFN ang aplikasyon sa paglipat ng organ bilang isang paraan ng pagpigil sa pangalawang impeksyon sa viral. Ang isang maikling pagsusuri ay nagpapahintulot sa amin na tapusin na ang IFN ay maaaring positibong maimpluwensyahan ang pag-unlad ng iba't ibang mga sakit ng viral etiology. Ang pagiging epektibo nito ay pinaka-binibigkas sa mga talamak na impeksyon, sa mga unang yugto ng sakit. Sa klinikal na paggamit, ang kagustuhan ay dapat ibigay sa lokal na pangangasiwa, na tinitiyak ang pinakamababang pagkonsumo ng gamot. Bilang karagdagan, ang pangkasalukuyan na aplikasyon ay iniiwasan ang mga negatibong epekto na sinusunod sa systemic na pangangasiwa ng mataas na dosis ng IFN.

Ang bawat form ng dosis ay may sariling larangan ng aplikasyon, dahil sa mga katangian ng immunobiological at pharmacological nito. Ang probisyong ito ay binigkas ng mga sumusunod:

Ang mga paghahanda ng IFN ay hindi dapat maging sanhi ng sensitization phenomena na may matagal na paulit-ulit na paggamit sa mga pasulput-sulpot na kurso. Ang biosynthesis ng IFN para sa paghahanda ng iba't ibang mga form ng dosis ay maaaring isagawa ayon sa isang solong teknolohikal na pamamaraan, ngunit ang mga pamamaraan para sa paglilinis ng IFN at ang pamantayan nito ay dapat matugunan ang mga layunin ng therapy. Sa mga injectable dosage form, ang mga impurities na antigenic para sa mga tao ay dapat wala. Ang kanilang antas sa paghahanda para sa pangkasalukuyan na paggamit ay dapat na mas mababa sa threshold ng sensitization.

Sa teoryang, 3 pangunahing grupo ng mga antigen ay maaaring naroroon sa natural na paghahanda ng IFN-a:

antigens ng virus-inducer at chicken allantoic fluid;

erythrocyte antigens na tumutukoy sa pangkat ng dugo at Rh-affiliation;

leukocyte HLA antigens.

Ang biotechnology para sa pagkuha ng IFN ay dapat magsama ng mga operasyon na naglilimita sa posibilidad ng pagtagos ng mga antigen na ito sa mga form ng dosis. Sa teknolohiya, ang pinakamahirap na gawain ay ang pag-alis ng mga antigen ng grupo I, dahil ipinakilala sila sa suspensyon sa malalaking dami sa yugto ng induction.

Ang mga paghahanda ng natural na IFN-a, depende sa mga paraan ng paglilinis, ay maaaring nahahati sa dalawang grupo - katutubong at puro. Sa mga tuntunin ng komposisyon ng protina, ang mga katutubong uri ng paghahanda ay halos hindi naiiba sa orihinal na semi-tapos na mga produkto, ay nailalarawan sa mababang partikular na aktibidad - hanggang sa 1-104 IU bawat 1 mg ng protina, ngunit pinapanatili ang lahat ng mga cytokine na ginawa sa panahon ng interferonogenesis sa kanilang natural na ratio. Samakatuwid, mayroon silang mataas na potensyal para sa immunobiological action.

Ang biotechnology para sa pagkuha ng puro paghahanda ay kinabibilangan ng paglilinis ng kemikal, na humahantong sa pagbawas sa potensyal ng immunobiological action dahil sa pagkawala ng mga cytokine. Gayunpaman, ang mga paghahandang ito ay mahalaga din para sa praktikal na pangangalagang pangkalusugan. Halimbawa, ang highly concentrated human leukocyte IFN - CLI para sa mga iniksyon - ay kailangan pa rin sa mga sitwasyon kung saan kinakailangan na magbigay ng mataas na solong dosis (lymphoblastic leukemia sa talamak na yugto), gayundin sa paggamot ng mga viral at oncological lesyon na naisalokal sa kabila ng hadlang sa dugo-utak. Kasama rin sa concentrated type ang interlock, na matagumpay na ginagamit para sa lokal na paggamot ng mga viral eye lesion.

Ang ikatlong pangkat ay binubuo ng mga recombinant na IFN na kinakatawan ng reaferon at realdon. Sa maraming anyo ng patolohiya, ang mga pangkasalukuyan na paghahanda (mga intranasal drop, ointment, rectal suppositories, eye films, atbp.) ay mas epektibo kaysa sa mga iniksyon. Halimbawa, sa aktibong talamak na HBV, ang paggamit ng mga rectal suppositories na naglalaman lamang ng 100,000 IU ng IFN-a ay nagbibigay ng parehong mga resulta tulad ng intramuscular administration ng isang highly concentrated na paghahanda sa isang dosis na 3 IU. Ang pagkonsumo ng gamot at ang gastos ng paggamot kapag gumagamit ng rectal suppositories ay nabawasan ng sampung beses.

Mga modernong recombinant na paghahanda ng IFN:

Reaferon(human recombinant IFN-a2) na ginawa ng NPO Vector, Novosibirsk.

nakuha sa pamamagitan ng paglilinang ng bacterial strain ng Pseudomonas sporogenosa na naglalaman sa genetic apparatus nito ng isang nakapasok na recombinant plasmid ng human IFN-a2 gene.

Ito ay inilaan para sa intramuscular, subconjunctival at topical na paggamit.

Ginawa sa anyo ng lyophilized powder sa ampoules.

Intron A(human recombinant IFN-a2b) mula sa Schering Plow - USA.

Ang gamot ay nakuha sa pamamagitan ng recombinant DNA technology gamit ang bacterial E. coli na naglalaman ng genetically engineered gene na naka-encode sa protina ng tao.

Pagtutukoy ng aktibidad 2*108 IU/mg protina.

Ang pagpapakilala ng malalaking dosis ng protina ay sinamahan ng isang pagtaas sa temperatura, ang hitsura ng isang sakit ng ulo, isang pagkabalisa ng gastrointestinal tract (pagduduwal, kung minsan ay exacerbation ng hepatitis), at mga kaguluhan sa paggana ng cardiovascular system ay nangyayari.

Batay sa pag-aaral ng ontogenesis ng IFN system, isang bagong domestic na gamot na Viferon suppositories ang binuo, kabilang ang recombinant IFN-a, at mga antioxidant na gamot. Napatunayan ng Viferon ang sarili sa paggamot ng mga sakit na viral at bacterial sa mga bagong silang: intrauterine herpes, chlamydia, SARS, candidiasis

pegylated interferon

Ang antiviral therapy ay isa sa mga pangunahing lugar ng promising na paggamit ng mga paghahanda ng pegylated peptide. Ang isang kapansin-pansin na halimbawa ng paggamit ng konsepto ng pegylation ng mga biotechnological na gamot ay ang paglikha ng mga pegylated interferon (peg-IFN). Sa klinikal na kasanayan, sa kasalukuyan, ang mga pegylated analogue ng alpha-interferon ay ginagamit - PEG-interferon-alpha 2b (Pegintron; Shering Plough) at PEG-interferon-alpha 2a (Pegasys; Hoffmann La Roche).

Determinado na Ang mga interferon ay na-synthesize sa cell, una sa anyo ng mga precursor na naglalaman ng isang signal peptide sa N-terminus ng polypeptide chain, na pagkatapos ay pinutol at, bilang isang resulta, isang mature interferon na may buong biological na aktibidad ay nabuo. Ang bakterya ay hindi naglalaman ng mga enzyme na may kakayahang magtanggal ng signal peptide upang bumuo ng isang mature na protina. Upang ang bakterya ay nag-synthesize ng mature interferon, tanging ang bahagi ng gene na nag-encode nito ang dapat ipasok sa plasmid, at ang bahagi ng gene na nag-encode ng signal peptide ay dapat alisin. Ang pamamaraan ay nangangailangan pagsunod sa mga sumusunod na kondisyon:

Ang interferon gene ay dapat maglaman ng tatlong Sau 3A1 cleavage site, kung saan ang isa ay katabi ng signaling portion.

Ang hindi kumpletong cleavage ng gene na may ganitong enzyme ay ginagawang posible na ihiwalay ang isang gene fragment na naglalaman ng nucleotide sequence na nag-encode ng mature na interferon.

Ang ATG triplet encoding cysteine ​​​​ay pinuputol ng enzyme kasama ang bahagi ng signal.

Upang maibalik ang pagkakasunud-sunod ng polynucleotide ng kumpletong gene, ang isang fragment ng DNA ay na-synthesize ng kemikal na naglalaman ng triplet na ito, pati na rin ang triplet ng ATG na katabi nito, ang punto ng pagsisimula ng synthesis ng protina.

Ang fragment na ito ay nakakabit sa nakahiwalay na bahagi ng mature na gene, na nagreresulta sa pagpapanumbalik ng kumpletong mature na interferon gene.

Ang reconstructed gene ay ipinakilala sa plasmid sa paraang ito ay katabi ng DNA promoter region, na nagbigay ng simula ng mRNA synthesis.

Mga extract mula sa E. Coli, naglalaman ng naturang plasmid , nagkaroon ng aktibidad na antiviral.

Ang interferon na na-synthesize ng genetic engineering ay isolated, purified, at ang physicochemical properties nito ay naging malapit sa interferon na nakuha mula sa donor blood. Nakakuha ng bakterya may kakayahan synthesize hanggang sa 5 mg ng interferon bawat 1 litro ng bacterial suspension na naglalaman ng humigit-kumulang 10 11 bacterial cells, na 5000 beses na mas malaki kaysa sa halaga ng interferon na maaaring makuha mula sa 1 litro ng donor blood.

Sa kasalukuyan, ang mga gene ng interferon ay na-clone sa lebadura at mas mataas na mga eukaryotic na selula na may kakayahang glycosylation.

Noong 1991, sa unang pagkakataon sa Estados Unidos, ginamit ang genetically engineered yeast cells upang synthesize ang interferon ng leukocyte ng tao. Saccharomyces cerevisiae. Ang nagresultang mahusay na pagpapahayag ng LeIF gene at ang pagpapalit ng bakterya na may mga selula ng lebadura ay naging posible upang madagdagan ang produksyon ng interferon ng 10 beses.

Sa Russia noong 1994, isang kumpletong synthesis ng gene ang isinagawa α- At mga 600 N ang laki. n. (mga nucleotide point) sa Institute of Bioorganic Chemistry sa ilalim ng direksyon ni N. M. Kolosov.

Sa kabila ng pag-unlad na ginawa sa larangan ng pagkuha ng mga interferon gamit ang mga teknolohiyang genetic engineering at ang kanilang aplikasyon para sa paggamot ng iba't ibang mga sakit na viral, kabilang ang kanser, marami pa ring mga isyu na dapat lutasin tungkol sa pag-decode ng mga mekanismo ng kanilang biosynthesis at pakikipag-ugnayan sa iba pang mga sangkap. .

Ang scheme ng biological action ng interferon ay ipinapakita sa Figure 8.34.

kanin. 8.34. Ang mekanismo ng pagkilos ng interferon

Ang mekanismo ng pagkilos ng interferon ay maaaring mabawasan sa mga sumusunod pangunahing yugto:

1. Sa pamamagitan ng pagbubuklod sa mga cellular receptor, pinasimulan ng mga interferon ang synthesis ng 5 "-oligoadenylan synthetase at protina kinase enzymes sa pamamagitan ng pagsisimula ng transkripsyon ng kaukulang mga gene;

2. Ang parehong mga enzyme ay nagpapakita ng kanilang aktibidad sa pagkakaroon ng double-stranded DNA, na mga produkto ng pagtitiklop ng maraming mga virus;

3. Ang enzyme na 5"-oligoadenylansynthetase ay nagpapagana ng synthesis ng 2" 5"-oligoadenylates (mula sa ATP), na nagpapagana ng cellular ribonuclease;

4. Protein kinase phosphorylates at sa gayon ay ina-activate ang translation initiation factor IF 2. Bilang resulta ng mga pangyayaring ito, ang biosynthesis ng protina at pagpaparami ng virus (mRNA at rRNA degradation) sa infected na cell ay pinipigilan, na nagiging sanhi ng lysis nito.