padavinske reakcije. Reakcija aglutinacije, reakcija precipitacije Imunoelektronska mikroskopija

imunodiagnostične reakcije. Reakcije antigen-protitelo in reakcije z označenimi komponentami. Uporablja se za identifikacijo mikroorganizmov in diagnozo nalezljivih bolezni.

Imunske reakcije se uporabljajo v diagnostičnih in imunoloških študijah pri bolnikih in zdravi ljudje. V ta namen se prijavite serološke metode (iz lat. serum - serum in logotipi - doktrina), tj. metode za preučevanje protiteles in antigenov z uporabo reakcij antigen-protitelo, določenih v krvnem serumu in drugih tekočinah ter telesnih tkivih.

Odkrivanje protiteles proti antigenom patogena v krvnem serumu pacienta omogoča diagnosticiranje bolezni. Serološke študije se uporabljajo tudi za identifikacijo mikrobnih antigenov, različnih biološko aktivnih snovi, krvnih skupin, tkivnih in tumorskih antigenov, imunskih kompleksov, celičnih receptorjev itd.

Ko mikrob izoliramo od pacienta, identificiramo povzročitelja s proučevanjem njegovih antigenskih lastnosti z uporabo imunskih diagnostičnih serumov, to je krvnih serumov hiperimuniziranih živali, ki vsebujejo specifična protitelesa. Ta t.i serološka identifikacija mikroorganizmi.

V mikrobiologiji in imunologiji se pogosto uporabljajo reakcije aglutinacije, precipitacije, nevtralizacijske reakcije, reakcije, ki vključujejo komplement, z uporabo označenih protiteles in antigenov (radioimunološki, encimski imunski test, metode imunofluorescence). Naštete reakcije se razlikujejo po registriranem učinku in tehniki postavljanja, vendar so vse bazične. na reakcijo interakcije antigena s protitelesom in se uporabljajo za odkrivanje tako protiteles kot antigenov. Za imunske reakcije je značilna visoka občutljivost in specifičnost.

Spodaj so podani principi in sheme glavnih imunodiagnostičnih reakcij. Tehnika podrobnosti nastavitev reakcij je podana v. praktične smernice za imunodiagnostiko.

Aglutinacijska reakcija - RA(iz lat. agluti- natio- bonding) - preprosta reakcija, pri kateri protitelesa vežejo korpuskularne antigene (bakterije, eritrocite ali druge celice, netopne delce z adsorbiranimi antigeni na njih, pa tudi makromolekularne agregate). Pojavi se v prisotnosti elektrolitov, na primer, ko dodamo izotonično raztopino natrijevega klorida.

Prijavite se različne možnosti aglutinacijske reakcije: ekspandirana, približna, posredna itd. Aglutinacijska reakcija se kaže s tvorbo kosmičev ali usedline

RA se uporablja za:

določanje protiteles v krvnem serumu bolnikov, na primer z brucelozo (reakcije Wright, Heddelson), tifus in paratifus (Vidalova reakcija) in druge nalezljive bolezni;

določitev patogena, izoliranega od bolnika;

določanje krvnih skupin z uporabo monoklonskih protiteles proti eritrocitnim alogenom.

Za določitev bolnikovih protiteles postavitipodaljšana reakcija aglutinacije: dodajte razredčitvam bolnikovega krvnega seruma diagnosticum(suspenzija ubitih mikrobov) in po nekaj urah inkubacije pri 37 °C opazimo največjo razredčitev seruma (serumski titer), pri kateri je prišlo do aglutinacije, tj. do nastanka oborine.

Narava in hitrost aglutinacije sta odvisni od vrste antigena in protiteles. Primer je interakcija diagnostikov (O- in R-antigenov) s specifičnimi protitelesi. Aglutinacijska reakcija z O-diagnostikum(bakterije ubije toplota, ohranijo termostabilen O antigen) poteka v obliki drobnozrnate aglutinacije. Aglutinacijska reakcija s H-diagnosticumom (bakterije, ki jih ubije formalin, obdrži toplotno labilen flagelarni H-antigen) je grobozrnata in poteka hitreje.

Če je treba določiti patogen, izoliran od pacienta, postavite orientacijska reakcija aglutinacije, z uporabo diagnostičnih protiteles (aglutinacijski serum), tj. Izvede se serotipizacija patogena. Približna reakcija izvedeno na stekelcu. Kapljici diagnostičnega aglutinacijskega seruma v razredčini 1:10 ali 1:20 dodamo čisto kulturo povzročitelja, izoliranega od bolnika. V bližini je postavljena kontrola: namesto seruma se nanese kapljica raztopine natrijevega klorida. Ko se v kapljici pojavi kosmičasta usedlina s serumom in mikrobi, dajo obsežna reakcija aglutinacije v epruvetah z naraščajočimi razredčinami aglutinacijskega seruma, ki mu dodamo 2-3 kapljice suspenzije patogena. Aglutinacija se upošteva glede na količino usedline in stopnjo zbistrenosti tekočine. Reakcija se šteje za pozitivno, če opazimo aglutinacijo v razredčitvi blizu titra diagnostičnega seruma. Hkrati se upoštevajo kontrole: serum, razredčen z izotonično raztopino natrijevega klorida, mora biti prozoren, suspenzija mikrobov v isti raztopini mora biti enakomerno motna, brez usedline.

Različne sorodne bakterije je mogoče aglutinirati z istim diagnostičnim aglutinacijskim serumom, kar oteži njihovo identifikacijo. Zato, uživajte adsorbirani aglutinacijski serumi, iz katerih so bila navzkrižno reaktivna protitelesa odstranjena z adsorpcijo sorodnih bakterij. V takih serumih ostanejo protitelesa, specifična samo za to bakterijo. Pripravo monoreceptorskih diagnostičnih aglutinacijskih serumov na ta način je predlagal A. Castellani (1902).

Reakcija indirektne (pasivne) hemaglutinacije (RNHA, RPHA) temelji na uporabi eritrocitov z antigeni ali protitelesi, adsorbiranimi na površini, katerih interakcija z ustreznimi protitelesi ali antigeni krvnega seruma kroglice povzroči, da se eritrociti zlepijo in padejo na dno. epruveto ali celico v obliki nazobčanega sedimenta (slika 13.2). pri povratni udarec eritrociti se usedejo v obliki "gumba". Običajno se protitelesa odkrijejo v RNHA z uporabo antigenskega eritrocitnega diagnostika, ki je eritrocit z adsorbirano na ti antigeni. Včasih uporabljamo protitelesno diagnostiko eritrocitov, na katere se adsorbirajo protitelesa. Na primer, botulinski toksin lahko odkrijemo tako, da mu dodamo eritrocitno protitelo botulinum diagnosticum (to reakcijo imenujemo reakcija povratne indirektne hemaglutinacije- RONGA). RNHA se uporablja za diagnosticiranje nalezljivih bolezni, določanje gonadotropnega hormona v urina, ko je nosečnost ugotovljena, za odkrivanje preobčutljivost do zdravila, hormoni in v nekaterih drugih primerih.

Reakcija koaglutinacije . Patogene celice se določijo s pomočjo stafilokokov, predhodno obdelanih z imunskim diagnostičnim serumom. Protein, ki vsebuje stafilokoke AMPAK, imeti afiniteto do Fc -fragment imunoglobulinov, nespecifično adsorbira protimikrobna protitelesa, ki nato sodelujejo z aktivnimi centri z ustreznimi mikrobi, izoliranimi od bolnikov. Kot posledica koaglutinacije nastanejo kosmiči, sestavljeni iz stafilokokov, diagnostičnih serumskih protiteles in določenega mikroba.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (RTGA) temelji na blokadi, zatiranju antigenov virusov s protitelesi imunskega seruma, zaradi česar virusi izgubijo sposobnost aglutinacije rdečih krvnih celic (slika 13.3). RTHA se uporablja za diagnosticiranje številnih virusnih bolezni, katerih povzročitelji (gripa, ošpice, rdečke, klopni encefalitis itd.) Lahko aglutinirajo eritrocite različnih živali.

Aglutinacijska reakcija za določanje krvnih skupin uporablja se za vzpostavitev sistema ABO (glej poglavje 10.1.4.1) z uporabo aglutinacije eritrocitov s protitelesi imunskega seruma proti antigenom krvnih skupin A (II), B (III). Kontrole so: serum brez protiteles, tj AB (GU) krvne skupine; antigeni, ki jih vsebujejo eritrociti skupin A (II), B (III). Negativna kontrola ne vsebuje antigenov, tj. uporabljeni so eritrociti skupine 0 (I).

AT aglutinacijske reakcije za določanje Rh faktorja(glejte poglavje 10.1.4.1) uporabite anti-Rh serume (vsaj dve različni seriji). V prisotnosti antigena Rh na membrani proučevanih eritrocitov pride do aglutinacije teh celic. Za kontrolo služijo standardni Rh-pozitivni in Rh-negativni eritrociti vseh krvnih skupin.

Aglutinacijska reakcija za določanje protiteles proti rezusu ( posredna reakcija Coombs)uporablja pri bolnikih z intravaskularna hemoliza. Pri nekaterih od teh bolnikov najdemo protitelesa proti rezusu, ki so nepopolna, monovalentna. Posebej interagirajo z Rh-pozitivnimi eritrociti, vendar ne povzročajo njihove aglutinacije. Prisotnost takšnih nepopolnih protiteles ugotavljamo v indirektni Coombsovi reakciji. Da bi to naredili, sistemu anti-Rh protiteles + Rh-pozitivnih eritrocitov dodamo antiglobulinski serum (protitelesa proti človeškim imunoglobulinom), kar povzroči aglutinacijo eritrocitov (slika 13.4). Z uporabo Coombsove reakcije se diagnosticirajo patološka stanja, povezana z intravaskularno lizo eritrocitov imunskega izvora, na primer hemolitična bolezen novorojenčka: eritrociti Rh-pozitivnega ploda se združijo z nepopolnimi protitelesi proti Rh faktorju, ki kroži v krvi, ki prečka posteljica Rh-negativne matere.

Precipitacijske reakcije

reakcija padavin - RP (izlat. praeci-pito- oborina,) je tvorba in precipitacija kompleksa topnega molekularnega antigena s protitelesi v obliki motnosti, imenovane oborina. Nastane z mešanjem antigenov in protiteles v enakih količinah; presežek enega od njih zmanjša stopnjo tvorbe imunskega kompleksa.

Reakcije obarjanja vstavite v epruvete (reakcija obarjanja obroča), v gelih, hranilnih medijih itd. Široko se uporabljajo različice reakcije obarjanja v poltekočem gelu agarja ali agaroze: dvojna imunodifuzija po Ouchterlonyju. radialna imunodifuzija, imunoelektroforeza in itd.

Obročna precipitacijska reakcija . Reakcijo izvajamo v ozkih obarjevalnih epruvetah z imunskim serumom, na katerega je nanesen topni antigen. Z optimalnim razmerjem antigena in protiteles se na meji teh dveh raztopin oblikuje neprozoren precipitatni obroč (slika 13.5). Presežek antigena ne vpliva na rezultat reakcije obarjanja obroča zaradi postopne difuzije reagentov do tekoče meje. Če kuhamo in filtriramo vodni izvlečki organov ali tkiv, potem takšno reakcijo imenujemo reakcija termoprecipitacije-iii (Ascolijeva reakcija, z antraksom /

Oukhterunijeva dvojna imunodifuzijska reakcija . Za postavitev reakcije stopljeni agar gel vlijemo v tankem sloju na stekleno ploščo in ko se strdi, vanj izrežemo luknjice velikosti 2-3 mm. Antigeni in imunski serumi so nameščeni ločeno v te vdolbinice, ki difundirajo drug proti drugemu. Na stičnem mestu v enakih razmerjih tvorijo oborino v obliki belega traku. V večkomponentnih sistemih se med vdolbinicami z različnimi antigeni in serumskimi protitelesi pojavi več linij oborine; pri enakih antigenih se precipitatne črte združijo; pri neenakih se sekajo (slika 13.6).

Radialna imunodifuzijska reakcija . Imunski serum s staljenim agar gelom enakomerno vlijemo na kozarec. Po strjevanju v gelu naredimo vdolbinice, v katere damo antigen v različnih razredčinah. Antigen, ki difundira v gel, tvori obročaste precipitacijske cone okoli vdolbinic s protitelesi (slika 13.7). Premer precipitacijskega obroča je sorazmeren s koncentracijo antigena. Reakcija se uporablja za določanje ravni imunoglobulinov različnih razredov v krvi, komponent sistema komplementa itd.

Imunoelektroforeza- kombinacija metode elektroforeze in imunoprecipitacije: zmes antigenov vnesemo v jamice gela in jih v gelu ločimo z elektroforezo. Nato vzporedno s conami elektroforeze v utor vnesemo imunski serum, katerega protitelesa, ki difundirajo v gel, nastanejo na stičišču z antigenom precipitacijske linije.

reakcija flokulacije(po Ramonu) (iz lat. kosmiči- volneni kosmiči) - pojav opalescence ali flokulentne mase (imunoprecipitacija) v epruveti med reakcijo toksin-antitoksin ali anatoksin-antitoksin. Uporablja se za določanje aktivnosti antitoksičnega seruma ali toksoida.

Imunska elektronska mikroskopija- elektronsko mikroskopiranje mikrobov, pogosteje virusov, tretiranih z ustreznimi protitelesi. Virusi, tretirani z imunskim serumom, tvorijo imunske agregate (mikroprecipitate). Okoli virionov se oblikuje "venček" protiteles, v nasprotju s fosfovolframovo kislino ali drugimi elektronsko optično gostimi pripravki.

Reakcije, ki vključujejo komplement

Reakcije, ki vključujejo komplementki temelji na aktivaciji komplementa s kompleksom antigen-protitelo (reakcija fiksacije komplementa, radialna hemoliza itd.).

Reakcija fiksacije komplementa (RSK) je v tem, da antigeni in protitelesa, ko si medsebojno ustrezajo, tvorijo imunski kompleks, na katerega preko Fc -fragment protiteles se pridruži komplementu (C), tj. do vezave komplementa pride s kompleksom antigen-protitelo. Če kompleks antigen-protitelo ne nastane, ostane komplement prost (slika 13.8). RSK poteka v dveh fazah: 1. faza - inkubacija mešanice, ki vsebuje tri komponente antigen + protitelo + komplement; 2. faza (indikator) - odkrivanje prostega komplementa v mešanici z dodajanjem hemolitičnega sistema, sestavljenega iz ovčjih eritrocitov in hemolitičnega seruma, ki vsebuje protitelesa proti njim. V 1. fazi reakcije med tvorbo kompleksa antigen-protitelo pride do vezave komplementa, nato pa v 2. fazi ne bo prišlo do hemolize eritrocitov, senzibiliziranih s protitelesi; reakcija je pozitivna. Če se antigen in protitelo ne ujemata (v testnem vzorcu ni antigena ali protitelesa), ostane komplement prost in se v 2. fazi pridruži kompleksu eritrocit-antieritrocitno protitelo, kar povzroči hemolizo; reakcija je negativna.

RSK se uporablja za diagnosticiranje številnih nalezljivih bolezni, zlasti sifilisa (Wassermanova reakcija).

Reakcija radialne hemolize (RRH ) damo v jamice agar gela, ki vsebuje ovčje eritrocite in komplement. Po dodajanju hemolitičnega seruma (protitelesa proti ovnovim eritrocitom) v vdolbinice gela nastane okoli njih območje hemolize (kot posledica radialne difuzije protiteles). Tako je mogoče določiti aktivnost komplementa in hemolitičnega seruma ter protiteles v krvnem serumu bolnikov z gripo, rdečkami, klopni encefalitis. Da bi to naredili, se ustrezni antigeni virusa adsorbirajo na eritrocitih, pacientov krvni serum pa se doda v jamice gela, ki vsebuje te eritrocite. Protivirusna protitelesa medsebojno delujejo z virusnimi antigeni, adsorbiranimi na eritrocitih po tem

Komponente komplementa se vežejo na ta kompleks in povzročijo hemolizo.

Imunska adhezijska reakcija (RIP ) temelji na aktivaciji sistema komplementa s korpuskularnimi antigeni (bakterije, virusi), obdelanimi z imunskim serumom. Posledično nastane aktivirana tretja komponenta komplementa (C3b), ki se kot del imunskega kompleksa veže na korpuskularni antigen. Na eritrocitih, trombocitih, makrofagih so receptorji za C3b, zaradi česar se te celice, ko se pomešajo z imunskimi kompleksi, ki nosijo C3b, združijo in aglutinirajo.

Reakcija nevtralizacije

Protitelesa v imunskem serumu so sposobna nevtralizirati škodljiv učinek mikrobov ali njihovih toksinov na občutljive celice in tkiva, kar je povezano z blokado mikrobnih antigenov s protitelesi, tj. nevtralizacija. Reakcija nevtralizacije(RN) se izvede z vnosom mešanice antigen-protitelo v živali ali v občutljive testne predmete (celična kultura, zarodki). V odsotnosti škodljivega učinka mikroorganizmov ali njihovih antigenov, toksinov na živalih in testnih objektih govorijo o nevtralizirajočem učinku imunskega seruma in s tem o specifičnosti interakcije kompleksa antigen-protitelo (slika 13.9).

Imunofluorescenčna reakcija - RIF (Koonsova metoda)

Obstajajo tri glavne različice metode: neposredna, posredna (slika 13.10), s komplementom. Koonsova reakcija je hitra diagnostična metoda za odkrivanje mikrobnih antigenov ali odkrivanje protiteles.

Neposredna metoda RIF temelji na dejstvu, da lahko tkivni antigeni ali mikrobi, obdelani z imunskimi serumi s protitelesi, označenimi s fluorokromi, svetijo v UV žarkih fluorescentnega mikroskopa.

Bakterije v brisu, obdelanem s takšnim luminiscenčnim serumom, svetijo po obodu celice v obliki zelene obrobe.

Posredna metoda RIF je identificirati kompleks antigen-protitelo z uporabo seruma antiglobulina (protitelesa), označenega s fluorokromom. Da bi to naredili, brise iz suspenzije mikrobov obdelamo s protitelesi protimikrobnega kunčjega diagnostičnega seruma. Nato protitelesa, ki niso vezana na mikrobne antigene, speremo, protitelesa, ki ostanejo na mikrobih, pa odkrijemo z obdelavo brisa z antiglobulinskim (anti-kunčjim) serumom, označenim s fluorokromi. Posledično nastane kompleks mikroba + protimikrobna kunčja protitelesa + antikunčja protitelesa, označena s fluorokromom. Ta kompleks opazujemo s fluorescenčnim mikroskopom, kot pri direktni metodi.

Metoda ELISA ali analiza (ELISA)

ELISA -odkrivanje antigenov z uporabo ustreznih protiteles, konjugiranih z označenim encimom (hrenova peroksidaza, beta-galaktozidaza oz. alkalna fosfataza). Potem ko je bil antigen kombiniran z encimsko označenimi imunskimi serumi, se zmesi doda substrat/kromogen. Substrat razcepi encim, barva reakcijskega produkta pa se spremeni – intenzivnost barve je premosorazmerna s številom vezanih molekul antigena in protiteles.

ELISA v trdni fazi - najpogostejša različica imunološkega testa, ko je ena od komponent imunskega odziva (antigen ali protitelesa) adsorbirana na trdnem nosilcu, na primer v vdolbinicah polistirenskih plošč.

Pri določanju protiteles se v vdolbinice plošč z adsorbiranim antigenom zaporedno dodaja bolnikov krvni serum, antiglobulinski serum, označen z encimom, in substrat (kromogen) za encim.

Vsakič po dodatku naslednje komponente se nevezani reagenti odstranijo iz vdolbinic s temeljitim izpiranjem. pri pozitiven rezultat spremeni se barva raztopine kromogena. Trdnofazni nosilec lahko senzibiliziramo ne le z antigenom, ampak tudi s protitelesi. Nato v vdolbinice z adsorbiranimi protitelesi vnesemo želeni antigen, dodamo imunski serum proti z encimom označenim antigenom in nato še substrat za encim.

Konkurenčna ELISA . tarčni antigen in z encimom označeni antigen tekmujeta med seboj za vezavo omejene količine protiteles v imunskem serumu. Drugi test so protitelesa, ki jih iščete

in označena protitelesa tekmujejo med seboj za antigene.

Radioimunološka metoda ali analiza (RIA)

Zelo občutljiva metoda, ki temelji na reakciji antigen-protitelo z uporabo antigenov ali protiteles, označenih z radionuklidom (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr itd.). Po njunem medsebojnem delovanju se nastali radioaktivni imunski kompleks loči in določi njegova radioaktivnost v ustreznem števcu (beta ali gama sevanje):

jakost sevanja je premosorazmerna s številom vezanih molekul antigena in protiteles.

pri trdnofazna različica RIA ena od reakcijskih komponent (antigen ali protitelesa) je adsorbirana na trdnem nosilcu, na primer v vdolbinicah polistirenskih mikromrež. Druga različica metode je konkurenčni RIA. tarčni antigen in z radionuklidi označeni antigen tekmujeta med seboj za vezavo omejene količine protiteles v imunskem serumu. Ta možnost se uporablja za določanje količine antigena v testnem materialu.

RIA se uporablja za odkrivanje mikrobnih antigenov, določanje hormonov, encimov, zdravilne snovi in imunoglobulini, pa tudi druge snovi, ki jih preskusni material vsebuje v manjših koncentracijah - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Metoda predstavlja določeno nevarnost za okolje.

Imunobloting

Imunobloting (IB)- zelo občutljiva metoda, ki temelji na kombinaciji elektroforeze in ELISA ali RIA.

Antigen izoliramo z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu, nato ga prenesemo (blotiranje - iz angl. madež, spot) iz gela na aktiviran papir ali nitrocelulozno membrano in razvit z ELISA. Podjetja proizvajajo takšne trakove z "blot"

antigeni. Na te trakove se nanese bolnikov serum. Nato po inkubaciji bolnika speremo z nevezanih protiteles bolnika in apliciramo serum proti humanim imunoglobulinom, označen z encimom. Kompleks antigen + protitelo bolnika + protitelo proti humanemu Ig, ki nastane na traku, se odkrije z dodajanjem substrata / kromogena, ki spremeni barvo pod delovanjem encima (slika 13.12).

IB se uporablja kot diagnostična metoda za okužbo s HIV itd.

reakcija padavin temelji na nastanku precipitata – obarjanju imunskih kompleksov antigen-protitelo. V raztopinah se obarjajo, v gelih pa se nalagajo v obliki trakov. Za določanje koncentracije protiteles v testnem materialu se uporabljajo prečiščeni antigeni, obstaja pa več načinov za izvedbo precipitacijske reakcije.

Obarjanje v raztopini

Reakcija obarjanja v raztopinah ima posebnost: količina oborine je odvisna od količine reagenta (protiteles). Če je količina protiteles manjša od količine antigena, potem povečanje količine slednjega povzroči večjo tvorbo oborine. Največje število nastane oborina z relativno enako količino antigenov in protiteles. Če je antigen presežek v primerjavi s protitelesi, se s povečanjem njegove koncentracije količina oborine zmanjša.

imunodifuzija

Najpogostejša metoda izvajanja precipitacijskih reakcij je povezana z imunodifuzijo - sposobnostjo protiteles in antigenov, da prodrejo v gel.
Za enostavno radialno imunodifuzijo se uporablja gel, ki vsebuje protitelesa. V tanko plast gela naredimo okrogle reze in vanje namestimo testni material z antigeni, ki prodrejo globoko v gel, interagirajo s protitelesi in tvorijo precipitatne obroče okoli vdolbinic. Na ta način se določi vsebnost imunoglobulinov v krvi.
Veliko reagentov za biokemijske analize izdano fiksno na tablicah. Vsaka celica tablete vsebuje strogo odmerjeno količino reagenta, tako da lahko izvedete več analiz hkrati z visoko natančnostjo rezultatov.
Z dvojno radialno imunodifuzijo izrežemo dve okrogli luknjici v tankem sloju gela na določeni medsebojni razdalji. V enega se vstavi reagent, v drugega pa testni material. Protitelesa in antigeni prodirajo skozi gel drug proti drugemu. Na mestu njihove interakcije nastane oborina.
Za določitev koncentracije antigena v testnem materialu se izmeri razdalja od vdolbinice z njim do črte oborine.

V nasprotju z reakcijo aglutinacije so antigen za reakcijo obarjanja topne spojine, katerih velikost delcev se približuje velikosti molekul. To so lahko beljakovine, kompleksi beljakovin z ogljikovimi hidrati in lipidi, bakterijski izvlečki, razni disati ali filtrati mikrobnih brozg. Protitelesa, ki sodelujejo pri reakciji obarjanja, se imenujejo precipitini. Nastali fin kompleks antigen-protitelo se odkrije z določenimi metodami določanja stopnje precipitacijske reakcije.

Reakcijo obarjanja obroča je prvi predlagal Ascoli. Uporablja se pri diagnozi antraksa, kuge, tularemije, meningitisa. Metoda je preprosta in dostopna.

Specifični imunski precipitacijski serum se vlije v ozke precipitacijske epruvete in nanj zelo previdno nanese antigen. Kot antigen se na primer pri diagnosticiranju antraksa vzamejo kosi kože, volne, kože poginulih živali itd., ki jih prekuhamo, tekočino precedimo in uporabimo kot antigen. Pojav obroča na meji dveh tekočin - oborina kaže na prisotnost ustreznega antigena.

Reakcija obarjanja z agar gelom ali metoda difuzijskega obarjanja omogoča podrobno preučevanje sestave kompleksnih vodotopnih antigenskih mešanic. Za postavitev reakcije uporabimo gel (poltekoči ali gostejši agar). Vsaka komponenta, ki sestavlja antigen, difundira proti ustreznemu protitelesu z drugačno hitrostjo. Zato se nahajajo kompleksi različnih antigenov in ustreznih protiteles različna področja gelu, kjer nastanejo padavinske črte. Vsaka od vrstic ustreza samo enemu kompleksu antigen-protitelo. Reakcija obarjanja je običajno nastavljena pri sobni temperaturi.

Metoda imunoelektroforeze se pogosto uporablja pri Zadnja leta pri preučevanju antigenske strukture mikrobov. Kompleks antigenov namestimo v vdolbinico, ki se nahaja v središču agar gela, vlitega na ploščo. Nato se skozi agar gel spusti električni tok, zaradi česar se različni antigeni, vključeni v kompleks, premaknejo v polje. električni tok odvisno od njihove elektroforetske mobilnosti. Po končani elektroforezi se v jarek, ki se nahaja ob robu plošče, vnese specifičen imunski serum in postavi v vlažno komoro. Na mestih, kjer se tvori kompleks antigen-protitelo, se pojavijo precipitacijske črte.

Precipitacijska reakcija je zelo občutljiva metoda in se uporablja pri preučevanju različnih proteinskih in polisaharidnih antigenov v forenzični medicini. zdravniška praksa za določitev vrste madežev krvi, semena, seruma, ki so na voljo na perilu in različnih predmetih. To reakcijo lahko uporabimo tudi za identifikacijo različnih nečistoč v mleku, ribah in mesnih izdelkih, za določitev narave beljakovin, ki sestavljajo barve starodavnih mojstrov slikarstva.

Pri precipitacijski reakciji se v prisotnosti elektrolitov izloči specifičen imunski kompleks, ki ga sestavljata topni antigen (lizat, ekstrakt, hapten) in specifično protitelo.

Moten obroč ali oborina, ki nastane kot posledica te reakcije, se imenuje oborina. Ta reakcija se od reakcije aglutinacije razlikuje predvsem po velikosti delcev antigena.

Reakcija precipitacije se običajno uporablja za določanje antigena pri diagnozi številnih okužb (antraks, meningitis itd.); v sodni medicini - za določitev vrste krvi, sperme itd.; v sanitarnih in higienskih študijah - pri ugotavljanju ponarejanja izdelkov; z njeno pomočjo ugotavljajo filogenetsko razmerje živali in rastlin. Za reakcijo potrebujete:

1. Protitelesa (precipitini) - imunski serum z visokim titrom protiteles (ne nižji od 1:100.000). Titer precipitirajočega seruma je določen z najvišjo razredčino antigena, s katerim reagira. Serum se običajno uporablja nerazredčen ali razredčen 1:5 - 1:10.

2. Antigen - raztopljene snovi beljakovinske ali lipoidne polisaharidne narave (popolni antigeni in hapteni).

3. Izotonična raztopina.

Glavni metodi za izvedbo reakcije obarjanja sta: reakcija obarjanja obroča in reakcija obarjanja v agarju (gelu).

Pozor! Vse komponente, ki sodelujejo pri reakciji obarjanja, morajo biti popolnoma prozorne.

Obročna precipitacijska reakcija. V precipitacijsko epruveto dodamo s Pasteurjevo pipeto 0,2-0,3 ml (5-6 kapljic) seruma (serum ne sme pasti na stene epruvete). Antigen previdno nanesemo na serum v enakem volumnu in ga polivamo s tanko Pasteurjevo pipeto po steni epruvete. Epruveto držimo v nagnjenem položaju. S pravilnim nanosom plasti je treba doseči jasno mejo med serumom in antigenom. Previdno, da ne premešate tekočine, postavite epruveto v stojalo. S pozitivnim rezultatom reakcije se na meji antigena in protitelesa oblikuje moten "obroč" - oborina (glej sliko 48).

Reakciji sledijo številne kontrole (Tabela 18). Zaporedje vnosa reakcijskih sestavin v epruveto je zelo pomembno. Nemogoče je nanesti serum na antigen (v kontroli - na izotonično raztopino), saj relativna gostotače je seruma več, bo potonil na dno epruvete in meja med tekočinama ne bo razkrita.

Tabela 18

Opomba. + prisotnost "obročka"; - pomanjkanje "prstana".

Rezultati se zabeležijo po 5-30 minutah, v nekaterih primerih po eni uri, kot vedno, začenši s kontrolami. "Obroč" v 2. epruveti označuje sposobnost imunskega seruma, da vstopi v specifično reakcijo z ustreznim antigenom. V 3.-5. epruvetah ne sme biti "obročev" - ni protiteles in antigenov, ki bi ustrezali drug drugemu. "Obroč" v 1. epruveti - pozitiven rezultat reakcije - pomeni, da testni antigen ustreza odvzetemu imunskemu serumu, odsotnost "obročka" ("obroč" samo v 2. epruveti) kaže na njihovo nedoslednost - negativna reakcija rezultat.

Reakcija obarjanja v agarju (gelu). Posebnost reakcije je, da se interakcija antigena in protitelesa pojavi v gostem mediju, to je v gelu. Nastala oborina daje moten trak v debelini medija. Odsotnost pasu kaže na neujemanje med reakcijskimi komponentami. Ta reakcija se pogosto uporablja v biomedicinskih raziskavah, zlasti pri preučevanju tvorbe toksinov pri povzročitelju davice.

testna vprašanja

1. Kakšna je glavna razlika med reakcijo aglutinacije in obarjanja?

2. Zakaj motnih sestavin ne moremo uporabiti pri reakciji obarjanja?

telovadba

1. Nastavite obročno reakcijo obarjanja in narišite rezultat.

2. Preučite naravo interakcije antigena s protitelesom pri reakciji obarjanja na agarju, rezultat narišite (skodelico dobite pri učitelju).

Reakcija lize (imunska citoliza)

Imunska liza je raztapljanje celic pod vplivom protiteles z obvezno udeležbo komplementa. Za reakcijo potrebujete:

1. Antigen – mikrobi, eritrociti ali druge celice.

2. Protitelo (lizin) – imunski serum, redkeje pacientov serum. Bakteriolitični serum vsebuje protitelesa, ki sodelujejo pri razgradnji bakterij; hemolitični - hemolizini, ki prispevajo k razpadu rdečih krvnih celic; za lizo spirohet so potrebni spirohetolizini, celice - itolizini itd.

3. Dopolnilo. Največ dopolnila v serumu morski prašički. Ta serum (mešanica več živali) se običajno uporablja kot dopolnilo. Sveže (nativno) dopolnilo je nestabilno in se zlahka uniči s segrevanjem, stresanjem, skladiščenjem, zato ga je mogoče uporabiti največ dva dni po prejemu. Da bi ohranili komplement, mu dodamo 2%. Borova kislina in 3% natrijevega sulfata. To dopolnilo lahko shranjujete pri 4 °C do dva tedna. Pogosteje se uporablja suho dopolnilo. Pred uporabo se raztopi v izotonični raztopini do prvotne prostornine (navedeno na etiketi).

4. Izotonična raztopina.

Reakcija hemolize(Tabela 19). Za reakcijo potrebujete:

1. Antigen - 3% suspenzija opranih ovčjih eritrocitov v razmerju 0,3 ml usedline eritrocitov in 9,7 ml izotonična raztopina.

2. Protitelesa - hemolitični serum (hemolizin) proti ovčjim eritrocitom; običajno pripravljeno v proizvodnji, liofilizirano in titer je naveden na etiketi.

Titer hemolizina je največja razredčitev seruma, pri kateri pride do popolne hemolize 3% suspenzije eritrocitov v prisotnosti komplementa. Za reakcijo hemolize vzamemo hemolizin v trojnem titru, to je, da ga razredčimo 3-krat manj kot pred titrom. Na primer, če je serumski titer 1:1200, se serum razredči v razmerju 1:400 (0,1 ml seruma* in 39,9 ml izotonične fiziološke raztopine). Potreben je presežek hemolizina, saj ga lahko delno adsorbirajo druge komponente reakcije.

* (Ne smete vzeti manj kot 0,1 ml seruma - trpi točnost meritev.)

3. Komplement razredčimo 1:10 (0,2 ml komplementa in 1,8 ml izotonične fiziološke raztopine).

4. Izotonična raztopina.

Tabela 19. Shema reakcije hemolize

Računovodstvo rezultatov. S pravilno nastavljeno reakcijo v 1. epruveti bo prišlo do hemolize - njena vsebina bo postala prozorna. V kontrolah ostaja tekočina motna: v 2. epruveti manjka komplement za nastanek hemolize, v 3. epruveti ni hemolizina, v 4. epruveti ni niti hemolizina niti komplementa, v 5. antigen se ne ujema s protitelesom,

Po potrebi titriramo hemolitični serum po naslednji shemi (tabela 20).

Pred titracijo pripravimo začetno razredčino seruma 1:100 (0,1 ml seruma in 9,9 ml izotonične fiziološke raztopine), iz katere naredimo potrebne razredčine, npr.

Od teh razredčin dodamo 0,5 ml seruma v epruvete za titracijsko izkušnjo, kot je prikazano v tabeli. dvajset.

Tabela 20. Titracijska shema za hemolitični serum (hemolizin)

V primeru, podanem v tabeli. 20 je titer hemolitičnega seruma 1:1200.

Pri uporabi svežega hemolitičnega seruma ga moramo inaktivirati, da uničimo njegov komplement. Da bi to naredili, ga segrevamo 30 minut pri 56 ° C v vodni kopeli ali v inaktivatorju s termostatom. Slednja metoda je boljša: odpravlja možnost pregrevanja seruma, to je njegove denaturacije. Denaturirani serumi niso primerni za testiranje.

reakcija bakteriolize. Pri tej reakciji se bakterije dopolnijo v prisotnosti ustreznega (homolognega) seruma. Reakcijska shema je v osnovi podobna reakcijski shemi hemolize. Razlika je v tem, da po dvourni inkubaciji vse epruvete zasejemo na petrijevke z gojiščem, ki je ugodno za mikroorganizem, vzet v poskus, da ugotovimo, ali je liziran. Ob pravilno nastavljenih izkušnjah v posevkih iz 2.-5.epruvet (kontrole) bi morala biti obilna rast. Pomanjkanje rasti ali šibka rast v kulturi iz 1. epruvete (poskus) kaže na smrt mikrobov, to je, da so homologni protitelesu.

Pozor! Reakcijo bakteriolize je treba izvesti v aseptičnih pogojih.

testna vprašanja

1. Kaj se bo zgodilo z eritrociti, če namesto izotonične raztopine natrijevega klorida uporabimo destilirano vodo? Kaj je v ozadju tega pojava?

2. Do kakšne reakcije pride, ko eritrociti medsebojno delujejo s homolognim imunskim serumom v odsotnosti komplementa?

telovadba

Nastavite reakcijo hemolize. Zapišite in narišite rezultat.

Pri precipitacijski reakciji se v prisotnosti elektrolitov izloči specifičen imunski kompleks, ki ga sestavljata topni antigen (lizat, ekstrakt, hapten) in specifično protitelo.

Motni obroč ali oborina, ki nastane kot posledica te reakcije, se imenuje oborina. Ta reakcija se od reakcije aglutinacije razlikuje predvsem po velikosti delcev antigena.

2. Antigen - raztopljene snovi beljakovinske ali lipoidne polisaharidne narave (popolni antigeni in hapteni).

3. Izotonična raztopina.

Glavni metodi za izvedbo reakcije obarjanja sta: reakcija obarjanja obroča in reakcija obarjanja v agarju (gelu).

Pozor! Vse komponente, ki sodelujejo pri reakciji obarjanja, morajo biti popolnoma prozorne.

Obročna precipitacijska reakcija. V precipitacijsko epruveto dodamo s Pasteurjevo pipeto 0,2 - 0,3 ml (5-6 kapljic) seruma (serum ne sme pasti na stene epruvete). Antigen previdno nanesemo na serum v enakem volumnu in ga polivamo s tanko Pasteurjevo pipeto po steni epruvete. Epruveto držimo v nagnjenem položaju. S pravilnim nanosom plasti je treba doseči jasno mejo med serumom in antigenom. Previdno, da ne premešate tekočine, postavite epruveto v stojalo. S pozitivnim rezultatom reakcije se na meji antigena in protitelesa tvori moten "obroč" - oborina.

Reakcija obarjanja v agarju(gel). Posebnost reakcije je, da pride do interakcije antigena in protitelesa v gostem mediju, tj. gel. Nastala oborina daje moten trak v debelini medija. Odsotnost pasu kaže na neujemanje med reakcijskimi komponentami. Ta reakcija se pogosto uporablja v biomedicinskih raziskavah, zlasti pri preučevanju tvorbe toksinov pri povzročitelju davice.

Reakcija lize (imunska citoliza)

imunska liza- to je raztapljanje celic pod vplivom protiteles z obvezno udeležbo komplementa. Za reakcijo potrebujete:

1. Antigen mikrobi, eritrociti ali druge celice.

2. Protitelesa(lysine) - imunski serum, redkeje pacientov serum. Bakteriolitični serum vsebuje protitelesa, ki sodelujejo pri razgradnji bakterij; hemolitični - hemolizini, ki prispevajo k razpadu rdečih krvnih celic; za lizo spirohet so potrebni spirohetolizini, celice - itolizini itd.

3. Dopolnjujejo. Največ komplementa v serumu morskih prašičkov. Ta serum (mešanica več živali) se običajno uporablja kot dopolnilo.

4. Izotonična raztopina.