Реакции на аглутинација. Компоненти, механизам, методи на инсталација, апликација. Индиректна реакција на хемаглутинација. Кумбсова реакција. Реакција на коаглутинација. Реакција на инхибиција на хемаглутинација. Индиректна реакција на хемаглутинација Што е попрецизно: rnga или rpga
Индиректниот или пасивниот тест за хемаглутинација (IRHA или RPHA) е почувствителен и специфичен од тестот за аглутинација. Оваа реакција се користи и во две насоки.
1) За откривање на антитела во крвниот серум на пациентот, се користи еритроцитна дијагностика, во која антигенот се адсорбира на површината на еритроцитите третирани со танин. Во однос на оваа реакција почесто се користи терминот RPHA.
Тестниот серум се разредува во бунарите на пластични плочи и се додава еритроцитен дијагностички. Со позитивна реакција, по ѕидовите на дупката се појавува тенок филм во форма на „чадор од чипка“, со негативна реакција, се појавува густ талог на црвени крвни зрнца во форма на „копче“.
2) За откривање на токсини и бактериски антигени во материјалот за испитување, се користи дијагностика на антитела еритроцити, добиени со адсорпција на антитела на еритроцитите. Во однос на оваа реакција почесто се користи терминот RNGA. На пример, со помош на дијагностика на антитела, се откриваат антиген на бацил од чума, егзотоксин на дифтерија и ботулински егзотоксин.
Coombs тест (аптиглобулин тест)
Реакцијата се користи за откривање на нецелосни антитела, на пример, антитела на Rh факторот. Тест серумот се додава на Rh + еритроцитите, во кои се претпоставува присуство на нецелосни антитела на Rh факторот. Со прицврстување на црвените крвни зрнца, нецелосните антитела не предизвикуваат аглутинација, бидејќи тие имаат само еден активен центар. Потоа се додава антиглобулински серум кој содржи антитела на човечки глобулини. Во комбинација со нецелосни антитела, антиглобулинскиот серум предизвикува аглутинација на црвените крвни зрнца.
Реакција на врнежи
Суштината на реакцијата е седиментација (таложење) на антигенот под влијание на специфични антитела. За да се добие видлива реакција, неопходно е присуство на електролит. Антигенот во реакцијата на таложење се молекуларно дисперзирани супстанции.
Реакција на врнежи од прстенсместени во тесни цевки за врнежи. Имунолошкиот серум се истура во епрувета, а материјалот за испитување внимателно се поставува на неа. Ако во него има антиген, на границата на двете течности се формира непроѕирен прстен од талог.
Реакцијата се користи во судската медицина за одредување на видовите на протеини во дамки од крв, сперма итн.; да се утврди антигенот во дијагнозата на антракс (реакција на Асколи), менингитис и други инфекции; во санитарно-хигиенски студии - да се утврди фалсификување на прехранбени производи. Имунолошки преципитирачки серуми се добиваат со имунизација на животните со соодветниот антиген. На пример, серумот за таложење на човечки протеини се добива со имунизација на зајак со човечки протеин. Титарот на серумот што преципитира е највисокото разредување на антигенот со кој тој реагира. Серумот обично се користи неразреден или во разредување од 1:5.
Реакција на таложење на агар гелсе врши со користење на неколку методи. Тоа се двојна имунодифузиона реакција, реакција на радијална имунодифузија и реакција на имуноелектрофореза.
Двојна реакција на имунодифузија(според Ouchterlony). Растопениот агар гел се истура во петриева чинија и по стврднувањето во него се сечат бунари. Во некои бунари се става антиген, а во други имуни серуми, кои се дифузираат во агарот и формираат талог во форма на бели ленти на местото на средба.
Реакција на радијална имунодифузија(според Манчини). Имунолошкиот серум се додава во стопениот агар гел и се истура во чаша. По стврднувањето на агарот, се отсекуваат бунари и во нив се ставаат антигени, кои, дифузирани во агарот, формираат зони за врнежи во облик на прстен околу бунарите. Колку е поголема концентрацијата на антигенот, толку е поголем дијаметарот на прстенот. Реакцијата се користи, на пример, за одредување на имуноглобулини од различни класи во крвта. Имуноглобулините од класите IgG, IgM, IgA дејствуваат како антигени во оваа реакција, а антителата против нив се содржани во специфичните монорецепторни серуми.
Имуноелектрофореза.Електрофорезата на протеинските антигени се изведува во агар гел. Преципитирачкиот серум се внесува во жлебот, кој оди паралелно со насоката на движење на протеините. Антигените и антителата се дифузираат во агарот и линиите за таложење се формираат таму каде што се спојуваат.
Реакции на имунолошка лиза
Антиген (еритроцити или бактерии), комбинирајќи се со специфични антитела, формира имун комплекс на кој се прикачува комплементот (C1) и комплементот се активира по класичната патека. Активираниот комплемент ги лизира црвените крвни зрнца (хемолиза) или бактериите (бактериолиза). Реакцијата на бактериолиза се користи за да се идентификува Vibrio cholerae.
Реакција на хемолиза.Антигенот во реакцијата се еритроцити, антитела (хемолизини) се содржани во хемолитичкиот серум. Хемолизините се прикачуваат на црвените крвни зрнца и се активира комплементот, кој ги лизира црвените крвни зрнца. Заматената суспензија на црвените крвни зрнца се претвора во проѕирна светло-црвена течност - „лак крв“. Бидејќи реакцијата на хемолиза се јавува само во присуство на комплемент, таа се користи како индикатор за откривање на комплементот.
Локална реакција на хемолиза во гелот(Реакција на Ерне) - варијанта на реакцијата на хемолиза. Служи за одредување на бројот на клетки кои формираат антитела (AFC) во слезината и лимфните јазли.
Стопениот агар гел се меша со суспензија на клетки од слезина и црвени крвни зрнца, а откако агарот ќе се зацврсти, се додава комплемент. Околу секоја клетка што произведува хемолизин се формира зона на хемолиза. Бројот на клетки кои произведуваат хемолизин се одредува според бројот на такви зони.
Директна реакција на микробна аглутинација (РА). Во оваа реакција, антителата (аглутинини) директно ги аглутинираат корпускуларните антигени (аглутаногени). Тие обично се претставени со суспензија на инактивирани микроорганизми (реакција на микробна аглутинација). Врз основа на природата на формираниот аглутинат, се разликуваат грануларна и флокулентна аглутинација. Грануларната аглутинација се јавува кога микробите кои содржат О-антиген се лепат заедно. Бактериите со флагели (H-антиген) се аглутинираат за да формираат големи снегулки.
За да се одреди типот на микроорганизми, се користат стандардни дијагностички аглутинирачки серуми. Тие се добиваат со хиперимунизација на лабораториски животни со суспензија на бактерии. Титарот на таков серум е неговото највисоко разредување при кое се забележува јасна аглутинација на соодветниот антиген. Сепак, поради сложеноста на антигенската структура на бактериите, аглутинирачките серуми содржат антитела не само за специфичните видови, туку и за групните антигени и може да дадат групна аглутинација со сродни видови бактерии. Титрите на антителата на антигени специфични за видовите во серумот се секогаш повисоки отколку на групните антигени. За да се отстранат групните специфични антитела, микроорганизмите што содржат групни антигени секвенцијално се додаваат во серумот (метод Кастелани). Овој метод произведува адсорбирани серуми кои содржат антитела на специфичен тип на микроби.
Методи на реакција на аглутинација.Најчести се ламеларни (приближни) и проширени РА.
Плочата RA се става на стаклото. Во оваа реакција се користат малку разредени или неразредени серуми. Се користи како забрзан метод за откривање на антитела или за идентификација на микроорганизми. На чашата се нанесува капка серум, во која со јамка се внесува непозната бактериска култура, се меша и по 2-3 минути се забележува појава на ситно зрнеста или ронлива аглутинација. За контрола се користи капка солен раствор во кој се забележува заматеност по додавање на бактерии. При користење на неадсорбирани серуми, реакцијата на стаклото е само индикативна.
Проширената РА се изведува во епрувети или плочести бунари. Во овој случај, дијагностичкиот серум се разредува до титар и се додаваат еднакви количини на антиген. Ако резултатот е позитивен, на дното на епрувета се формира лабав талог во форма на „чадор“, а ако резултатот е негативен, се формира талог во форма на „копче“. Бидејќи титрите на групните специфични антитела во серумот се многу пониски од титрите на антителата специфични за видовите, групните реакции се забележани само во мали разредувања на серумот. Ако аглутинацијата се случи пред титарот или до половина од титарот на серумот, тоа е специфично за видот.
За да се утврдат антителата во серумот на пациентот (серолошка дијагноза), се користи стандарден микробиолошки дијагностички, кој содржи суспензија на познати микроби или нивни антигени. Во овој случај, исто така е можно да се инсталира плоча и распоредена RA.
Директна реакција на аглутинација на клетките. За да се одредат крвните групи, се користат стандардни серуми на донаторска крв кои содржат познати анти-А или анти-Б антитела. Реакциите се изведуваат на стакло или чинии. Ако еритроцитите имаат А (втора крвна група), Б (трета крвна група) или двата антигени (четврта крвна група), соодветните серуми ги аглутинираат еритроцитите. Се користи и тест за компатибилност на крвта, каде капките крв од донаторот и примателот се мешаат и се проценува аглутинацијата.
Клиниките ја користат реакцијата на аглутинација на леукоцити, тромбоцити и други клетки за да ги идентификуваат автоантителата, како и да ги одредат антигените на овие клетки.
Реакцијата на хемаглутинација се заснова на феноменот на лепење на црвените крвни зрнца, што се јавува под влијание на различни фактори. Постојат директна и индиректна хемаглутинација.
Во реакцијата на директна хемаглутинација, црвените крвни зрнца се лепат кога одредени антигени, како што се вирусите, се адсорбираат врз нив.
Индиректна (пасивна) реакција на хемаглутинација (IRHA, RPHA)се заснова на употребата на еритроцити (или латекс) со антигени или антитела адсорбирани на нивната површина, чија интеракција со соодветните антитела или антигени на крвниот серум на пациентите предизвикува еритроцитите да се залепат и да испаднат на дното на епрувета или клетка во вид на талог на гребенот.
Компоненти.За да се изврши RNGA, може да се користат еритроцити од овци, коњи, зајаци, кокошки, глувци, луѓе и други, кои се складираат за идна употреба со нивно третирање со формалдехид или глутаралдехид. Адсорпциониот капацитет на еритроцитите се зголемува кога тие се третираат со раствори на танин или хром хлорид.
Антигени во RNGA може да бидат полисахаридни антигени на микроорганизми, екстракти од бактериски вакцини, антигени на вируси и рикеции, како и други супстанции.
Црвените крвни зрнца сензибилизирани од хипертензија се нарекуваат еритроцитни дијагностички. За подготовка на еритроцитен дијагностички најчесто се користат овчи еритроцити кои имаат висока адсорбирачка активност.
Апликација. RNGA се користи за дијагностицирање на заразни болести, одредување на гонадотропен хормон во урината при утврдување на бременост, за идентификување на хиперсензитивност на лекови, хормони и во некои други случаи.
Во серолошките студии, се користи директна реакција на инхибиција на хемаглутинација, кога вирусот изолиран од пациент се неутрализира со специфичен имунолошки серум, а потоа се комбинира со црвени крвни зрнца. Отсуството на хемаглутинација укажува на конзистентноста на вирусот и имунолошкиот серум што се користи.
Индиректната реакција на хемаглутинација (пасивна хемаглутинација) се забележува во случаи кога имунолошкиот серум или серумот на пациентот кој содржи соодветни антитела се додава на црвените крвни зрнца кои претходно биле третирани (чувствителни) со различни антигени. Се јавува специфично лепење на црвените крвни зрнца, нивна пасивна хемаглутинација.
Индиректната или пасивната реакција на хемаглутинација е супериорна по чувствителност и специфичност во однос на другите серолошки методи и се користи во дијагнозата на инфекции предизвикани од бактерии, рикеција и протозои.
Методот за изведување на индиректна хемаглутинирана реакција се состои од неколку фази.
· Прво, црвените крвни зрнца се мијат со изотоничен раствор на натриум хлорид, а потоа, доколку е потребно (при употреба на протеински антигени), тие се третираат со раствор од танин од 1: 20.000 и се сензибилизираат со растворливи антигени.
· По миење со пуфериран изотоничен раствор на натриум хлорид, еритроцитниот антиген е подготвен за употреба.
· Тест серумите се разредуваат со изотоничен раствор на натриум хлорид во епрувети или специјални пластични плочи со бунари, а потоа на секое разредување на серумот се додава еритроцитен дијагностички.
· Резултатите од индиректната реакција на хемаглутинација се земени во предвид според природата на седиментот на црвените крвни зрнца формиран на дното на епрувета.
· Резултатот од реакцијата во кој црвените крвни зрнца рамномерно го покриваат целото дно на епрувета се смета за позитивен. Во негативна реакција, црвените крвни зрнца во форма на мал диск или „копче“ се наоѓаат во центарот на дното на епрувета.
· По 2 часа инкубација на 37 °C, се земаат предвид резултатите, се проценува изгледот на седиментот на црвените крвни зрнца (без тресење): со негативна реакција, седиментот се појавува во форма на компактен диск или прстен на дното на бунарот; со позитивна реакција, се појавува карактеристичен чипкаст талог на црвени крвни зрнца, тенок филм со нерамни рабови
Реакција на коаглутинација.
Оваа реакција се заснова на уникатното својство на Staphylococcus aureus, кој содржи протеин А во неговиот клеточен ѕид, да се врзува за Fc фрагментите на IgG и IgM.
Во овој случај, активните центри на антитела остануваат слободни и можат да комуницираат со специфични детерминанти на антигени. Капка од 2% суспензија на стафилококи, сензибилизирана со соодветни антитела, се нанесува на стаклена табла и се додава капка од суспензијата на бактериите што се проучуваат. Ако антигенот се совпаѓа со антителата, јасна аглутинација на стафилококите натоварени со антитела се јавува во рок од 30-60 секунди.
Барања за имунолошкиот серум што се користи за сензибилизирање на стафилококните клетки и спроведување на процесот на сензибилизација. За да се добие коаглутинирачки реагенс, суспензијата на стафилококи треба да се третира со имунолошки серум против саканиот антиген. Серумот мора да се земе од животно чиј IgG има афинитет за протеинот А. Имуноглобулините на луѓето, свињите, кучињата и заморчињата имаат најголем афинитет кон него, најмалку - магаре и зајак, а IgG на овци, коњи, стаорци и глувци комуницираат со него многу слабо.
Покрај строгата специфичност за саканиот антиген, серумот што се користи во RCOA не треба да содржи антитела за стафилокок за да се избегне аглутинација на стафилококниот реагенс поради специфичниот ефект на антигенот и антителата, кои треба да се исклучат во протеинот IgG. Систем. Контролата се спроведува со мешање на една капка серум и 10% суспензија на стафилококен реагенс на чаша. Ако по 3...5 минути не се формираат аглутинирани снегулки, тогаш серумот се смета за погоден за реакција.
Ако достапните серумски примероци на овој антиген аглутинираат стафилокок, тогаш тие може да се адсорбираат со суспензија на стафилококни клетки кои немаат протеин А (на пример, соеви Вуд-46). На овој начин се отстрануваат антителата кои реагираат со стафилокок поради фрагментите на Fab.
Така, серумот што се користи за подготовка на реагенсот за коаглутинирање мора да ги исполнува следниве барања:
- добиени од животно-производител чиј IgG има афинитет за протеинот А;
- мора да има специфичност за саканиот антиген;
- да бидат ослободени од анти-стафилококни антитела.
· Подготовка на дијагностика. Подготвениот 10% стафилококен реагенс се комбинира со еднаков волумен на имунолошкиот серум во претходно определеното оптимално работно разредување. Смесата се протресува 60 минути на 40...42 °C во шатгел апарат со 90 вибрации во минута. Потоа, по 15 минути, тие се мијат двапати со PBS, повторно се суспендираат до 2% суспензија и се конзервираат со натриум мертиолат (1: 10.000).
Лекција 14
Тема: Индиректни серолошки реакции. Индиректни реакции на хемаглутинација (IRHA), фиксација на комплементот (IFR).
Антитела
Антителата се протеински молекули способни конкретно да се врзат за антигени. Антителата припаѓаат на гама глобулините. Друго име за антитела е имуноглобулини. Кај цицачите, постојат 5 класи на имуноглобулини, кои се разликуваат по нивната структура и некои својства: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.
Структурата на имуноглобулините. IgG ја има „најтипичната“ структура. Молекулата се состои од 4 протеински синџири: два лесни (L) и две тешки (H), кои се поврзани со дисулфидни врски. Регионот на антителото што се врзува за антигенот се нарекува активно место на антителото. Во молекулата на IgG има 2 активни центри. Таа е формирана од N-терминалните региони на тешките и лесните синџири. Регионот на тешките синџири лоциран во близина на дисулфидните врски се нарекува регион на шарки. Со помош на ензимот папаин, молекулата на IgG над регионот на шарката се дели на 3 фрагменти: 2 од нив содржат лесен синџир и дел од тешкиот синџир (Fab фрагменти); а третиот фрагмент се состои само од дел од тешките синџири (Fc фрагмент). Благодарение на подвижниот регион на шарките, фрагментите од Fab можат да ја променат нивната релативна положба во просторот.
Амино киселинските секвенци на лесни и тешки синџири се поделени на константни и променливи региони. Променливите региони се наоѓаат на N-крајот на лесните и тешките синџири (VL и VH). Константни региони се наоѓаат на C-крајот на синџирите (CL и CH). Во лесни и тешки синџири, секвенците на амино киселини формираат неколку топчести структури наречени домени.
Активниот центар на антителото е формиран од променливите домени на лесниот и тешкиот синџир и е празнина ( паратоп), имајќи одредена конфигурација и дистрибуција на електрични полнежи на неговата површина. Големината, обликот и распределбата на полнежот на активното место ја одредуваат неговата специфичност, односно способноста да се врзе за специфична антигенска детерминанта ( епитоп), имајќи комплементарна структура.
Антигенските детерминанти се области кои штрчат на површината на молекулите на антигенот. Затоа, интеракцијата епитоп-паратоп се јавува според принципот „заклучување на клучот“.
Јачината на врската помеѓу активниот центар на антитела и антигенската детерминанта се карактеризира со концептот на афинитет. Афинитете мерка за афинитетот на активното место и антигенската детерминанта.
Имуноглобулините од класата IgG сочинуваат 75% од вкупната количина на серумски имуноглобулини. Важно својство на IgG е неговата способност да помине низ плацентата. Така, мајчините антитела влегуваат во телото на детето и го штитат во првите месеци од животот од инфекција (природен пасивен имунитет).
Околу 10% од вкупниот фонд на имуноглобулини припаѓа на класата IgM. Молекулата IgM е пентамер, односно се состои од 5 идентични молекули, слични по структура на молекулата на IgG и има 10 активни центри. Подединиците се поврзани една со друга со дисулфидни врски. Молекулата IgM има дополнителен J синџир што ги поврзува подединиците. IgM антителата не ја преминуваат плацентарната бариера.
Антителата од класата IgA сочинуваат 15-20% од вкупната содржина на имуноглобулините. Молекулата на IgA се состои од 2 лесни и 2 тешки синџири и има 2 активни центри. Во крвниот серум, IgA е присутен во мономерна форма, додека во секретите на мукозните мембрани, IgA е претставен во форма на димери и се нарекува секреторен или sIgA и има 4 активни центри. С-крајот на тешките синџири во молекулата sIgA се поврзани едни со други со J-синџир и протеинска молекула наречена секреторна компонента. Секреторната компонента го штити sIgA од распаѓање со протеолитички ензими, кои се содржани во големи количини во секретите на мукозните мембрани. Главната функција на sIgA е да ги заштити мукозните мембрани од инфекција. IgA не продира во плацентарната бариера. Високи концентрации на sIgA се наоѓаат во мајчиното млеко, особено во првите денови од лактацијата. Тие го штитат гастроинтестиналниот тракт на новороденчето од инфекција.
IgD главно се наоѓа на мембраната на Б-лимфоцитите. Тие имаат структура слична на IgG, 2 активни центри. Биолошката улога не е целосно позната.
IgE - концентрацијата на оваа класа на имуноглобулини во крвниот серум е исклучително ниска. IgE молекулите се главно фиксирани на површината на мастоцитите и базофилите. IgE е сличен во структурата на IgG и има 2 активни центри. Се претпоставува дека IgE е од суштинско значење во развојот на антихелминтскиот имунитет. IgE игра голема улога во патогенезата на некои алергиски болести (бронхијална астма, поленска треска) и анафилактичен шок.
Индиректна реакција на хемаглутинација
Во индиректните серолошки реакции, комплексот на антигени со антитела не е видлив со голо око. Во такви случаи, антигените се адсорбираат на поголеми честички носители (еритроцити, честички од латекс), со што се добива антигенски еритроцитен дијагностички. Последователната аглутинација на таквите честички со специфични антитела овозможува аглутинатот (талогот) да се види со голо око. Индиректната (пасивна) реакција на хемаглутинација (IRHA) детектира антитела во крвниот серум користејќи го антигенскиот еритроцитен diagnosticum, што е еритроцити со антигени адсорбирани на нив.
Црвените крвни зрнца со антигени адсорбирани на нив се во интеракција со соодветните антитела во крвниот серум, што предизвикува црвените крвни зрнца да се залепат заедно и да испаднат до дното на епрувета или клетката во форма на талог на лупење. Во негативна реакција, црвените крвни зрнца се таложат во форма на копче.
RNGA се става во пластични таблети или во епрувети со разредување на крвниот серум, на кој се додава еритроцитен дијагностички.
Понекогаш се користи антитела еритроцитна дијагностика - црвени крвни зрнца на кои се адсорбираат антителата. Оваа реакција се нарекува RONGA - обратна индиректна реакција на хемаглутинација.
RNGA компоненти:
Крвен серум на пациентот (разреден 1:25);
Дијагностика на еритроцитите (еритроцити оптоварени со антигенот на патогенот што се проучува);
Раствор за миење.
Изведена од RNGA. Две капки раствор на фосфатен пуфер се додаваат во седум бунари на плочата за имунолошки студии. Во првиот бунар се додаваат две капки од крвниот серум на пациентот, по што 2 капки се префрлаат од првиот бунар во вториот бунар, од вториот во третиот итн. 2 капки се вадат од шестиот бунар. Додадете 2 капки еритроцитен дијагностички на сите седум бунари (6 експериментални и 1 контролна). По секоја операција, потребно е да се исплакне пипетата во раствор за перење. Плочите се оставаат на собна температура 45 минути, по што се запишуваат резултатите.
Реакција на фиксација на комплементот
Реакцијата на фиксација на комплементот е дека кога антигенот се комбинира со антитело, се формира имун комплекс, на кој комплементот е прикачен преку Fc фрагментот на антителата. Ако комплексот антиген-антитела не е формиран, тогаш комплементот останува слободен. Слободниот комплемент се открива со додавање во смесата хемолитички систем кој се состои од црвени крвни зрнца од овци и антитела против нив. Позитивна реакција е отсуството на хемолиза како резултат на врзување на комплементот со комплексот антиген + антитела. Негативна реакција е присуството на хемолиза како резултат на врзување на комплементот со комплексот еритроцити + анти-еритроцитни антитела.
RSK компоненти:
Здрав крвен серум;
Крвен серум на пациентот (разреден 1:5);
Антигенската компонента на реакцијата е инактивиран патоген;
Дополнете во разредување кое одговара на работната доза. Комплементот се добива од крвниот серум на заморчиња. Титарот на комплементот е неговата минимална доза, која во присуство на хемолитички серум предизвикува целосна хемолиза на црвените крвни зрнца. Работната доза на комплементот што се користи во производството на RSC е 30% поголема од нејзиниот титар;
Хемолитичкиот систем е суспензија на еритроцити од овци третирани со антитела на зајаци кон еритроцитите на овците.
Раствор за миење.
Изведена од РСК. RSC се става во две епрувети - експериментални и контролни. Во епрувета се додава 0,5 ml од крвниот серум на пациентот, во контролната епрувета се додава 0,5 ml од крвниот серум на здрав донор, во двете епрувети се додава 0,5 ml од лизатот на патогенот, како и 0,5 ml од дополнување. По секоја операција, потребно е да се исплакне пипетата во раствор за перење. Цевките се ставаат во термостат на 37°C 30 минути. По инкубацијата, во двете епрувети се додава 1,0 ml хемолитички систем. Цевките се протресуваат и се ставаат во термостат на 37°C 30 минути. Доколку реакцијата е позитивна, доаѓа до доцнење на хемолизата во епрувета (безбојна течност и седимент на црвени крвни зрнца), а во контролната епрувета доаѓа до хемолиза на црвените крвни зрнца.
Литература за подготовка за лекцијата:
1. Борисов микробиологија, вирусологија, имунологија. М., 2002 година.
2. Медицинска микробиологија, вирусологија и имунологија. Ед. . М., 2004 година.
3. Поздеев микробиологија. М., ГЕОТАР-МЕДИА, 2005 г.
Се заснова на фактот дека црвените крвни зрнца, на кои претходно се адсорбираат антигени, стекнуваат способност да се аглутинираат во присуство на хомологни серуми (антитела).
Во овој случај, црвените крвни зрнца делуваат како носители со специфични детерминанти, чија аглутинација се јавува како резултат на реакцијата на антиген + антитела.
Црвените крвни зрнца на чија површина се цврсто прикачени антигените се нарекуваат еритроцитен антиген diagnosticum, или еритроцити сензибилизирани со антиген.
Друг тип на RNGA - антитела се адсорбираат на површината на еритроцитите и нивната последователна аглутинација се јавува во присуство на хомологен антиген. Во овој случај, таквите еритроцити се нарекуваат еритроцитни антитела diagnosticum, или еритроцити сензибилизирани од антитела.
Врз основа на овие два фундаментални методолошки пристапи, многу модификации на RNGA се развиени и користени. Така, мали стандардни честички од латекс се користат како носители. Во овој случај, реакцијата се нарекува реакција на аглутинација на латекс (RLA) или се користи Staphylococcus aureus - реакција на коаглутинација итн. Обично, еритроцитната дијагностика се подготвува во претпријатијата од биолошката индустрија, а главното искуство на RNGA се спроведува во дијагностички лаборатории.
Подготовката на дијагностика на еритроцитите ги вклучува следните чекори:
- фиксација на црвените крвни зрнца со формалдехид или глутарични или акрилни алдехиди. Вака третираните црвени крвни зрнца се чуваат долго време. Почесто за таа цел се користат еритроцити од овци, луѓе, кокошки и сл.
- третман на фиксирани еритроцити со раствор од танин. Како резултат на тоа, црвените крвни зрнца стекнуваат способност неповратно да ги адсорбираат протеините (вируси и антитела) на нивната површина;
- сензибилизација на танизирани еритроцити од вируси или антитела.
Треба да се напомене дека методите за подготовка на еритроцитна дијагностика за вирусни инфекции се различни.
Постапката за спроведување на RNGA за откривање и одредување на титар на антитела е како што следува:
- еднакви дози на еритроцити сензибилизирани со антиген се додаваат на последователни 2-кратни разредувања на серумот;
- смесата се остава 2-3 часа на собна температура или 16-18 часа на 4 °C;
- земете ги предвид резултатите. Ако серумот содржи антитела на вирусот со кој се сензибилизирани црвените крвни зрнца, се забележува хемаглутинација, која се проценува во вкрстувања.
Титарот на антителата во серумот се смета за највисоко серумско разредување кое сепак обезбедува хемаглутинација за најмалку два вкрстувања.
RNGA е придружена со сите релевантни контроли. Обично реакцијата се изведува со помош на микрометод.
RNGA ви овозможува да ги решите следниве дијагностички проблеми:
- откривање на антитела и одредување на нивниот титар во крвниот серум користејќи познат еритроцитен антиген diagnosticum;
- откривање и идентификување на непознат вирус користејќи позната дијагностика за еритроцитни антитела.
Предности на RNGA: висока чувствителност, едноставност на техниката на поставување и брзина на одговор. Сепак, важно е да се забележи дека се јавуваат големи тешкотии при подготовката на стабилна дијагностика на еритроцитите (голема зависност од чистотата на употребените компоненти, потребата да се избере начин на фиксација, танизација и сензибилизација на еритроцитите за секој тип на вирус).
Веб-страницата обезбедува референтни информации само за информативни цели. Дијагнозата и третманот на болестите мора да се спроведуваат под надзор на специјалист. Сите лекови имаат контраиндикации. Потребна е консултација со специјалист!
Серолошки анализа на крвтае метод за лабораториско тестирање на одредени антигени или антитела ( специфични протеини) во крвниот серум на пациентот, врз основа на имунолошките одговори на телото. Овој метод се користи кога дијагностиказаразни болести за откривање на присуство на антитела во крвта на пациентот за одреден тип на вирус или бактерии, како и за одредување на крвната група.Материјал што се проучува
Пред сè, за серолошка анализа се користи биолошки материјал собран од пациентот:- крвен серум
- плунка
- фекална материја
- почвата
Начин на анализа или земање крв
Оваа анализа не бара посебна подготовка на пациентот. Земањето крв се врши наутро на празен стомак и се врши во просториите за третман на медицинските установи, според општо прифатените хематолошки методи. За серолошко тестирање, крвта се собира со помош на два методи: венска крв се зема од улнарната вена на пациентот, а капиларна крв се зема од прстенестиот прст. Крвта се става во стерилни затворени цевки.Карактеристики на транспорт на крв и складирање на серум
Веднаш по собирањето на крвта се транспортира во посебна лабораторија каде истиот ден се подготвува серум. Сурутката може да се чува не повеќе од 4-6 дена во фрижидер на температура од 2-4 степени. Ако е потребно подолго складирање, сурутката се замрзнува. За да се избегне загрозување на квалитетот на сурутката, дозволено е да се замрзне еднаш и, соодветно, да се одмрзне. За време на долгорочно складирање, антителата ги губат своите својства и стануваат делумно неактивни; имуноглобулините од класата се најчувствителни на замрзнување М. По одмрзнувањето на серумот, потребно е темелно да се измеша додека не се изедначи, што помага да се врати концентрацијата на антителата содржани во овој серум.
За што се користат серолошките тестови?
Серолошки лабораториски дијагностички методи се користат за да се идентификуваат болести како што се ехинококоза, трихиноза, токсокароза, описторхијаза, цистицеркоза, токсоплазмоза, амебијаза, џардијаза, да се утврди ефективноста на текот на лекувањето и, конечно, да се открие повторлива болест откако пациентот целосно ќе закрепне.Основни методи на серолошка дијагноза
Реакција на имунофлуоресценција (RIF)
Оваа реакција е индиректна верзија на серолошки тест, односно се спроведува во две фази. Во првата фаза, потребните антитела се идентификуваат во циркулирачкиот комплекс антиген-антитело со користење на антиглобулин, кој е сличен по структура на имуните серумски протеини. Идентификацијата на саканото антитело е можна и со проучување на претходно подготвен антигенски препарат под флуоресцентен микроскоп, без употреба на антиглобулини.Реакцијата на имунофлуоресценција е многу трудоинтензивен процес кој бара многу време и одговорност од специјалист. Реакцијата започнува со подготовка на раствори, потоа серумите и нивните контролни примероци се титрираат ( процес кој ви овозможува да ја одредите содржината на одредена супстанција со постепено мешање на растворот за тестирање со контролирана количина на реагенсот). Претходно подготвените разредувања и нивните контролни примероци внимателно се нанесуваат на стаклените слајдови со антигенот. Потоа препаратите се инкубираат, потоа миење и сушење на воздух. На слајдовите со антигенот се нанесува тенок слој антисерум, по што се врши секундарна инкубација на препаратите и се повторува целиот претходен синџир на дејства, завршувајќи со сушење на препаратот. Како резултат на тоа, препаратот на стаклен слајд се третира со глицерол и се испитува под флуоресцентен микроскоп.
Резултатите од реакцијата се оценуваат на скала од четири точки, која се карактеризира со интензитетот на површинскиот жолто-зелен сјај на антигенските клетки:
+
многу слаб сјај на клетката, забележлив само на нејзината периферија
++
слаб сјај на периферијата на клетките, но со јасно забележлива зелена нијанса
+++/++++
светло зелен сјај на периферијата на клетките
Титарот на реакцијата се смета за серумско разредување каде што најмалку 50% од антигенските клетки покажуваат јасен површински сјај, односно резултат на реакцијата +++
или ++++
. Вредноста на опсегот на реакцијата е од 1/80 до 1/100.
Интензитетот на реакцијата зависи од бројот на преципитирани црвени крвни зрнца на дното на формираните дупки:
–
негативна реакција, која се карактеризира со таложење на црвени крвни зрнца на дното на бунарите во форма на мал прстен со мазни рабови или „копче“
+
низок интензитет, оваа реакција се карактеризира со мали единечни наслаги на дното на дупката. Неаглутинирани црвени крвни зрнца формираат „мал прстен“ во центарот на бунарот
++
среден интензитет, се карактеризира со формирање на „широк густ прстен“ на не-аглутинирани еритроцити на дното на дупката
+++
интензивна реакција, аглутинираните еритроцити формираат таканаречени „чадори“, во чиј центар се јасно видливи прстени формирани од населени неаглутинирани еритроцити.
++++
остро интензивна реакција во која сите црвени крвни зрнца се аглутинираат и, формирајќи „чадори“, го обложуваат дното на бунарите.
Титарот на оваа реакција се смета за последното серумско разредување при кое е откриена очигледна аглутинација на еритроцитите барем +++
, односно со интензивна или нагло интензивна реакција.
Веродостојноста и квалитетот на серолошките дијагностички методи зависат од организацијата на внатрешна и надворешна лабораториска контрола, која се состои од неколку независни процедури дизајнирани да го проценат квалитетот на резултатите од анализата.