celične kulture

Živali

Indikacija virusov z naslednjimi pojavi

zaostanek v razvoju,

smrt, sprememba

lupine zarodka, RGA

CPP, tvorba plaka, RIF, RGads, motnje

bolezen, smrt,

histološke spremembe

v tkivih, vključki

Titracija izoliranega virusa; izbira delovnega odmerka.

Titer virusa- največja razredčitev materiala, ki vsebuje virus, pri katerem je še opazen pričakovani učinek (CPE, RHA, smrt živali).

Identifikacija izoliranega virusa pri nevtralizacijskih reakcijah, RTGads, RSK, supresiji nastajanja plakov itd. z diagnostičnimi serumi. Vrsta (vrsta) virusa določen z nevtralizacijo specifičnega učinka virusa z ustreznim imunskim serumom.

Opomba: titracija in identifikacija virusa se izvedeta z uporabo istega pojava.

Gojenje virusa

Tečajna naloga

"Metode klinične virologije"

Uvod

Laboratorijska diagnostika virusnih okužb se izvaja predvsem z uporabo elektronske mikroskopije, občutljivih celičnih kultur in imunoloških metod. Praviloma je za diagnozo izbrana ena metoda, odvisno od stopnje virusne okužbe. Tako so lahko na primer vsi trije pristopi uporabni pri diagnostiki noric, vendar je uspešna uporaba metod mikroskopije in celične kulture odvisna od sposobnosti odvzema zadovoljivih vzorcev v relativno zgodnji fazi bolezni.

V veliki meri uspeh virusna diagnostika odvisno od kakovosti dobljenih vzorcev. Zato bi moralo laboratorijsko osebje samo neposredno sodelovati pri zbiranju potrebnih vzorcev. Lastnosti vzorcev, kot tudi metode njihove dostave v laboratorij, opisujejo Lennett, Schmidt, Krist et al.

Večina reagentov in instrumentov, ki se uporabljajo v laboratorijski diagnostiki, je na voljo pri različnih podjetjih. V večini primerov isti reagent hkrati proizvaja več podjetij. Zaradi tega nismo navedli posameznih podjetij, razen če reagent dobavlja samo eno podjetje. V vseh drugih primerih se morate sklicevati na splošni seznam dobaviteljev, ki je naveden v tabeli. eno.

Naš cilj ni bil izčrpen opis vseh trenutno razpoložljivih metod za diagnosticiranje človeških virusnih okužb. Najprej smo opisali glavne metode. Ko pridobite izkušnje samostojno delo te osnovne metode je mogoče uporabiti za reševanje kompleksnejših problemov.

1. Elektronska mikroskopija

Za elektronsko mikroskopsko diagnostiko virusnih okužb lahko uporabimo tanke reze prizadetega tkiva. Najpogostejši material za elektronsko mikroskopijo je blato ali tekočina.

Tabela 1. Seznam podjetij, ki dobavljajo reagente in opremo

vezikule, ki so značilne za nekatere bolezni, npr norice. Pri analizi takšnega materiala lahko viruse odkrijemo z negativnim barvanjem, ki vodi do razmejitve komponent viriona z elektronsko gosto snovjo. Metoda je učinkovita pri visokih koncentracijah virusa v testnih vzorcih, na primer v blatu ali vezikularni tekočini. V primerih, ko je vsebnost virusnih delcev v vzorcih nizka, lahko verjetnost odkrivanja virusa povečamo s koncentriranjem virusa z ultracentrifugiranjem ali z agregacijo s specifičnimi protitelesi. Slednja metoda je primerna tudi za prepoznavanje virusov. Tukaj opisujemo elektronsko mikroskopsko metodo za diagnosticiranje rotavirusna okužba in metoda imunoelektronske mikroskopije na primeru dokazovanja specifičnih protiteles proti parvovirusom. Metode elektronske mikroskopije je podrobneje opisal Field.

2.1 Direktna elektronska mikroskopija blata

1. Konec Pasteurjeve pipete potopimo v blato in zberemo dovolj materiala, da dobimo 1 cm razmaz.

2. Resuspendirajte razmaz blata v negativnem elektronskem mikroskopu, dokler ne dobite prosojne suspenzije. Negativni kontrast je 2% raztopina fosfovolframove kisline v destilirani vodi.

3. Za pridobitev elektronsko mikroskopskega preparata se kapljica suspenzije namesti na elektronsko mikroskopsko mrežo, prevlečeno s filmom iz ogljika-formvarja. Med tem postopkom mrežico držimo s fino pinceto.

4. Zdravilo pustimo v zraku 30 sekund.

5. Odvečno tekočino odstranimo tako, da se s filtrirnim papirjem dotaknemo roba kozarca.

6. Drogo sušimo na zraku.

7. Če je potrebno, se živi virus inaktivira z obsevanjem obeh strani mreže z ultravijolično svetlobo z jakostjo 440.000 μW-s/cm 2 . Uporablja kratke valove ultravijolična svetilka s filtrom. Svetilka mora biti na razdalji 15 cm od mreže; čas obsevanja vsake strani - 5 min.

8. Virione rotavirusov je mogoče označiti pri prenosu elektronski mikroskop s povišanjem s 30.000 na 50.000.

2.2 Imunoelektronska mikroskopija

Spodaj opisana metoda imunoelektronske mikroskopije je le ena od mnogih tovrstnih imunoloških metod. Za preučevanje protiteles, specifičnih za virus, se poleg tega uporablja metoda, ki vključuje vezavo na mikroskopsko mrežo proteina A. Delovna koncentracija protivirusnih protiteles je določena s poskusi in napakami v območju od 1/10 do 1/1000. Koncentracija, ki smo jo navedli, se praviloma uporablja pri rutinskem delu. Za optimalne rezultate interakcije protiteles z virusom titriramo serum, ki vsebuje parvovirus, na enak način.

1. 10 µl antiseruma proti humanemu parvovirusu, 100-krat razredčenega s PBS. Raztopino segrejemo v vodni kopeli na 56 °C.

2. Stopite 10 ml 2 % agaroze v PBS na običajen način in ohladite na 56 °C v vodni kopeli.

3. Pri 56 °C zmešajte 1 ml razredčenega antiseruma z 1 ml 2 % agaroze.

4. Prenesite 200 µl nastale mešanice v dve vdolbinici mikrotitrske plošče s 96 vdolbinicami.

5. Pustite, da se agaroza strdi pri sobni temperaturi. Ploščo lahko shranite pri 4 °C več tednov, če jo zalepite z lepilnim trakom.

6. V jamico, ki vsebuje mešanico agaroze in antiseruma, dodajte 10 µl seruma, ki vsebuje parvovirus.

7. Mrežo za elektronsko mikroskopijo s predhodno pripravljeno prevleko iz ogljika-formvarja položimo z manj svetlečo stranjo na kapljico seruma.

8. Mrežo hranimo 2 uri pri 37 °C v vlažni komori.

9. S tanko pinceto mrežico vzamemo ven in na površino mrežice, ki je bila v stiku s serumom, nanesemo kapljico 2% fosfovolframove kisline.

10. Po 30 s odvečno barvo speremo, preparat posušimo in virus inaktiviramo.

Zbrane virusne delce pregledamo pod transmisijskim elektronskim mikroskopom pri povečavi od 30.000 do 50.000.

3. Identifikacija virusnih antigenov

Viruse v tkivih ali tkivnih tekočinah je mogoče identificirati z virusno specifičnimi beljakovinami z uporabo reakcije antigen-protitelo. Produkt reakcije antigen-protitelo testiramo za oznako, ki jo vnesemo neposredno v protivirusna protitelesa ali v protitelesa, usmerjena proti virusno specifičnim protitelesom. Protitelesa lahko označimo s fluoresceinom, radioaktivnim jodom ali encimom, ki cepi substrat s spremembo barve. Poleg tega se za identifikacijo virusa uporablja reakcija hemaglutinacije. V vsakdanji praksi se opisane metode uporabljajo predvsem za dokazovanje antigenov virusa hepatitisa B v krvi in ​​za iskanje antigenov različnih virusov, ki povzročajo različna obolenja dihal.

Trenutno veliko podjetij proizvaja eritrocitne, radioaktivne in encimske diagnostike, vključno s tistimi za odkrivanje virusa hepatitisa B. Ne zdi se nam primerno opisovati metod dela s temi diagnostiki: povsem dovolj je, da sledite priloženim navodilom. V nadaljevanju se bomo osredotočili na imunofluorescentno metodo za identifikacijo respiratornega sincicijskega virusa v nazofaringealnem izločku.

3.1 Identifikacija respiratornega sincicijskega virusa v nazofaringealnih izločkih z imunofluorescenco

Metodo za pridobivanje pripravkov iz nazofaringealnih izločkov sta opisala Gardner in McQuilin. V laboratorijskih pogojih se ta operacija izvaja v dveh fazah. Najprej pripravimo bris iz nazofaringealne sluzi na predmetnem stekelcu. Dobljene brise lahko v fiksnem stanju hranimo več mesecev pri -20°C. V drugi fazi se brisi obarvajo za odkrivanje antigena respiratornega sincicijskega virusa. V ta namen se uporablja metoda indirektne imunofluorescence.

3.1.1 Priprava nazofaringealnih izločkov

1. Sluz iz posebnih klešč speremo z 1-2 ml PBS in prenesemo v epruveto za centrifugo.

2. Centrifugirajte 10 minut pri 1500 obratih na minuto v namizni centrifugi.

3. Supernatant se zavrže.

4. Celično peleto nežno resuspendiramo v 2-3 ml PBS, dokler ne dobimo homogene suspenzije. Če želite to narediti, uporabite Pasteurjevo pipeto s širokim grlom.

5. Nastalo suspenzijo prenesemo v epruveto.

6. V suspenzijo dodajte še 2-4 ml PBS in premešajte s pipetiranjem. Odstranijo se veliki strdki sluzi.

7. Centrifugirajte 10 minut pri 1500 obratih na minuto v namizni centrifugi.

8. Supernatant odcedimo, oborino resuspendiramo v tolikšni prostornini PBS, da se nastala suspenzija zlahka loči od sten epruvete.

9. Nastalo suspenzijo nanesemo na označeno stekelce.

10. Steklo sušimo na zraku.

Fiksiramo v acetonu 10 minut pri 4 °C.

12. Po fiksiranju se steklo ponovno posuši na zraku.

13. Dobljene preparate takoj obarvamo ali shranimo pri -20 °C.

3.1.2. Tehnika barvanja

1. Natisnite in razredčite komercialni antiserum proti RSV v PBS na priporočeno delovno koncentracijo.

2. Na pripravljen preparat s Pasteurjevo pipeto kanemo eno kapljico antiseruma.

3. Zdravilo se postavi v vlažno komoro.

4. Pripravek inkubiramo 30 minut pri 37 °C.

5. Vzorce previdno speremo s PBS, da odstranimo odvečna protitelesa v posebni posodi.

6. Vzorce speremo v treh izmenah PBS po 10 minut.

7. Posušite vzorce, odstranite presežek PBS s filtrirnim papirjem in posušite na zraku.

Virološke raziskovalne metode— metode za preučevanje biologije virusov in njihovo identifikacijo. V virologiji se široko uporabljajo metode molekularne biologije, s pomočjo katerih je bilo mogoče ugotoviti molekularno strukturo virusnih delcev, kako prodrejo v celico in značilnosti razmnoževanja virusov, primarno strukturo virusnih nukleinskih kislin. in beljakovine. Razvijajo se metode za določanje zaporedja sestavnih elementov virusnih nukleinskih kislin in beljakovinskih aminokislin. Funkcije nukleinskih kislin in proteinov, ki jih kodirajo, postane mogoče povezati z nukleotidnim zaporedjem in ugotoviti vzroke znotrajceličnih procesov, ki igrajo pomembno vlogo v patogenezi virusne okužbe.

Virološke raziskovalne metode temeljijo tudi na imunoloških procesih (interakcija antigena s protitelesi), bioloških lastnostih virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemolize, encimske aktivnosti), značilnostih interakcije virusa z gostiteljsko celico (narava citopatije). učinek, tvorba intracelularnih vključkov itd.).

Pri diagnostiki virusnih okužb, pri gojenju, izolaciji in identifikaciji virusov ter pri pripravi pripravkov cepiv se široko uporablja metoda tkivnih in celičnih kultur. Uporabljajo se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane in diploidne celične kulture. Primarne kulture dobimo z dispergiranjem tkiva s proteolitičnimi encimi (tripsin, kolagenaza). Vir celic so lahko tkiva in organi (pogosteje ledvice) človeških in živalskih zarodkov. Suspenzijo celic v hranilnem mediju namestimo v tako imenovane vzmetnice, stekleničke ali petrijevke, kjer se celice po pritrditvi na površino posode začnejo razmnoževati. Za virusno okužbo se običajno uporablja celični monosloj. Hranilno tekočino odlijemo, virusno suspenzijo vnesemo v določenih razredčitvah in po stiku s celicami dodamo svež hranilni medij, običajno brez seruma.

Celice iz večine primarnih kultur je mogoče subkultivirati in jih imenujemo sekundarne kulture. Z nadaljnjim prehodom celic nastane populacija fibroblastom podobnih celic, ki so sposobne hitrega razmnoževanja, večina pa ohrani prvotni nabor kromosomov. To so tako imenovane diploidne celice. Pri serijski kultivaciji celic dobimo stabilne kontinuirane celične kulture. Med prehodi se pojavijo hitro deleče se homogene celice s heteroploidnim nizom kromosomov. Stabilne celične linije so lahko enoslojne in suspenzijske. Enoslojne kulture rastejo v obliki neprekinjenega sloja na stekleni površini, suspenzijske kulture rastejo v obliki suspenzij v različnih posodah z mešali. Obstaja več kot 400 celičnih linij, pridobljenih iz 40 različne vrsteživali (vključno s primati, ptice, plazilci, dvoživke, ribe, žuželke) in ljudi.

Kosi se lahko gojijo v umetnih hranilnih medijih posameznih teles in tkiva (organske kulture). Tovrstne kulture ohranjajo tkivno strukturo, kar je še posebej pomembno za izolacijo in prehod virusov, ki se v nediferenciranih tkivnih kulturah ne razmnožujejo (na primer koronavirusi).

V okuženih celičnih kulturah lahko viruse odkrijemo s spremembo celične morfologije, citopatskim delovanjem, ki je lahko specifično, pojavom vključkov, z določanjem virusnih antigenov v celici in v tekočini kulture; določanje bioloških lastnosti virusnih potomcev v kulturni tekočini in titracija virusov v tkivni kulturi, piščančjih zarodkih ali občutljivih živalih; z dokazovanjem posameznih virusnih nukleinskih kislin v celicah z molekularno hibridizacijo ali grozdov nukleinskih kislin s citokemično metodo s fluorescenčno mikroskopijo.

Izolacija virusov je naporen in dolgotrajen proces. Izvaja se za določitev vrste ali različice virusa, ki kroži med prebivalstvom (na primer za identifikacijo serovaniant virusa gripe, divjega ali cepnega seva virusa otroške paralize itd.); v primerih, ko je treba izvesti nujne epidemiološke ukrepe; ko se pojavijo nove vrste ali različice virusov; če je potrebno, potrdite predhodno diagnozo; za označevanje virusov v predmetih okolju. Pri izolaciji virusov se upošteva možnost njihove obstojnosti v človeškem telesu, pa tudi pojav mešane okužbe, ki jo povzročata dva ali več virusov. Genetsko homogeno populacijo virusa, pridobljeno iz posameznega viriona, imenujemo virusni klon, postopek pridobivanja pa kloniranje.

Za izolacijo virusov, okužbe dovzetnih laboratorijskih živali, se uporabljajo piščančji zarodki, vendar se najpogosteje uporablja tkivna kultura. Prisotnost virusa se običajno določi s specifično celično degeneracijo (citopatski učinek), tvorbo simplastov in sincitijev, detekcijo intracelularnih vključkov, pa tudi specifični antigen, odkrit z imunofluorescenco, hemadsorpcijo, hemaglutinacijo (pri hemaglutinirajočih virusih) itd. . Te znake je mogoče odkriti šele po 2-3 prehodih virusa.

Za izolacijo številnih virusov, kot so virusi influence, se uporabljajo piščančji zarodki, za izolacijo nekaterih virusov Coxsackie in številnih arbovirusov pa novorojene miši. Identifikacija izoliranih virusov se izvaja z uporabo serološke reakcije in druge metode.

Pri delu z virusi se določi njihov titer. Titracija virusov se običajno izvaja v tkivni kulturi, pri čemer se določi največja razredčitev tekočine, ki vsebuje virus, pri kateri pride do degeneracije tkiva, nastanejo vključki in virusno specifični antigeni. Metodo s plaki lahko uporabimo za titriranje številnih virusov. Plaki ali negativne kolonije virusov so žarišča z virusom uničenih celic enoslojne tkivne kulture pod agarsko prevleko. Štetje kolonij omogoča kvantitativno analizo infekcijske aktivnosti virusov na podlagi tega, da en delec kužnega virusa tvori en plak. Plake prepoznamo z barvanjem kulture z vitalnimi barvili, običajno nevtralno rdečimi; plaki ne absorbirajo barvila in so zato vidni kot svetle lise na ozadju obarvanih živih celic. Titer virusa je izražen kot število enot, ki tvorijo plak, v 1 ml.

Čiščenje in koncentracija virusov se običajno izvaja z diferencialnim ultracentrifugiranjem, ki mu sledi centrifugiranje v koncentracijskih ali gostotnih gradientih. Za čiščenje virusov se uporabljajo imunološke metode, ionsko izmenjevalna kromatografija, imunosorbenti itd.

Laboratorijska diagnostika virusnih okužb vključuje odkrivanje patogena ali njegovih sestavin v kliničnem materialu; izolacija virusa iz tega materiala; serodiagnoza. Izbira laboratorijske diagnostične metode je v vsakem posameznem primeru odvisna od narave bolezni, obdobja bolezni in zmožnosti laboratorija. Sodobna diagnostika virusnih okužb temelji na ekspresnih metodah, ki vam omogočajo, da dobite odgovor nekaj ur po odvzemu kliničnega materiala zgodnji datumi po bolezni, Sem spadajo elektronska in imunska elektronska mikroskopija, pa tudi imunofluorescenca, metoda molekularne hibridizacije, odkrivanje protiteles razreda lgM itd.

Elektronska mikroskopija negativno obarvanih virusov omogoča diferenciacijo virusov in določanje njihove koncentracije. Uporaba elektronske mikroskopije pri diagnostiki virusnih okužb je omejena na tiste primere, kjer je koncentracija virusnih delcev v kliničnem materialu dovolj visoka (10 5 v 1). ml in višje). Pomanjkljivost metode je nezmožnost razlikovanja med virusi, ki pripadajo isti taksonomski skupini. To pomanjkljivost odpravimo z uporabo imunske elektronske mikroskopije. Metoda temelji na tvorbi imunskih kompleksov, ko virusnim delcem dodamo specifičen serum, hkrati pa pride do koncentracije virusnih delcev, kar omogoča njihovo identifikacijo. Metoda se uporablja tudi za odkrivanje protiteles. Za ekspresno diagnostiko se izvaja elektronsko mikroskopski pregled tkivnih izvlečkov, iztrebkov, tekočine iz veziklov in izločkov iz nazofarinksa. elektronska mikroskopija ki se pogosto uporablja za preučevanje morfogeneze virusa, se njegove zmogljivosti razširijo z uporabo označenih protiteles.

Metoda molekularne hibridizacije, ki temelji na detekciji virusno specifičnih nukleinskih kislin, omogoča detekcijo posameznih kopij genov in ji ni para glede občutljivosti. Reakcija temelji na hibridizaciji komplementarnih verig DNA ali RNA (sonde) in nastanku dvoverižnih struktur. Najcenejša sonda je klonirana rekombinantna DNK. Sonda je označena z radioaktivnimi prekurzorji (običajno radioaktivnim fosforjem). Obetavna je uporaba kolorimetričnih reakcij. Obstaja več variant molekularne hibridizacije: točkasta hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija itd.

Protitelesa razreda lgM se pojavijo prej kot protitelesa razreda G (3-5. dan bolezni) in izginejo po nekaj tednih, zato njihovo odkritje kaže na nedavno okužbo. Protitelesa razreda IgM odkrijemo z imunofluorescenco ali encimskim imunskim testom z uporabo anti-m antiserumov (anti-IgM težkih verig serumov).

Serološke metode v virologiji temeljijo na klasičnih imunoloških reakcijah (glej. Imunološke raziskovalne metode ): reakcije vezave komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka nevtralizacija, imunodifuzija, posredna hemaglutinacija, radialna hemoliza, imunofluorescenca, encimski imunski test, radioimunski test. Razvite so bile mikrometode za številne reakcije, njihove tehnike pa se nenehno izboljšujejo. Te metode se uporabljajo za identifikacijo virusov z uporabo niza znanih serumov in za serodiagnostiko, da se določi povečanje protiteles v drugem serumu v primerjavi s prvim (prvi serum se vzame v prvih dneh po bolezni, drugi - po 2-3 tedne). Diagnostična vrednost ni manjša od štirikratnega povečanja protiteles v drugem serumu. Če odkrivanje protiteles razreda lgM kaže na nedavno okužbo, potem protitelesa razreda lgC vztrajajo več let, včasih pa celo življenje.

Za identifikacijo posameznih antigenov virusov in protiteles proti njim v kompleksnih mešanicah brez predhodnega čiščenja beljakovin se uporablja imunobloting. Metoda združuje frakcioniranje proteinov z uporabo elektroforeze v poliakrilamidnem gelu in kasnejši imunski test proteinov z encimskim imunskim testom. Ločevanje beljakovin zmanjša potrebe po kemična čistost antigen in vam omogoča identifikacijo posameznih parov antigen-protitelo. Ta naloga je pomembna na primer pri serodiagnostiki okužbe s HIV, kjer so lažno pozitivne reakcije encimskega imunskega testa posledica prisotnosti protiteles proti celičnim antigenom, ki so prisotna kot posledica nezadostnega čiščenja virusnih proteinov. Identifikacija protiteles v serumih bolnikov proti notranjim in zunanjim virusnim antigenom omogoča določitev stadija bolezni, pri populacijski analizi pa variabilnost virusnih proteinov. Imunobloting pri okužbi s HIV se uporablja kot potrditveni test za odkrivanje posameznih virusnih antigenov in protiteles proti njim. Pri analizi populacij se metoda uporablja za ugotavljanje variabilnosti virusnih proteinov. Velika vrednost metode je v možnosti analize antigenov, sintetiziranih s tehnologijo rekombinantne DNK, ugotavljanju njihove velikosti in prisotnosti antigenskih determinant.

Virološke raziskave vključujejo dve glavni fazi: izolacijo virusov in njihovo identifikacijo. Material za virološke raziskave je lahko kri, druge biološke in patološke tekočine, biopsije organov in tkiv.

Virološko testiranje krvi se pogosto izvaja za diagnosticiranje okužb z arbovirusi. Virus stekline je mogoče najti v slini, mumps, herpes simpleks, Nazofaringealni brisi se uporabljajo za izolacijo povzročiteljev gripe in drugih akutnih respiratornih virusnih okužb, ošpic. V izpirkih iz konjunktive najdemo adenoviruse. Iz blata izoliramo različne entero-, adsno-, pso-, nora- in rotaviruse.

Za izolacijo virusov se uporabljajo celične kulture, piščančji zarodki in včasih laboratorijske živali.

Večina patogenih virusov je tkivno in tipsko specifičnih, na primer poliovirus se razmnožuje le v celicah primatov, zato se za izolacijo določenega virusa uporabi ustrezna tkivna kultura. Za izolacijo neznanega patogena je priporočljivo hkrati okužiti 3-4 celične kulture, ob predpostavki, da je ena od njih občutljiva. Prisotnost virusa v okuženih celičnih kulturah določa razvoj specifične celične degeneracije, tj. citopatogenega učinka, odkrivanja intracelularnih vključkov, kot tudi na podlagi odkrivanja specifičnega antigena z imunofluorescenco, pozitivnimi reakcijami hemadsorpcije in hemaglutinacije.

Ptičji zarodki so s svojimi slabo diferenciranimi tkivi primerni za gojenje številnih virusov. Klepetajte samo s piščančjimi zarodki. Pri razmnoževanju v zarodkih lahko virusi povzročijo njihovo smrt (arbovirusi), pojav sprememb v horionsko-alantoični membrani (virusi koz) ali v telesu zarodka, kopičenje mag glutinina v embrionalnih tekočinah v embrionalnih tekočinah (virusi gripe). , mumps) in komplement veznega virusnega antigena .

Identifikacija virusov se izvaja z imunološkimi metodami: reakcija inhibicije hemaglutinacije, fiksacija komplementa, nevtralizacija, obarjanje v gelu, imunofluorescenca.

Več o temi Virološka metoda:

1. Vrednotenje glavnih antropometričnih podatkov s parametrično metodo (sigma metoda)
2. Zdravljenje s pogojnim izumrtjem in metoda prisilnega usposabljanja
3. 2. Primerjalnopravna metoda - zasebnoznanstvena metoda pravne znanosti
4. SODOBNE METODE DIAGNOSTIKE IN IZBIRA METODE ZDRAVLJENJA SUBMUKOZNEGA MIOMA MATERNICE
5. 5.4. Koncept in struktura splošne raziskovalne metode kot metode praktične dejavnosti
6. Tema 8. MIKROBIOLOŠKE METODE ZA PREUČEVANJE VARIABILNOSTI IN MEHANIZMOV PRENOSA DEDNIH INFORMACIJ. UPORABA GENETSKIH METOD ZA STVARANJE NOVIH ZDRAVIL
7. Tema 15. PATOGENECNOST IN VIRULENCA MIKROORGANIZMOV. DEJAVNIKI VIRULENCE. NAČINI OKUŽBE LABORATORIJSKIH ŽIVALI. ANTIGENI, METODE NJIHOVEGA PRIDOBIVANJA. PROTITELESA. IMUNSKE REAKCIJE IN NJIHOVA PRAKTIČNA UPORABA. FAGOCITOZA

Virološke raziskovalne metode- metode za proučevanje biologije virusov in njihovo identifikacijo. V virologiji se široko uporabljajo metode molekularne biologije, s pomočjo katerih je bilo mogoče ugotoviti molekularno strukturo virusnih delcev, kako prodrejo v celico in značilnosti razmnoževanja virusov, primarno strukturo virusnih nukleinskih kislin. in beljakovine. Razvijajo se metode za določanje zaporedja sestavnih elementov virusnih nukleinskih kislin in beljakovinskih aminokislin. Funkcije nukleinskih kislin in proteinov, ki jih kodirajo, postane mogoče povezati z nukleotidnim zaporedjem in ugotoviti vzroke znotrajceličnih procesov, ki igrajo pomembno vlogo pri patogenezi virusne okužbe.

Virološke raziskovalne metode temeljijo tudi na imunoloških procesih (interakcija antigena s protitelesi), bioloških lastnostih virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemolize, encimske aktivnosti), značilnostih interakcije virusa z gostiteljsko celico (narava citopatije). učinek, tvorba intracelularnih vključkov itd.).

Pri diagnostiki virusnih okužb, pri gojenju, izolaciji in identifikaciji virusov ter pri pripravi pripravkov cepiv se široko uporablja metoda tkivnih in celičnih kultur. Uporabljajo se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane in diploidne celične kulture. Primarne kulture dobimo z dispergiranjem tkiva s proteolitičnimi encimi (tripsin, kolagenaza). Vir celic so lahko tkiva in organi (pogosteje ledvice) človeških in živalskih zarodkov. Suspenzijo celic v hranilnem mediju namestimo v tako imenovane vzmetnice, stekleničke ali petrijevke, kjer se celice po pritrditvi na površino posode začnejo razmnoževati. Za virusno okužbo se običajno uporablja celični monosloj. Hranilno tekočino odlijemo, virusno suspenzijo vnesemo v določenih razredčitvah in po stiku s celicami dodamo svež hranilni medij, običajno brez seruma.

Celice iz večine primarnih kultur je mogoče subkultivirati in jih imenujemo sekundarne kulture. Z nadaljnjim prehodom celic nastane populacija fibroblastom podobnih celic, ki so sposobne hitrega razmnoževanja, večina pa ohrani prvotni nabor kromosomov. To so tako imenovane diploidne celice. Pri serijski kultivaciji celic dobimo stabilne kontinuirane celične kulture. Med prehodi se pojavijo hitro deleče se homogene celice s heteroploidnim nizom kromosomov. Stabilne celične linije so lahko enoslojne in suspenzijske. Enoslojne kulture rastejo v obliki neprekinjenega sloja na stekleni površini, suspenzijske kulture rastejo v obliki suspenzij v različnih posodah z mešali. Obstaja več kot 400 celičnih linij, pridobljenih iz 40 različnih živalskih vrst (vključno s primati, pticami, plazilci, dvoživkami, ribami, žuželkami) in ljudi.

Delčke posameznih organov in tkiv (organske kulture) lahko gojimo v umetnih hranilnih gojiščih. Tovrstne kulture ohranjajo tkivno strukturo, kar je še posebej pomembno za izolacijo in prehod virusov, ki se v nediferenciranih tkivnih kulturah ne razmnožujejo (na primer koronavirusi).

V okuženih celičnih kulturah lahko viruse odkrijemo s spremembo celične morfologije, citopatskim delovanjem, ki je lahko specifično, pojavom vključkov, z določanjem virusnih antigenov v celici in v tekočini kulture; določanje bioloških lastnosti virusnih potomcev v kulturni tekočini in titracija virusov v tkivni kulturi, piščančjih zarodkih ali občutljivih živalih; z dokazovanjem posameznih virusnih nukleinskih kislin v celicah z molekularno hibridizacijo ali grozdov nukleinskih kislin s citokemično metodo s fluorescenčno mikroskopijo.

Izolacija virusov je naporen in dolgotrajen proces. Izvaja se za določitev vrste ali različice virusa, ki kroži med prebivalstvom (na primer za identifikacijo serovaniant virusa gripe, divjega ali cepnega seva virusa otroške paralize itd.); v primerih, ko je treba izvesti nujne epidemiološke ukrepe; ko se pojavijo nove vrste ali različice virusov; če je potrebno, potrdite predhodno diagnozo; za indikacijo virusov v okoljskih predmetih. Pri izolaciji virusov se upošteva možnost njihove obstojnosti v človeškem telesu, pa tudi pojav mešane okužbe, ki jo povzročata dva ali več virusov. Genetsko homogeno populacijo virusa, pridobljeno iz posameznega viriona, imenujemo virusni klon, postopek pridobivanja pa kloniranje.

Za izolacijo virusov, okužbe dovzetnih laboratorijskih živali, se uporabljajo piščančji zarodki, vendar se najpogosteje uporablja tkivna kultura. Prisotnost virusa se običajno določi s specifično celično degeneracijo (citopatski učinek), tvorbo simplastov in sincitijev, detekcijo intracelularnih vključkov, pa tudi specifični antigen, odkrit z imunofluorescenco, hemadsorpcijo, hemaglutinacijo (pri hemaglutinirajočih virusih) itd. . Te znake je mogoče odkriti šele po 2-3 prehodih virusa.

Za izolacijo številnih virusov, kot so virusi influence, se uporabljajo piščančji zarodki, za izolacijo nekaterih virusov Coxsackie in številnih arbovirusov pa novorojene miši. Identifikacija izoliranih virusov se izvaja s serološkimi testi in drugimi metodami.

Pri delu z virusi se določi njihov titer. Titracija virusov se običajno izvaja v tkivni kulturi, pri čemer se določi največja razredčitev tekočine, ki vsebuje virus, pri kateri pride do degeneracije tkiva, nastanejo vključki in virusno specifični antigeni. Metodo s plaki lahko uporabimo za titriranje številnih virusov. Plaki ali negativne kolonije virusov so žarišča z virusom uničenih celic enoslojne tkivne kulture pod agarsko prevleko. Štetje kolonij omogoča kvantitativno analizo infekcijske aktivnosti virusov na podlagi tega, da en delec kužnega virusa tvori en plak. Plake prepoznamo z barvanjem kulture z vitalnimi barvili, običajno nevtralno rdečimi; plaki ne absorbirajo barvila in so zato vidni kot svetle lise na ozadju obarvanih živih celic. Titer virusa je izražen kot število enot, ki tvorijo plak, v 1 ml.

Čiščenje in koncentracija virusov se običajno izvaja z diferencialnim ultracentrifugiranjem, ki mu sledi centrifugiranje v koncentracijskih ali gostotnih gradientih. Za čiščenje virusov se uporabljajo imunološke metode, ionsko izmenjevalna kromatografija, imunosorbenti itd.

Laboratorijska diagnostika virusnih okužb vključuje odkrivanje patogena ali njegovih sestavin v kliničnem materialu; izolacija virusa iz tega materiala; serodiagnoza. Izbira laboratorijske diagnostične metode je v vsakem posameznem primeru odvisna od narave bolezni, obdobja bolezni in zmožnosti laboratorija. Sodobna diagnostika virusnih okužb temelji na ekspresnih metodah, ki omogočajo pridobitev odziva nekaj ur po odvzemu kliničnega materiala v zgodnjih fazah po bolezni, vključno z elektronsko in imunsko elektronsko mikroskopijo, pa tudi z imunofluorescenco, metodo molekularne hibridizacije, odkrivanje protiteles razreda lgM itd.

Elektronska mikroskopija negativno obarvanih virusov omogoča diferenciacijo virusov in določanje njihove koncentracije. Uporaba elektronske mikroskopije pri diagnostiki virusnih okužb je omejena na tiste primere, kjer je koncentracija virusnih delcev v kliničnem materialu dovolj visoka (10 5 v 1). ml in višje). Pomanjkljivost metode je nezmožnost razlikovanja med virusi, ki pripadajo isti taksonomski skupini. To pomanjkljivost odpravimo z uporabo imunske elektronske mikroskopije. Metoda temelji na tvorbi imunskih kompleksov, ko virusnim delcem dodamo specifičen serum, hkrati pa pride do koncentracije virusnih delcev, kar omogoča njihovo identifikacijo. Metoda se uporablja tudi za odkrivanje protiteles. Za ekspresno diagnostiko se izvaja elektronsko mikroskopski pregled tkivnih izvlečkov, iztrebkov, tekočine iz veziklov in izločkov iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija se pogosto uporablja za preučevanje morfogeneze virusa, njene zmogljivosti se razširijo z uporabo označenih protiteles.

Metoda molekularne hibridizacije, ki temelji na detekciji virusno specifičnih nukleinskih kislin, omogoča detekcijo posameznih kopij genov in ji ni para glede občutljivosti. Reakcija temelji na hibridizaciji komplementarnih verig DNA ali RNA (sonde) in nastanku dvoverižnih struktur. Najcenejša sonda je klonirana rekombinantna DNK. Sonda je označena z radioaktivnimi prekurzorji (običajno radioaktivnim fosforjem). Obetavna je uporaba kolorimetričnih reakcij. Obstaja več variant molekularne hibridizacije: točkasta hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija itd.

Protitelesa razreda lgM se pojavijo prej kot protitelesa razreda G (3-5. dan bolezni) in izginejo po nekaj tednih, zato njihovo odkritje kaže na nedavno okužbo. Protitelesa razreda IgM odkrijemo z imunofluorescenco ali encimskim imunskim testom z uporabo anti-m antiserumov (anti-IgM težkih verig serumov).

Serološke metode v virologiji temeljijo na klasičnih imunoloških reakcijah (glej. Imunološke raziskovalne metode ): reakcije vezave komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka nevtralizacija, imunodifuzija, indirektna hemaglutinacija, radialna hemoliza, imunofluorescenca, encimski imunski test, radioimunski test. Razvite so bile mikrometode za številne reakcije, njihove tehnike pa se nenehno izboljšujejo. Te metode se uporabljajo za identifikacijo virusov z uporabo niza znanih serumov in za serodiagnostiko, da se določi povečanje protiteles v drugem serumu v primerjavi s prvim (prvi serum se vzame v prvih dneh po bolezni, drugi - po 2-3 tedne). Diagnostična vrednost ni manjša od štirikratnega povečanja protiteles v drugem serumu. Če odkrivanje protiteles razreda lgM kaže na nedavno okužbo, potem protitelesa razreda lgC vztrajajo več let, včasih pa celo življenje.

Za identifikacijo posameznih antigenov virusov in protiteles proti njim v kompleksnih mešanicah brez predhodnega čiščenja beljakovin se uporablja imunobloting. Metoda združuje frakcioniranje proteinov z uporabo elektroforeze v poliakrilamidnem gelu in kasnejši imunski test proteinov z encimskim imunskim testom. Ločevanje proteinov zmanjša zahteve po kemijski čistosti antigena in omogoča identifikacijo posameznih parov antigen-protitelo. Ta naloga je pomembna na primer pri serodiagnostiki okužbe s HIV, kjer so lažno pozitivne reakcije encimskega imunskega testa posledica prisotnosti protiteles proti celičnim antigenom, ki so prisotna kot posledica nezadostnega čiščenja virusnih proteinov. Identifikacija protiteles v serumu bolnikov proti notranjim in zunanjim virusnim antigenom omogoča določitev stopnje bolezni in pri populacijski analizi - variabilnost virusnih proteinov. Imunobloting pri okužbi s HIV se uporablja kot potrditveni test za odkrivanje posameznih virusnih antigenov in protiteles proti njim. Pri analizi populacij se metoda uporablja za ugotavljanje variabilnosti virusnih proteinov. Velika vrednost metode je v možnosti analize antigenov, sintetiziranih s tehnologijo rekombinantne DNK, ugotavljanju njihove velikosti in prisotnosti antigenskih determinant.

Bibliografija: Bukrinskaja A.G. Virologija, M., 1986; Virologija, metode, ur. B. Meikhi, prev. iz angleščine, M., 1988; Priročnik mikrobioloških in viroloških raziskovalnih metod, ed. M.O. Birger, M., 1982.