yağış reaksiyaları. Aqlütinasiya reaksiyası, çökmə reaksiyası İmmunoelektron mikroskopiyası
immunodiaqnostik reaksiyalar. Antigen-antikor reaksiyaları və etiketli komponentlərlə reaksiyalar. Mikroorqanizmlərin identifikasiyası və yoluxucu xəstəliklərin diaqnozu üçün istifadə edin.
İmmun reaksiyalar xəstələrdə diaqnostik və immunoloji tədqiqatlarda istifadə olunur və sağlam insanlar. Bu məqsədlə müraciət edin seroloji üsullar (latdan. serum - serum və loqolar - doktrina), yəni qan zərdabında və digər mayelərdə, həmçinin bədən toxumalarında müəyyən edilmiş antigen-antikor reaksiyalarından istifadə edərək anticisimlərin və antigenlərin öyrənilməsi üsulları.
Xəstənin qan zərdabında patogenin antigenlərinə qarşı anticisimlərin aşkarlanması xəstəliyə diaqnoz qoymağa imkan verir. Seroloji tədqiqatlar həmçinin mikrob antigenlərini, müxtəlif bioloji aktiv maddələri, qan qruplarını, toxuma və şiş antigenlərini, immun kompleksləri, hüceyrə reseptorlarını və s.
Mikrob xəstədən təcrid edildikdə, patogen immun diaqnostik seralardan, yəni spesifik anticisimləri olan hiperimmunizasiya olunmuş heyvanların qan seralarından istifadə etməklə onun antigen xassələrini öyrənməklə müəyyən edilir. Bu sözdə seroloji identifikasiya mikroorqanizmlər.
Mikrobiologiya və immunologiyada aqlütinasiya, çökmə, neytrallaşma reaksiyaları, komplementin iştirak etdiyi reaksiyalar, etiketlənmiş anticisimlər və antigenlərdən istifadə etməklə (radioimmunoloji, ferment immunoassay, immunofluoressensiya üsulları) geniş istifadə olunur. Sadalanan reaksiyalar qeydə alınmış effekt və təyinetmə texnikası ilə fərqlənir, lakin onların hamısı əsasdır. mikroavtobuslar bir antigenin bir antikor ilə qarşılıqlı təsirinə reaksiya verir və həm antikorları, həm də antigenləri aşkar etmək üçün istifadə olunur. İmmunitet reaksiyaları yüksək həssaslıq və spesifiklik ilə xarakterizə olunur.
Əsas immunodiaqnostik reaksiyaların prinsipləri və sxemləri aşağıda verilmişdir. Detal texnikası tənzimləmə reaksiyaları verilmişdir. immunodiaqnostika üçün praktiki təlimatlar.
Aqqlütinasiya reaksiyası - RA(latdan. agluti- natio- bağlanma) - antikorların korpuskulyar antigenləri (bakteriyalar, eritrositlər və ya digər hüceyrələr, onlarda adsorbsiya edilmiş antigenləri olan həll olunmayan hissəciklər, həmçinin makromolekulyar aqreqatlar) bağladığı sadə reaksiya. Elektrolitlərin iştirakı ilə, məsələn, izotonik natrium xlorid məhlulu əlavə edildikdə baş verir.
Müraciət edin müxtəlif variantlar aglütinasiya reaksiyaları: genişlənmiş, təqribi, dolayı və s.. Aqqlütinasiya reaksiyası lopa və ya çöküntü əmələ gəlməsi ilə özünü göstərir.
RA aşağıdakılar üçün istifadə olunur:
xəstələrin qan serumunda antikorların təyini, məsələn, brusellyoz (Wright, Heddelson reaksiyaları), tifo qızdırması və paratif (Vidal reaksiya) və digər yoluxucu xəstəliklər;
xəstədən təcrid olunmuş patogenin təyini;
eritrosit allogenlərinə qarşı monoklonal antikorlardan istifadə edərək qan qruplarının təyini.
Xəstənin antikorlarını təyin etmək qoyuzadılmış aqlütinasiya reaksiyası: xəstənin qan serumunun seyreltmələrinə əlavə edin diaqnostik(öldürülmüş mikrobların dayandırılması) və 37 ° C-də bir neçə saat inkubasiyadan sonra aglütinasiyanın baş verdiyi, yəni bir çöküntü meydana gəldiyi ən yüksək serum seyreltməsi (serum titri) qeyd olunur.
Aqqlütinasiyanın təbiəti və sürəti antigen və antikorların növündən asılıdır. Buna misal olaraq diaqnostikumların (O- və R-antigenləri) spesifik antikorlarla qarşılıqlı əlaqəsini göstərmək olar. ilə aglütinasiya reaksiyası O-diaqnostik(termostabili saxlayaraq istiliklə öldürülən bakteriyalar O antigen) xırda dənəli aglütinasiya şəklində baş verir. H-diagnosticum ilə aglütinasiya reaksiyası (formalin tərəfindən öldürülən, istiliyə davamlı flagellar H-antigenini saxlayan bakteriyalar) qaba dənəli olur və daha sürətli gedir.
Xəstədən təcrid olunmuş patogeni müəyyən etmək lazımdırsa, qoyun istiqamətləndirici aglütinasiya reaksiyası, diaqnostik antikorlardan (aglütinasiya edən serum) istifadə edərək, yəni patogenin serotiplənməsi aparılır. Təxmini reaksiyaşüşə slaydda aparılır. 1:10 və ya 1:20 seyreltilmiş diaqnostik aglütinasiya zərdabının bir damlasına xəstədən təcrid olunmuş patogenin təmiz kulturasını əlavə edin. Yaxınlıqda bir nəzarət yerləşdirilir: serum əvəzinə bir damla natrium xlorid məhlulu tətbiq olunur. Serum və mikroblarla bir damcıda flokulyant çöküntü göründükdə, qoyurlar geniş aglütinasiya reaksiyası aglütinasiya edən zərdabın artan seyreltmələri ilə sınaq borularında, 2-3 damcı patogen süspansiyon əlavə edilir. Aqqlütinasiya çöküntünün miqdarı və mayenin aydınlaşma dərəcəsi ilə nəzərə alınır. Diaqnostik serumun titrinə yaxın seyreltmədə aglütinasiya qeyd edilərsə, reaksiya müsbət hesab olunur. Eyni zamanda, nəzarət nəzərə alınır: izotonik natrium xlorid məhlulu ilə seyreltilmiş zərdab şəffaf olmalıdır, eyni məhluldakı mikrobların süspansiyonu çöküntü olmadan bərabər bulanıq olmalıdır.
Fərqli əlaqəli bakteriyalar eyni diaqnostik aglütinasiya zərdabında aglütinasiya oluna bilər ki, bu da onların identifikasiyasını çətinləşdirir. Buna görə də zövq alın adsorbsiya edilmiş aglütinasiya edən sera, onlardan çarpaz reaktiv antikorlar əlaqəli bakteriyalar tərəfindən adsorbsiya yolu ilə çıxarılır. Belə serumlarda yalnız bu bakteriyaya xas olan anticisimlər qalır. Bu üsulla monoreseptor diaqnostik aglutinating sera hazırlanması A. Castellani (1902) tərəfindən təklif edilmişdir.
Dolayı (passiv) hemaqlütinasiya reaksiyası (RNHA, RPHA) səthində adsorbsiya edilmiş antigenləri və ya antikorları olan eritrositlərin istifadəsinə əsaslanır, topun qan zərdabının müvafiq antikorları və ya antigenləri ilə qarşılıqlı təsiri eritrositlərin bir-birinə yapışmasına və dibinə düşməsinə səbəb olur. sınaq borusu və ya hüceyrə inçəmənli çöküntü forması (şək. 13.2). At əks reaksiya eritrositlər "düymə" şəklində yerləşirlər. Adətən, antikorlar RNHA-da adsorbsiya edilmiş eritrositlər olan antigen eritrosit diaqnostikumundan istifadə edərək aşkar edilir. üstündə onların antigenləri. Bəzən biz antikorların adsorbsiya edildiyi antikor eritrosit diaqnostikasından istifadə edirik. Məsələn, botulinum toksini ona eritrosit antikoru botulinum diaqnostikumu əlavə etməklə aşkar edilə bilər (bu reaksiya deyilir əks dolayı hemaqlütinasiya reaksiyası- RONGA). RNHA yoluxucu xəstəliklərin diaqnozu, gonadotropik hormonun təyin edilməsi üçün istifadə olunur in hamiləlik müəyyən edildikdə, aşkar etmək üçün sidik həddindən artıq həssaslıqüçün dərmanlar, hormonlar və bəzi digər hallarda.
Koaglütinasiya reaksiyası . Patojen hüceyrələri immun diaqnostik serum ilə əvvəlcədən müalicə olunan stafilokoklardan istifadə edərək müəyyən edilir. Stafilokoklar olan zülallar AMMA,üçün yaxınlıq var Fc -immunoqlobulinlərin fraqmenti, qeyri-spesifik olaraq antimikrob antikorları adsorbsiya edir, sonra xəstələrdən təcrid olunmuş müvafiq mikroblarla aktiv mərkəzlərlə qarşılıqlı əlaqədə olur. Koaqlütinasiya nəticəsində stafilokoklardan, diaqnostik serum anticisimlərindən və təyin olunan mikrobdan ibarət lopa əmələ gəlir.
Hemaqlütinasiya inhibə reaksiyası (RTGA) blokadaya, virusların antigenlərinin immun zərdabın antikorları tərəfindən basdırılmasına əsaslanır, bunun nəticəsində viruslar qırmızı qan hüceyrələrini aglutinasiya etmək qabiliyyətini itirirlər (Şəkil 13.3). RTHA bir çox viral xəstəliklərin diaqnostikasında istifadə olunur, onların törədicisi (qrip, qızılca, məxmərək, gənə ensefaliti və s.) müxtəlif heyvanların eritrositlərini aglutinasiya edə bilir.
Qan qruplarını təyin etmək üçün aglütinasiya reaksiyası A (II), B (III) qan qruplarının antigenlərinə qarşı immun zərdabın antikorları ilə eritrositlərin aglütinasiyasından istifadə edərək ABO sistemini (10.1.4.1-ə baxın) yaratmaq üçün istifadə olunur. Nəzarət vasitələri bunlardır: antikorsuz serum, yəni serum AB (GU) qan qrupları; A (II), B (III) qruplarının eritrositlərində olan antigenlər. Mənfi nəzarətdə antigen yoxdur, yəni 0 (I) qrup eritrositlər istifadə olunur.
AT Rh faktorunu təyin etmək üçün aglütinasiya reaksiyaları(10.1.4.1 bölməsinə baxın) anti-Rh seralarından istifadə edin (ən azı iki müxtəlif seriya). Tədqiq olunan eritrositlərin membranında Rh antigeninin olması ilə bu hüceyrələrin aglütinasiyası baş verir. Bütün qan qruplarının standart Rh-müsbət və Rh-mənfi eritrositləri nəzarət kimi xidmət edir.
Anti-rezus anticisimlərinin təyini üçün aglütinasiya reaksiyası ( dolayı reaksiya Coombs)olan xəstələrdə istifadə olunur damardaxili hemoliz. Bu xəstələrin bəzilərində natamam, monovalent olan anti-rezus anticisimləri aşkar edilir. Onlar xüsusi olaraq Rh-müsbət eritrositlərlə qarşılıqlı əlaqədə olurlar, lakin onların aglütinasiyasına səbəb olmurlar. Belə natamam antikorların olması dolayı Coombs reaksiyasında müəyyən edilir. Bunun üçün eritrositlərin aglütinasiyasına səbəb olan anti-Rh anticisimləri + Rh-müsbət eritrositlər sisteminə antiqlobulin zərdabı (insan immunoqlobulinlərinə qarşı antikorlar) əlavə edilir (şəkil 13.4). Coombs reaksiyasından istifadə edərək, immun mənşəli eritrositlərin damardaxili lizisi ilə əlaqəli patoloji vəziyyətlər, məsələn, yeni doğulmuş uşağın hemolitik xəstəliyi diaqnozu qoyulur: Rh-müsbət dölün eritrositləri qanda dolaşan Rh faktoruna qarşı natamam antikorlarla birləşir. Rh-mənfi anadan olan plasenta.
Yağış reaksiyaları
çökmə reaksiyası - RP (danlat. praeci-pito- çöküntü,) bulanıqlıq şəklində antikorlarla həll olunan molekulyar antigen kompleksinin əmələ gəlməsi və çöküntüsü adlanır. çöküntü. Ekvivalent miqdarda antigenləri və antikorları qarışdırmaqla əmələ gəlir; onlardan birinin artıqlığı immun kompleksinin formalaşma səviyyəsini azaldır.
Çöküntü reaksiyaları sınaq borularına qoyulur (halqanın çökmə reaksiyası), gellərdə, qida mühitində və s. Aqar və ya agarozun yarı maye gelində çökmə reaksiyasının növləri geniş istifadə olunur: Ouchterlony görə ikiqat immunodiffuziya. radial immunodiffuziya, immunoelektroforez və s.
Halqanın çökmə reaksiyası . Reaksiya, həll olunan bir antigenin qatlandığı, immun serumu olan dar çökmə borularında aparılır. Antigen və antikorların optimal nisbəti ilə bu iki məhlulun sərhədində qeyri-şəffaf bir çöküntü halqası əmələ gəlir (Şəkil 13.5). Antigenin artıqlığı reagentlərin maye sərhəddinə tədricən yayılması səbəbindən halqalı çökmə reaksiyasının nəticəsinə təsir göstərmir. Əgər qaynadılıb süzülürsə sulu ekstraktlar orqanlar və ya toxumalar, sonra belə bir reaksiya deyilir termoçökmə reaksiyası-iii (Askoli reaksiyası, qarayara ilə /
Ouxteruni ikiqat immunodiffuziya reaksiyası . Reaksiyanı qurmaq üçün ərinmiş agar geli nazik təbəqə ilə şüşə boşqabın üzərinə tökülür və bərkidikdən sonra içərisində 2-3 mm ölçülü deşiklər açılır. Bir-birinə doğru yayılan bu quyularda antigenlər və immun serumlar ayrıca yerləşdirilir. Ekvivalent nisbətlərdə görüş nöqtəsində ağ zolaq şəklində bir çöküntü əmələ gətirirlər. Çoxkomponentli sistemlərdə müxtəlif antigenlər və serum antikorları olan quyular arasında bir neçə çöküntü xətti görünür; eyni antigenlər üçün çöküntü xətləri birləşir; eyni olmayanlar üçün onlar kəsişir (şək. 13.6).
Radial immunodiffuziya reaksiyası . Ərinmiş agar geli olan immun serum bərabər şəkildə şüşə üzərinə tökülür. Geldə bərkidikdən sonra antigenin müxtəlif seyreltmələrdə yerləşdirildiyi quyular hazırlanır. Gelin içinə yayılan antigen, antikorlarla quyuların ətrafında halqalı çökmə zonaları əmələ gətirir (şək. 13.7). Yağış halqasının diametri antigen konsentrasiyasına mütənasibdir. Reaksiya müxtəlif siniflərin immunoqlobulinlərinin, komplement sisteminin komponentlərinin və s.-nin qan səviyyəsini təyin etmək üçün istifadə olunur.
İmmunoelektroforez- elektroforez və immunopresipitasiya metodunun kombinasiyası: antigenlərin qarışığı gelin quyularına daxil edilir və elektroforezdən istifadə edərək geldə ayrılır. Sonra, elektroforez zonalarına paralel olaraq, yivə immun serum daxil edilir, onun antikorları gelə yayılaraq yağış xəttinin antigeni ilə görüş nöqtəsində əmələ gəlir.
flokulyasiya reaksiyası(Ramona görə) (latdan. sürü- yun lopaları) - toksin-antitoksin və ya anatoksin-antitoksin reaksiyası zamanı sınaq borusunda opalescence və ya flokulyant kütlənin (immunoprecipitation) görünüşü. Antitoksik serum və ya toksoidin fəaliyyətini təyin etmək üçün istifadə olunur.
İmmun elektron mikroskopiyası- mikrobların elektron mikroskopiyası, daha tez-tez viruslar, müvafiq antikorlarla müalicə olunur. İmmun serumla müalicə olunan viruslar immun aqreqatlar (mikropresipitatlar) əmələ gətirir. Virionların ətrafında fosfotunqstik turşu və ya digər elektron-optik sıx preparatlarla ziddiyyət təşkil edən antikorların "corolla"sı əmələ gəlir.
Komplementin iştirak etdiyi reaksiyalar
Komplementin iştirak etdiyi reaksiyalarkomplementin antigen-antikor kompleksi ilə aktivləşməsinə əsaslanır (komplementin fiksasiya reaksiyası, radial hemoliz və s.).
Komplementin fiksasiya reaksiyası (RSK) bir-birinə uyğunlaşdıqda antigenlər və antikorların bir immun kompleksi meydana gətirmələrində yatır. Fc -antikor fraqmenti komplementə (C) qoşulur, yəni komplementin bağlanması antigen-antikor kompleksi ilə baş verir. Əgər antigen-antikor kompleksi əmələ gəlməzsə, onda tamamlayıcı sərbəst qalır (şək. 13.8). RSK iki mərhələdə həyata keçirilir: 1-ci faza - antigen + antikor + komplementin üç komponentindən ibarət qarışığın inkubasiyası; 2-ci faza (göstərici) - qarışığa qoyun eritrositlərindən ibarət hemolitik sistem və onlara qarşı anticisimlər olan hemolitik zərdab əlavə etməklə sərbəst komplementin aşkarlanması. Reaksiyanın 1-ci fazasında antigen-antikor kompleksinin əmələ gəlməsi zamanı komplement bağlanması baş verir, sonra 2-ci fazada anticisimlərlə sensibilizasiya olunmuş eritrositlərin hemolizi baş verməyəcək; reaksiya müsbətdir. Əgər antigen və anticisim bir-birinə uyğun gəlmirsə (sınaq nümunəsində antigen və ya antikor yoxdur), komplement sərbəst qalır və 2-ci fazada eritrosit-antieritrosit anticisim kompleksinə qoşularaq hemolizə səbəb olur; reaksiya mənfi olur.
RSK bir çox yoluxucu xəstəliklərin, xüsusən də sifilis (Wasserman reaksiyası) diaqnozu üçün istifadə olunur.
Radial hemoliz reaksiyası (RRH ) qoç eritrositləri və komplementi olan agar gel quyularına yerləşdirilir. Gelin quyularına hemolitik zərdab (qoç eritrositlərinə qarşı anticisimlər) əlavə edildikdən sonra onların ətrafında (anticisimlərin radial diffuziyası nəticəsində) hemoliz zonası əmələ gəlir. Beləliklə, qrip, məxmərək, məxmərək xəstələrinin qan zərdabında komplement və hemolitik zərdabın, həmçinin anticisimlərin aktivliyini müəyyən etmək mümkündür. gənə ensefaliti. Bunun üçün virusun müvafiq antigenləri eritrositlərə adsorbsiya edilir və bu eritrositləri ehtiva edən gelin quyularına xəstənin qan zərdabı əlavə edilir. Antiviral antikorlar sonra eritrositlər üzərində adsorbsiya edilmiş viral antigenlərlə qarşılıqlı əlaqə qurur
Komplement komponentləri bu kompleksə birləşərək hemolizə səbəb olur.
İmmun yapışma reaksiyası (RIP ) immun serumla müalicə olunan korpuskulyar antigenlər (bakteriyalar, viruslar) tərəfindən komplement sisteminin aktivləşdirilməsinə əsaslanır. Nəticədə aktivləşdirilmiş üçüncü tamamlayıcı komponent (C3b) əmələ gəlir ki, bu da immun kompleksin bir hissəsi kimi korpuskulyar antigenə birləşir. Eritrositlərdə, trombositlərdə, makrofaqlarda C3b üçün reseptorlar var, buna görə də bu hüceyrələr C3b daşıyan immun kompleksləri ilə qarışdıqda birləşərək aglutinasiya edirlər.
Neytrallaşma reaksiyası
İmmun zərdab anticisimləri mikrobların və ya onların toksinlərinin həssas hüceyrələrə və toxumalara zərərli təsirini neytrallaşdırmağa qadirdir, bu da mikrob antigenlərinin antikorlar tərəfindən blokadası ilə bağlıdır, yəni. neytrallaşdırma. Neytrallaşma reaksiyası(RN) antigen-antikor qarışığının heyvanlara və ya həssas sınaq obyektlərinə (hüceyrə mədəniyyəti, embrionlar) daxil edilməsi ilə həyata keçirilir. Mikroorqanizmlərin və ya onların antigenlərinin, heyvanlarda və sınaq obyektlərində toksinlərin zərərverici təsiri olmadıqda, immun serumun neytrallaşdırıcı təsirindən və buna görə də antigen-antikor kompleksinin qarşılıqlı təsirinin spesifikliyindən danışırlar (Şəkil 13.9).
İmmunofluoressensiya reaksiyası - RIF (Koons metodu)
Metodun üç əsas çeşidi var: birbaşa, dolayı (Şəkil 13.10), tamamlayıcı ilə. Koons reaksiyası mikrob antigenlərini aşkar etmək və ya antikorları aşkar etmək üçün sürətli diaqnostik üsuldur.
Birbaşa RIF üsulu flüoroxromlarla işarələnmiş antikorlarla immun sera ilə müalicə olunan toxuma antigenləri və ya mikrobların flüoresan mikroskopun UV şüalarında parlaya bilməsi faktına əsaslanır.
Belə bir luminescent zərdab ilə müalicə olunan bir smeardakı bakteriyalar, yaşıl bir haşiyə şəklində hüceyrə periferiyası boyunca parıldayır.
Dolayı RIF metodu fluoroxrom ilə etiketlənmiş antiqlobulin (antikor) zərdabından istifadə edərək antigen-antikor kompleksini müəyyən etməkdir. Bunun üçün mikrobların süspansiyonundan gələn ləkələr antimikrobiyal dovşan diaqnostik serumunun antikorları ilə müalicə olunur. Sonra mikrob antigenləri ilə bağlanmayan anticisimlər yuyulur və mikrobların üzərində qalan anticisimlər, yaxmanın flüoroxromlarla işarələnmiş antiqlobulin (dovşan əleyhinə) zərdabı ilə işlənməsi ilə müəyyən edilir. Nəticədə floroxrom ilə etiketlənmiş kompleks mikrob + antimikrob dovşan anticisimləri + anti-dovşan anticisimləri əmələ gəlir. Bu kompleks birbaşa üsulda olduğu kimi flüoresan mikroskopda da müşahidə edilir.
ELISA metodu və ya analizi (ELISA)
ELISA -etiketli fermentlə (horseradish peroksidaza, beta-qalaktosidaza və ya) konyuqasiya edilmiş müvafiq antikorlardan istifadə edərək antigenlərin aşkarlanması qələvi fosfataza). Antigen fermentlə işarələnmiş immun sera ilə birləşdirildikdən sonra substrat/xromogen qarışığa əlavə edilir. Substrat ferment tərəfindən parçalanır və reaksiya məhsulunun rəngi dəyişir - rəngin intensivliyi bağlı antigen və antikor molekullarının sayı ilə birbaşa mütənasibdir.
Bərk fazalı ELISA - immun cavabın komponentlərindən biri (antigen və ya antikorlar) bərk daşıyıcıda, məsələn, polistirol plitələrinin quyularında adsorbsiya edildikdə immunoloji testin ən geniş yayılmış variantı.
Anticisimləri təyin edərkən, adsorbsiya edilmiş antigeni olan lövhələrin quyularına ardıcıl olaraq xəstənin qan serumu, fermentlə işarələnmiş antiqlobulin serumu və ferment üçün substrat (xromogen) əlavə olunur.
Hər dəfə növbəti komponent əlavə edildikdən sonra bağlanmamış reagentlər hərtərəfli yuyulma yolu ilə quyulardan çıxarılır. At müsbət nəticə xromogen məhlulunun rəngi dəyişir. Bərk fazalı daşıyıcı yalnız antigenlə deyil, həm də antikorlarla həssaslaşdırıla bilər. Sonra, adsorbsiya edilmiş anticisimləri olan quyulara istənilən antigen daxil edilir, fermentlə işarələnmiş antigenə qarşı immun zərdab əlavə edilir və sonra ferment üçün substrat əlavə edilir.
Rəqabətli ELISA . hədəf antigen və ferment etiketli antigen məhdud miqdarda immun serum antikorlarının bağlanması üçün bir-biri ilə rəqabət aparır. Başqa bir test axtardığınız antikorlardır
və etiketli antikorlar antigenlər üçün bir-biri ilə rəqabət aparır.
Radioimmunoloji metod və ya analiz (RİA)
Bir radionuklid (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr və s.) ilə etiketlənmiş antigenlərdən və ya antikorlardan istifadə edərək antigen-antikor reaksiyasına əsaslanan yüksək həssas üsul. Onların qarşılıqlı təsirindən sonra yaranan radioaktiv immun kompleks ayrılır və onun radioaktivliyi müvafiq sayğacda (beta və ya qamma şüalanması) müəyyən edilir:
şüalanma intensivliyi bağlı antigen və antikor molekullarının sayı ilə düz mütənasibdir.
At RİA-nın bərk fazalı versiyası reaksiya komponentlərindən biri (antigen və ya antikorlar) bərk daşıyıcıda, məsələn, polistirol mikroarraylarının quyularında adsorbsiya edilir. Metodun başqa bir versiyası rəqabətli RİA. hədəf antigen və radionuklid etiketli antigen məhdud miqdarda immun serum antikorlarını bağlamaq üçün bir-biri ilə rəqabət aparır. Bu seçim test materialında antigenin miqdarını təyin etmək üçün istifadə olunur.
RİA mikrob antigenlərini aşkar etmək, hormonları, fermentləri, dərman maddələri və immunoqlobulinlər, eləcə də kiçik konsentrasiyalarda test materialında olan digər maddələr - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 q / l. Metod müəyyən ekoloji təhlükə yaradır.
İmmunoblotinq
İmmunoblotinq (IB)- elektroforez və ELISA və ya RİA-nın birləşməsinə əsaslanan yüksək həssas üsul.
Antigen poliakrilamid gel elektroforezindən istifadə edərək təcrid olunur, sonra köçürülür (blotting - ingilis dilindən. ləkə, ləkə) geldən aktivləşdirilmiş kağıza və ya nitroselüloz membrana köçürülür və ELISA tərəfindən hazırlanmışdır. Firmalar belə zolaqları "blot"larla istehsal edirlər.
antigenlər. Bu zolaqlara xəstənin serumu vurulur. Sonra inkubasiyadan sonra xəstə xəstənin bağlanmamış anticisimlərindən yuyulur və fermentlə etiketlənmiş insan immunoqlobulinlərinə qarşı zərdab vurulur. Zolaqda əmələ gələn xəstənin kompleks antigen + antikor + insan Ig-yə qarşı antikor fermentin təsiri altında rəngini dəyişən bir substrat / xromogen əlavə etməklə aşkar edilir (Şəkil 13.12).
İB İİV infeksiyasının diaqnostik metodu kimi istifadə olunur və s.
çökmə reaksiyasıçöküntünün əmələ gəlməsinə - antigen-antikor immun komplekslərinin çökməsinə əsaslanır. Məhlullarda onlar çökür, gellərdə isə bantlar şəklində çökürlər. Test materialında antikorların konsentrasiyasını təyin etmək üçün təmizlənmiş antigenlərdən istifadə olunur və çökmə reaksiyasını həyata keçirməyin bir neçə yolu var.
Məhlulda çökmə
Məhlullarda çökmə reaksiyasının bir xüsusiyyəti var: çöküntünün miqdarı reagentin (antikorların) miqdarından asılıdır. Antikorların miqdarı antigenin miqdarından azdırsa, sonuncunun miqdarının artması çöküntünün daha çox meydana gəlməsinə səbəb olur. Ən böyük rəqəmçöküntü nisbətən bərabər miqdarda antigen və antikor ilə əmələ gəlir. Antigen antikorlarla müqayisədə artıqdırsa, konsentrasiyasının artması ilə çöküntü miqdarı azalır.immunodiffuziya
Yağış reaksiyalarının aparılmasının ən çox yayılmış üsulu immunodiffuziya ilə əlaqələndirilir - antikorların və antigenlərin gelə nüfuz etmə qabiliyyəti.Sadə radial immunodiffuziya üçün antikorları olan bir gel istifadə olunur. Dairəvi kəsiklər nazik gel qatında aparılır və onların içərisinə gelin içinə dərindən nüfuz edən, antikorlarla qarşılıqlı əlaqədə olan və quyuların ətrafında çöküntü halqaları əmələ gətirən antigenləri olan sınaq materialı yerləşdirilir. Bu yolla qanda immunoqlobulinlərin tərkibi müəyyən edilir.
üçün çoxlu reagentlər biokimyəvi analizlər tabletlərdə fiksasiya olunmuş şəkildə buraxılır. Planşetin hər bir hüceyrəsində ciddi ölçülmüş miqdarda reagent var, buna görə də nəticələrin yüksək dəqiqliyi ilə bir anda çoxlu analizlər apara bilərsiniz.
İkiqat radial immunodiffuziya ilə, bir-birindən müəyyən bir məsafədə nazik bir gel təbəqəsində iki dəyirmi deşik kəsilir. Reagent birinə, sınaq materialı isə digərinə yerləşdirilir. Antikorlar və antigenlər bir-birinə doğru gelə nüfuz edir. Onların qarşılıqlı təsir yerində bir çöküntü əmələ gəlir.
Sınaq materialında antigenin konsentrasiyasını təyin etmək üçün onunla quyudan çöküntü xəttinə qədər olan məsafə ölçülür.
Aqqlütinasiya reaksiyasından fərqli olaraq, çökmə reaksiyası üçün antigen həll olunan birləşmələrdir, onların hissəciklərinin ölçüsü molekulların ölçüsünə yaxınlaşır. Bunlar zülallar, karbohidratlar və lipidlərlə zülalların kompleksləri, bakterial ekstraktlar, mikrob bulyonu kulturalarının müxtəlif disatlar və ya filtratları ola bilər. Yağış reaksiyasında iştirak edən antikorlara presipitinlər deyilir. Yaranan incə antigen-antikor kompleksi çökmə reaksiyasının müəyyən üsulları ilə aşkar edilir.
Halqalı çökmə reaksiyası ilk dəfə Ascoli tərəfindən təklif edilmişdir. Qarayara, taun, tulyaremiya, meningit xəstəliklərinin diaqnostikasında istifadə olunur. Metod sadə və əlçatandır.
Xüsusi bir immun çökdürən zərdab dar çöküntü borularına tökülür və antigen çox diqqətlə onun üzərinə qoyulur. Antigen kimi, məsələn, qarayara diaqnozu qoyularkən dəri parçaları, yun, düşmüş heyvanın dəriləri və s. götürülür, qaynadılır, maye süzülür və antigen kimi istifadə olunur. İki mayenin sərhədində bir halqanın görünüşü - bir çöküntü müvafiq antigenin mövcudluğunu göstərir.
Agar gel ilə çökmə reaksiyası və ya diffuziya çökdürmə üsulu mürəkkəb suda həll olunan antigen qarışıqların tərkibini ətraflı öyrənməyə imkan verir. Reaksiyanı qurmaq üçün bir gel (yarı maye və ya daha qalın agar) istifadə olunur. Antigeni təşkil edən hər bir komponent fərqli bir sürətlə müvafiq antikora doğru yayılır. Buna görə də müxtəlif antigenlərin və müvafiq antikorların kompleksləri yerləşir müxtəlif sahələr yağıntı xətlərinin əmələ gəldiyi gel. Xətlərin hər biri yalnız bir antigen-antikor kompleksinə uyğundur. Yağış reaksiyası adətən otaq temperaturunda təyin edilir.
İmmunoelektroforez üsulundan geniş istifadə olunur son illər mikrobların antigen quruluşunun öyrənilməsində. Antigenlər kompleksi boşqaba tökülən agar gelinin mərkəzində yerləşən quyuya yerləşdirilir. Sonra, agar geldən elektrik cərəyanı keçir, bunun nəticəsində kompleksə daxil olan müxtəlif antigenlər sahəyə hərəkət edir. elektrik cərəyanı onların elektroforetik hərəkətliliyindən asılı olaraq. Elektroforez başa çatdıqdan sonra, lövhənin kənarında yerləşən xəndəyə xüsusi bir immun serum daxil edilir və nəmli bir kameraya yerləşdirilir. Antigen-antikor kompleksinin meydana gəldiyi yerlərdə yağıntı xətləri görünür.
Çöküntü reaksiyası çox həssas bir üsuldur və məhkəmə ekspertizasında müxtəlif zülal və polisaxarid antigenlərinin öyrənilməsində istifadə olunur. tibbi təcrübə kətan və müxtəlif obyektlərdə mövcud olan qan ləkələri, sperma, serum növlərini müəyyən etmək. Bu reaksiya həm də süd, balıq və ət məhsullarında müxtəlif çirkləri müəyyən etmək, qədim rəssamlıq ustalarının boyalarını təşkil edən zülalların təbiətini müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər.
Çöküntü reaksiyasında həll olunan antigendən (lizat, ekstrakt, hapten) və elektrolitlərin iştirakı ilə spesifik antikordan ibarət olan spesifik immun kompleks çökdürülür.
Bu reaksiya nəticəsində əmələ gələn buludlu halqa və ya çöküntü çöküntü adlanır. Bu reaksiya aqlütinasiya reaksiyasından əsasən antigen hissəciklərinin ölçüsünə görə fərqlənir.
Presipitasiya reaksiyası adətən bir sıra infeksiyaların (sibir yarası, meningit və s.) diaqnozunda antigeni müəyyən etmək üçün istifadə olunur; məhkəmə tibbində - qan, sperma və s. növlərini müəyyən etmək; sanitar-gigiyenik tədqiqatlarda - məhsulların saxtalaşdırılması aşkar edildikdə; onun köməyi ilə heyvanların və bitkilərin filogenetik əlaqəsini müəyyən edir. Reaksiya üçün sizə lazımdır:
1. Anticisimlər (presipitinlər) - antikorların yüksək titrinə malik immun zərdab (1:100.000-dən aşağı olmayan). Çöküntü zərdabının titri onun reaksiya verdiyi antigenin ən yüksək seyreltilməsi ilə müəyyən edilir. Serum adətən seyreltilmədən və ya 1:5 - 1:10 nisbətində seyreltilmiş istifadə olunur.
2. Antigen - zülal və ya lipoid polisaxarid xarakterli həll olunmuş maddələr (tam antigenlər və haptenlər).
3. İzotonik məhlul.
Çöküntü reaksiyasının aparılmasının əsas üsulları bunlardır: halqalı çökmə reaksiyası və agarda (gel) çökmə reaksiyası.
Diqqət! Yağış reaksiyasında iştirak edən bütün komponentlər tamamilə şəffaf olmalıdır.
Halqanın çökmə reaksiyası. Pasteur pipetindən istifadə etməklə 0,2-0,3 ml (5-6 damcı) zərdab çöküntü borusuna əlavə edilir (serum borunun divarlarına düşməməlidir). Antigen diqqətlə eyni həcmdə zərdabın üzərinə qatlanır, nazik Pasteur pipeti ilə sınaq borusunun divarı boyunca tökülür. Sınaq borusu maili vəziyyətdə saxlanılır. Düzgün təbəqələşmə ilə serum və antigen arasında aydın bir sərhəd əldə edilməlidir. Diqqətlə, mayeni qarışdırmamaq üçün sınaq borusunu ştativə qoyun. Reaksiyanın müsbət nəticəsi ilə antigenin və antikorun sərhədində buludlu bir "halqa" meydana gəlir - bir çöküntü (bax. Şəkil 48).
Reaksiyadan sonra bir sıra nəzarətlər aparılır (Cədvəl 18). Reaksiya inqrediyentlərinin sınaq borusuna daxil edilməsinin ardıcıllığı çox vacibdir. Serumun antigenin üzərinə qatlanması mümkün deyil (nəzarətdə - izotonik məhlulda), çünki nisbi sıxlıq daha çox serum var, o, borunun dibinə batacaq və mayelər arasındakı sərhəd açılmayacaq.
Cədvəl 18
Qeyd. + "üzük" varlığı; - "üzük" olmaması.
Nəticələr 5-30 dəqiqədən sonra, bəzi hallarda bir saatdan sonra, həmişə olduğu kimi, nəzarətdən başlayaraq qeyd olunur. 2-ci sınaq borusundakı "halqa" immun zərdabın müvafiq antigenlə spesifik reaksiyaya girmək qabiliyyətini göstərir. 3-5-ci sınaq borularında "halqalar" olmamalıdır - bir-birinə uyğun gələn antikorlar və antigenlər yoxdur. 1-ci borudakı "halqa" - müsbət reaksiya nəticəsi - test antigeninin qəbul edilmiş immun zərdabına uyğun olduğunu göstərir, "halqanın" olmaması (yalnız 2-ci boruda "halqa") onların uyğunsuzluğunu göstərir - mənfi reaksiya nəticə.
Agarda (gel) çökmə reaksiyası. Reaksiyanın özəlliyi ondan ibarətdir ki, antigen və antikorun qarşılıqlı təsiri sıx bir mühitdə, yəni geldə baş verir. Nəticədə yaranan çöküntü mühitin qalınlığında buludlu bir zolaq verir. Bir bandın olmaması reaksiya komponentləri arasında uyğunsuzluğu göstərir. Bu reaksiya biotibbi tədqiqatlarda, xüsusən də difteriya törədicisində toksin əmələ gəlməsinin öyrənilməsində geniş istifadə olunur.
1. Aqqlütinasiya ilə çökmə reaksiyasının əsas fərqi nədir?
2. Nə üçün buludlu inqrediyentlərdən yağış reaksiyasında istifadə etmək olmaz?
Məşq edin
1. Halqanın çökmə reaksiyasını qurun və nəticəni çəkin.
2.Aqarın çökmə reaksiyasında antigenin antikorla qarşılıqlı təsirinin xarakterini öyrənin, nəticəni çəkin (müəllimdən kuboku alın).
Lizis reaksiyası (immun sitolizi)
İmmun lizis, komplementin məcburi iştirakı ilə antikorların təsiri altında hüceyrələrin əriməsidir. Reaksiya üçün sizə lazımdır:
1. Antigen - mikroblar, eritrositlər və ya digər hüceyrələr.
2. Antikor (lizin) - immun serum, nadir hallarda xəstənin serumu. Bakteriolitik serumda bakteriyaların parçalanmasında iştirak edən antikorlar var; hemolitik - qırmızı qan hüceyrələrinin parçalanmasına kömək edən hemolizinlər; spiroketlərin parçalanması üçün spiroketolizinlər, hüceyrələr - itolizinlər və s.
3. Tamamlayıcı. Ən çox serumda tamamlayır qvineya donuzları. Bu serum (bir neçə heyvanın qarışığı) adətən tamamlayıcı kimi istifadə olunur. Təzə (doğma) tamamlayıcı qeyri-sabitdir və qızdırmaq, silkələmək, saxlama zamanı asanlıqla məhv edilir, buna görə də alındıqdan sonra iki gündən çox olmayaraq istifadə edilə bilər. Komplementi qorumaq üçün ona 2% əlavə edilir. Bor turşusu və 3% natrium sulfat. Bu əlavə 4°C temperaturda iki həftəyə qədər saxlanıla bilər. Quru tamamlayıcı daha çox istifadə olunur. İstifadədən əvvəl izotonik məhlulda orijinal həcmə qədər həll edilir (etiketdə göstərilmişdir).
4. İzotonik məhlul.
Hemoliz reaksiyası(Cədvəl 19). Reaksiya üçün sizə lazımdır:
1. Antigen - 0,3 ml eritrosit çöküntüsü və 9,7 ml nisbətində yuyulmuş qoyun eritrositlərinin 3% suspenziyası. izotonik məhlul.
2. Antikor - qoyun eritrositlərinə qarşı hemolitik zərdab (hemolizin); adətən istehsalatda hazırlanır, liyofilləşir və titri etiketdə göstərilir.
Hemolizin titri, komplementin iştirakı ilə eritrositlərin 3% suspenziyasının tam hemolizinin baş verdiyi ən yüksək serum qatılmasıdır. Hemoliz reaksiyası üçün hemolizin üçqat titrdə alınır, yəni titrdən əvvəlkindən 3 dəfə az seyreltilir. Məsələn, serum titri 1:1200 olarsa, serum 1:400 nisbətində seyreltilir (0,1 ml serum* və 39,9 ml izotonik salin). Həddindən artıq hemolizin lazımdır, çünki onun bir hissəsi reaksiyanın digər komponentləri tərəfindən adsorbsiya oluna bilər.
* (0,1 ml-dən az serum qəbul edilməməlidir - ölçmə dəqiqliyi əziyyət çəkir.)
3. Komplement 1:10 nisbətində seyreltilir (0,2 ml komplement və 1,8 ml izotonik salin).
4. İzotonik məhlul.
Cədvəl 19. Hemoliz reaksiyasının sxemi
Nəticələrin uçotu. 1-ci sınaq borusunda düzgün qurulmuş reaksiya ilə hemoliz baş verəcək - məzmunu şəffaf olacaq. Nəzarətdə maye buludlu qalır: 2-ci boruda hemolizin başlanması üçün komplement çatışmır, 3-cü boruda hemolizin yoxdur, 4-cü boruda nə hemolizin, nə də komplement yoxdur, 5-ci boruda, antigen antikorla uyğun gəlmir,
Lazım gələrsə, hemolitik zərdab aşağıdakı sxemə uyğun olaraq titrlənir (cədvəl 20).
Titrləmədən əvvəl 1:100 (0,1 ml serum və 9,9 ml izotonik şoran məhlulu) ilkin zərdab seyreltməsi hazırlanır, ondan lazımi seyreltmələr hazırlanır, məsələn:
Bu seyreltmələrdən Cədvəldə göstərildiyi kimi titrləmə təcrübəsinin sınaq borularına 0,5 ml serum əlavə edilir. iyirmi.
Cədvəl 20. Hemolitik serum (hemolizin) üçün titrasiya sxemi
Cədvəldə verilmiş nümunədə. 20, hemolitik serumun titri 1:1200-dür.
Təzə hemolitik zərdab istifadə edərkən, onun tamamlayıcısını məhv etmək üçün təsirsiz hala gətirilməlidir. Bunu etmək üçün su banyosunda və ya termostatlı inaktivatorda 56 ° C-də 30 dəqiqə qızdırılır. Sonuncu üsul daha yaxşıdır: zərdabın həddindən artıq istiləşməsi, yəni onun denatürasiyası ehtimalını aradan qaldırır. Denatürləşdirilmiş sera test üçün uyğun deyil.
bakterioliz reaksiyası. Bu reaksiyada bakteriyalar uyğun (homoloji) serumun iştirakı ilə tamamlanır. Reaksiya sxemi mahiyyətcə hemoliz reaksiyasının sxeminə bənzəyir. Fərq ondadır ki, iki saatlıq inkubasiyadan sonra bütün sınaq boruları onun parçalandığını öyrənmək üçün təcrübədə götürülmüş mikroorqanizm üçün əlverişli mühitlə Petri qablarına səpilir. 2-5-ci sınaq borularından (nəzarət) məhsullarda düzgün qurulmuş təcrübə ilə bol artım olmalıdır. 1-ci sınaq borusundan (təcrübədən) mədəniyyətdə böyümənin olmaması və ya zəif böyüməsi mikrobların ölümünü, yəni onların antikorla homolog olduğunu göstərir.
Diqqət! Bakterioliz reaksiyası aseptik şəraitdə aparılmalıdır.
test sualları
1. İzotonik natrium xlorid məhlulu əvəzinə distillə edilmiş su istifadə edilərsə eritrositlərin vəziyyəti necə olacaq? Bu fenomenin əsasında nə dayanır?
2. Komplement olmadıqda eritrositlər homoloji immun zərdab ilə qarşılıqlı əlaqədə olduqda hansı reaksiya baş verəcək?
Məşq edin
Hemoliz reaksiyasını qurun. Nəticəni qeyd edin və çəkin.
Çöküntü reaksiyasında həll olunan antigendən (lizat, ekstrakt, hapten) və elektrolitlərin iştirakı ilə spesifik antikordan ibarət olan spesifik immun kompleks çökdürülür.
Bu reaksiya nəticəsində əmələ gələn buludlu halqa və ya çöküntü deyilir çöküntü. Bu reaksiya aqlütinasiya reaksiyasından əsasən antigen hissəciklərinin ölçüsünə görə fərqlənir.
Presipitasiya reaksiyası adətən bir sıra infeksiyaların (sibir yarası, meningit və s.) diaqnozunda antigeni müəyyən etmək üçün istifadə olunur; məhkəmə tibbində - qan, sperma və s. növlərini müəyyən etmək; sanitar-gigiyenik tədqiqatlarda - məhsulların saxtalaşdırılması aşkar edildikdə; onun köməyi ilə heyvanların və bitkilərin filogenetik əlaqəsini müəyyən edir. Reaksiya üçün sizə lazımdır:
1. Anticisimlər (presipitinlər) - antikorların yüksək titrinə malik immun zərdab (1:100.000-dən aşağı olmayan). Çöküntü zərdabının titri onun reaksiya verdiyi antigenin ən yüksək seyreltilməsi ilə müəyyən edilir. Serum adətən seyreltilmədən və ya seyreltilmiş şəkildə istifadə olunur 1:5 -1:10.
2. Antigen - zülal və ya lipoid polisaxarid xarakterli həll olunmuş maddələr (tam antigenlər və haptenlər).
3. İzotonik məhlul.
Çöküntü reaksiyasının aparılmasının əsas üsulları bunlardır: halqalı çökmə reaksiyası və agarda (gel) çökmə reaksiyası.
Diqqət! Yağış reaksiyasında iştirak edən bütün komponentlər tamamilə şəffaf olmalıdır.
Halqanın çökmə reaksiyası. Pasteur pipetindən istifadə etməklə 0,2 - 0,3 ml (5-6 damcı) zərdab çöküntü borusuna əlavə edilir (serum borunun divarlarına düşməməlidir). Antigen diqqətlə eyni həcmdə zərdabın üzərinə qatlanır, nazik Pasteur pipeti ilə sınaq borusunun divarı boyunca tökülür. Sınaq borusu maili vəziyyətdə saxlanılır. Düzgün təbəqələşmə ilə serum və antigen arasında aydın bir sərhəd əldə edilməlidir. Diqqətlə, mayeni qarışdırmamaq üçün sınaq borusunu ştativə qoyun. Reaksiyanın müsbət nəticəsi ilə antigen və antikorun sərhədində buludlu bir "halqa" meydana gəlir - bir çöküntü.
Agarda çökmə reaksiyası(gel). Reaksiyanın özəlliyi ondadır ki, antigenlə antikorun qarşılıqlı təsiri sıx mühitdə baş verir, yəni. gel. Nəticədə yaranan çöküntü mühitin qalınlığında buludlu bir zolaq verir. Bir bandın olmaması reaksiya komponentləri arasında uyğunsuzluğu göstərir. Bu reaksiya biotibbi tədqiqatlarda, xüsusən də difteriya törədicisində toksin əmələ gəlməsinin öyrənilməsində geniş istifadə olunur.
Lizis reaksiyası (immun sitolizi)
immun lizis- bu, tamamlayıcının məcburi iştirakı ilə antikorların təsiri altında hüceyrələrin əriməsidir. Reaksiya üçün sizə lazımdır:
1. Antigen mikroblar, eritrositlər və ya digər hüceyrələr.
2. Antikor(lizin) - immun serum, nadir hallarda xəstənin serumu. Bakteriolitik serumda bakteriyaların parçalanmasında iştirak edən antikorlar var; hemolitik - qırmızı qan hüceyrələrinin parçalanmasına kömək edən hemolizinlər; spiroketlərin parçalanması üçün spiroketolizinlər, hüceyrələr - itolizinlər və s. lazımdır.
3. tamamlayıcı.Ən çox qvineya donuzlarının serumunda tamamlayır. Bu serum (bir neçə heyvanın qarışığı) adətən tamamlayıcı kimi istifadə olunur.
4. İzotonik məhlul.