Dobivanje interferona genetskim inženjeringom. Metoda za proizvodnju humanog imunog interferona. Mikotoksini i antibiotici

10267 0

Biosinteza somatotropina i drugih humanih hormona

Ljudski hormon rasta, ili somatotropin, sintetizira se u ljudskom mozgu u prednjoj hipofizi. Prvi put je izolovan iz kadaveričnih materijala i pročišćen 1963. Uz nedostatak somatotropina razvija se hipofizni patuljastost, čija se učestalost procjenjuje na 7 do 10 slučajeva na milion ljudi.

Hormon je specifičan za vrstu, odnosno, za razliku od inzulina, životinjski hormoni rasta nemaju aktivnost u ljudskom tijelu. Shodno tome, jedini lijek za hipofizni patuljastost je hormon hipofize, koji je izoliran iz leševa. Istraživanja su pokazala da intramuskularna primjena somatotropina u dozama od 10 mg po 1 kg tjelesne težine tijekom godine, tri injekcije tjedno, povećava visinu za otprilike 8-18 cm godišnje.

Bolesna djeca od četiri do pet godina, uz kontinuirano liječenje, do puberteta sustigla rast sa svojim vršnjacima (14-16 godina). Ako uzmemo u obzir činjenicu da se iz jednog leša može dobiti 4-6 mg somatotropina, onda možemo shvatiti da je liječenje ove bolesti prirodnim somatotropinom potpuno beznadežno. Osim nedostatka lijeka, pojavili su se i drugi problemi vezani za heterogenost hormona koji se oslobađa iz trupnog materijala.

Postojala je i opasnost da materijal hipofize bude inficiran spororastućim virusima. Takvi virusi imaju neuobičajeno dug period inkubacije, pa su djeca koja su primala lijek zahtijevala višegodišnji medicinski nadzor.

Ljudski hormon rasta, sintetiziran u posebno dizajniranim bakterijskim ćelijama, ima očigledne prednosti: dostupan je u velikim količinama, njegovi preparati su biohemijski čisti i bez virusnih kontaminanata.

Biosintezu somatotropina (koji se sastoji od 191. aminokiselinskog ostatka) od strane posebno dizajniranih bakterija na bazi Escherichia coli izveo je Genentech. Budući da sinteza DNK u mRNA proizvodi gen koji kodira prekursora somatotropina, koji se ne cijepa u bakterijskim stanicama da bi nastao aktivni hormon, postupili smo na sljedeći način: u 1. fazi klonirali smo dvolančanu DNK kopiju mRNA i, cijepanjem restrikcijskim endonukleazama, dobio sekvencu koja kodira cjelokupnu sekvencu aminokiselina hormona, osim prve 23 aminokiseline. Zatim je kloniran sintetički polinukleotid koji odgovara aminokiselinama 1 do 23. Zatim su dva fragmenta spojena zajedno i "prilagođena" u plazmid E. coli, nakon čega su bakterijske ćelije počele sintetizirati ovaj hormon.

Do 1980. godine završena su klinička ispitivanja lijekova i testova toksičnosti i započeli su masovni eksperimenti na djeci blizu puberteta. Rezultati su bili ohrabrujući, a sintetički somatotropin je počeo da se proizvodi u industrijskim razmjerima 1982. godine.

Drugi hormon, β-endorfin, moždani opijat koji se sastoji od 31. aminokiseline, sintetiziran je u genetski modifikovanim ćelijama E. coli. Godine 1980. australski naučnik Shine i američki naučnici Fettes, Len i Baxter uspješno su klonirali DNK koja kodira β-endorfin u ćelijama E. ooli i dobili ovaj polipeptid kao fuzioni protein sa enzimom β-galaktozidazom. U prvoj fazi, klonirali su fragment DNK dobijen kao rezultat reverzne transkripcije mRNA koja kodira β-endorfin, a zatim ga ubacili u plazmid E. coli iza gena β-galaktozidaze, čime su dobili hibridni protein koji se sastoji od β- galaktozidaza i β-endorfin; zatim je β-galaktozidaza enzimski cijepana, čime se dobija biološki aktivan β-endorfin.

Dobijanje interferona

Još jedno izuzetno dostignuće genetskog inženjeringa je sinteza interferona.

Interferon je prvi put nabavljen 1957. godine na Nacionalnom institutu za medicinska istraživanja u blizini Londona. Ovo je protein koji u vrlo malim količinama oslobađaju životinjske i ljudske ćelije kada virusi uđu u tijelo i usmjeren je na borbu protiv njih. Prve studije su otkrile visoku biološku aktivnost interferona u liječenju gripe, hepatitisa, pa čak i raka (suzbija proliferaciju abnormalnih stanica).

Interferon, kao i somatotropin, ima specifičnost vrste: životinjski interferoni su neaktivni u ljudskom tijelu, pa ih čak i odbija.

Ljudsko tijelo proizvodi nekoliko vrsta interferona: leukocit (a), fibroblast (P) i imunološki (y) (T-limfocit).

Prirodni interferoni se dobijaju iz ljudske krvi sa izuzetno malim prinosom: 1978. godine u Centralnoj zdravstvenoj laboratoriji u Helsinkiju (u to vreme svetski lider u proizvodnji leukocitnog interferona) iz 50 hiljada litara krvi dobijeno je 0,1 g čistog interferona. .

Proces proizvodnje interferona bio je u osnovi isti za sve vrste ćelija koje se uzgajaju u kulturama i proizvode interferon. Krvne ćelije su inficirane Sendai virusom i filtrirane u supercentrifugi nakon 24 h. Supernatant je sadržavao sirovi pripravak interferona koji je podvrgnut hromatografskom prečišćavanju.

Cijena lijeka bila je vrlo visoka - 400 g interferona koštalo je 2,2 milijarde dolara. Međutim, izgledi za njegovu farmakološku upotrebu (uključujući i protiv četiri vrste raka) natjerali su nas da tražimo nove načine da ga dobijemo, prvenstveno putem genetskog inženjeringa.

U januaru 1980. ljudski interferon je proizveden u genetski modifikovanim ćelijama E. coli. Početna poteškoća s ovim metodama bila je u tome što je mRNA interferona niska čak i u leukocitima stimuliranim virusnom infekcijom i da su prinosi bili vrlo niski: prijavljena su 1-2 molekula interferona po bakterijskoj ćeliji.

Godine 1981. Genentech je uspio konstruirati rekombinantnu DNK koja kodira γ-interferon i uvesti ga u genom bakterija, kvasca, pa čak i stanica sisara, te su postali sposobni da sintetiziraju interferon sa visokim prinosom - 1 litar ćelijske kulture kvasca sadržavao je 1 milion jedinica interferona. (jedinica interferona odgovara količini koja štiti 50% ćelija u kulturi od infekcije virusom). Proces je sproveden na sledeći način: istraživači su izolovali mešavinu mRNA molekula iz ljudskih limfocita, dobili molekule odgovarajućih kopija DNK i uveli ih u ćelije E. coli. Zatim su odabrane bakterije koje proizvode interferon.

Dobijanje imunogenih lijekova i vakcina

Još jedno područje primjene genetskog inženjeringa odnosi se na proizvodnju novih učinkovitih, sigurnih i jeftinih vakcina.

Vakcine su jedno od najznačajnijih dostignuća u medicini, a njihova upotreba je i sa ekonomskog aspekta izuzetno efikasna. Poslednjih godina posebna pažnja posvećena je razvoju vakcina. To je zbog činjenice da do sada nije bilo moguće dobiti visoko efikasne vakcine za prevenciju mnogih uobičajenih ili opasnih zaraznih bolesti.

Povećano interesovanje za vakcine nastalo je nakon utvrđivanja uloge patogenih mikroorganizama u razvoju bolesti koje se ranije nisu smatrale zaraznim. Na primjer, gastritis, čir na želucu i dvanaestopalačnom crijevu, maligni tumori jetre (virusi hepatitisa B i C).

Stoga su u proteklih 10-15 godina vlade mnogih zemalja počele da preduzimaju mere usmerene na intenzivan razvoj i proizvodnju fundamentalno novih vakcina.

Vakcine koje se danas koriste mogu se podijeliti u sljedeće vrste u zavisnosti od načina njihove proizvodnje:
- žive atenuirane vakcine;
- inaktivirane vakcine;
- vakcine koje sadrže prečišćene komponente mikroorganizama (proteine ili polisaharide);
- rekombinantne vakcine koje sadrže komponente mikroorganizama dobijene genetskim inženjeringom

Rekombinantna DNK tehnologija se također koristi za stvaranje novih tipova živih atenuiranih vakcina, postižući slabljenje ciljanom mutacijom gena koji kodiraju proteine virulencije patogena bolesti. Ista tehnologija se također koristi za proizvodnju živih rekombinantnih vakcina umetanjem gena koji kodiraju imunogene proteine u žive nepatogene viruse ili bakterije (vektore), koje se ubrizgavaju u ljude.

Princip korištenja DNK vakcina je da se u tijelo pacijenta unese molekul DNK koji sadrži gene koji kodiraju imunogene proteine patogenog mikroorganizma. DNK vakcine se nazivaju i genske ili genetske vakcine.

Da bi se dobile DNK vakcine, gen koji kodira proizvodnju imunogenog proteina iz mikroorganizma se ubacuje u bakterijski plazmid. Pored gena koji kodira protein vakcine, genetski elementi koji su neophodni za ekspresiju („uključivanje“) ovog gena u eukariotskim ćelijama, uključujući ljude, ubacuju se u plazmid kako bi se osigurala sinteza proteina. Takav plazmid se unosi u kulturu bakterijskih ćelija kako bi se dobio veliki broj kopija.

Plazmidna DNK se zatim izoluje iz bakterija i pročišćava od drugih molekula DNK i nečistoća. Pročišćeni molekul DNK služi kao vakcina. Uvođenje DNK vakcine osigurava sintezu stranih proteina od strane ćelija vakcinisanog organizma, što dovodi do naknadnog razvoja imuniteta protiv odgovarajućeg patogena. U ovom slučaju, plazmidi koji sadrže odgovarajući gen nisu integrirani u DNK ljudskih hromozoma.

DNK vakcine imaju niz prednosti u odnosu na tradicionalne vakcine:
- podstiču proizvodnju antitijela na nativnu molekulu virusnih proteina;
- podstiču proizvodnju citotoksičnih T-limfocita;
- može selektivno utjecati na različite subpopulacije T-limfocita;
- doprinose formiranju dugotrajnog imuniteta;
- eliminirati rizik od infekcije.

L.V. Timoschenko, M.V. Chubik

Interferoni su proteinski molekuli s molekulskom težinom od 15.000 do 21.000 daltona koje proizvode i luče stanice kao odgovor na virusnu infekciju ili druge patogene.

Interferoni (IFN) su grupa autogenih glikoproteina čiji je biomehanizam djelovanja povezan s istovremenim antivirusnim djelovanjem - aktivacijom ćelijskih gena, uslijed čega se sintetiziraju proteini koji inhibiraju sintezu virusne DNK (RNA) i imaju imunomodulatorno djelovanje - sposobnost da se pojača ekspresija antigena na ćelijskim membranama i poveća aktivnost citotoksičnih T stanica i prirodnih stanica ubojica.

IFN se dijele u dvije vrste. Prvi tip, koji djeluje kao inhibitor replikacije virusa i ima pretežno antivirusno djelovanje, uključuje 22 različita podtipa IFN-α i jedan podtip IFN-β. Drugi tip, koji pokazuje imunomodulatornu aktivnost, uključuje IFN-γ.

Postoje tri imunološki različite klase IFN-a: IFN-α, IFN-β, IFN-γ.

Prirodni IFN uključuju limfoblastoidni i leukocitni IFN (IFN-α), sintetiziran od strane stimuliranih humanih monocita i B limfocita, koji se zatim ekstrahuju i prečišćavaju; IFN fibroblasta (IFN-β), dobijen iz kulture humanih fibroblasta, i IFN T-limfocita (IFN-γ).

Umjetno sintetizirani IFN-ovi uključuju rekombinantni IFN-α, koji je visoko pročišćeni pojedinačni podtip IFN-α proizveden korištenjem rekombinantne molekularne tehnologije.

Poznate su metode za dobijanje humanog leukocitnog interferona iz leukocita krvi humanog donora, izazvanog virusima i drugim induktorima.

Glavni nedostatak ovih metoda za proizvodnju interferona je vjerovatnoća kontaminacije konačnog proizvoda ljudskim virusima, kao što su virus hepatitisa B i C, virus imunodeficijencije itd.

Trenutno je metoda proizvodnje interferona mikrobiološkom sintezom prepoznata kao perspektivnija, što omogućava dobivanje ciljanog proizvoda sa značajno većim prinosom od relativno jeftinih početnih materijala. Pristupi korišteni ovdje omogućavaju stvaranje varijanti strukturnog gena koje su optimalne za ekspresiju bakterija, kao i regulatornih elemenata koji kontroliraju njegovu ekspresiju.

Kao izvorni mikroorganizmi koriste se različiti dizajni sojeva Pichia pastoris, Pseudomonas putida i Escherichia coli.

Nedostatak upotrebe P. pastoris kao proizvođača interferona su izuzetno teški uslovi fermentacije ove vrste kvasca i potreba da se striktno održava koncentracija induktora, posebno metanola, tokom procesa biosinteze.

Nedostatak korištenja Ps. putida je složenost procesa fermentacije na niskom nivou ekspresije (10 mg interferona po 1 litru podloge). Produktivnija je upotreba sojeva Escherichia coli.

Poznat je veliki broj plazmida i sojeva E. coli stvorenih na njihovoj osnovi koji eksprimiraju interferon: E. coli sojevi ATCC 31633 i 31644 sa plazmidima Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 ili Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli soj pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli soj pINF-F-Pa (AU 1312962), E. Coli soj SG 20050 sa plazmidom p280/21FN VK i dr. Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, br. 9, str. 1186-1193), soj E. Coli SG 20050 sa plazmidom pINF14 (SU 1703691), soj E. coli SG 20050 sa plazmidom pINF14 (RU4401) i dr. Nedostatak tehnologija zasnovanih na upotrebi ovih sojeva je njihova nestabilnost, kao i nedovoljan nivo ekspresije interferona.

Uz karakteristike korišćenih sojeva, efikasnost procesa u velikoj meri zavisi od tehnologije koja se koristi za izolaciju i prečišćavanje interferona.

Poznata je metoda za proizvodnju interferona, koja uključuje uzgoj Ps ćelija. putida, uništavanje biomase, tretman polietileniminom, frakcionisanje amonijum sulfatom, hidrofobna hromatografija na fenilsilohromu C-80, pH frakcionisanje lizata, njegova koncentracija i dijafiltracija, jonoizmenjivačka hromatografija na celulozi DE-52, eluiranje u pH gradijentu, ion izmjenjivačka hromatografija dobivenog eluenta na celulozi SM -52, koncentriranje propuštanjem kroz filter kasetu i gel filtracija na Sephadex G-100 (SU 1640996). Nedostatak ove metode, pored složene višestepene fermentacije, je i višestepenost procesa u dobijanju konačnog proizvoda.

Poznata je i metoda za proizvodnju interferona, koja uključuje kultivaciju soja E. coli SG 20050/pIF16 u LB bujonu u tikvicama u termostatiranom šejkeru, centrifugiranje biomase, ispiranje puferskom otopinom i ultrazvučni tretman za uništavanje stanica. Dobiveni lizat se centrifugira, ispere sa 3M rastvorom uree u puferu, rastvori u rastvoru gvanidin hlorida u puferu, obradi ultrazvukom, centrifugira, oksidativnom sulfitolizom, dijalizom protiv 8 M uree, renaturacijom i finalnom dvostepenom hromatografijom na CM- 52 celuloza i Sephadex G-50 (RU 2054041).

Nedostaci ove metode su relativno niska produktivnost glavnih faza procesa izolacije i pročišćavanja. Ovo se posebno odnosi na ultrazvučnu obradu proizvoda, dijalizu i oksidativnu sulfitolizu, što dovodi do nestabilnosti prinosa interferona, kao i nemogućnosti upotrebe ove metode za industrijsku proizvodnju interferona.

Kao najbliži analog (prototip) može se navesti metoda za dobijanje interferona humanih leukocita, koja se sastoji u kultivaciji rekombinantnog soja E. coli, zamrzavanju nastale biomase na temperaturi koja ne prelazi -70°C, odmrzavanje, uništavanje ćelija mikroorganizama. sa lizozimom, uklanjanjem DNK i RNK uvođenjem u lizat DNK-aze i prečišćavanjem izolovanog nerastvorljivog oblika interferona ispiranjem puferskim rastvorom sa deterdžentima, otapanjem taloga interferona u rastvoru gvanidin hidrohlorida, renaturacijom i jednostepenim prečišćavanjem ionom izmjenjivačka hromatografija. Kao proizvođač koristi se soj E. coli SS5 dobijen korišćenjem rekombinantnog plazmida pSS5 koji sadrži tri promotora: Plac, Pt7 i Ptrp i alfa-interferon gen sa uvedenim nukleotidnim supstitucijama.

Ekspresija interferona od strane E. coli SS5 soja koji sadrži ovaj plazmid kontrolišu tri promotora: Plac, Pt7 i Ptrp. Nivo ekspresije interferona je oko 800 mg po 1 litru ćelijske suspenzije.

Nedostatak ove metode je niska tehnološka efikasnost upotrebe enzimske destrukcije ćelija, DNK i RNK mikroorganizma i jednostepenog hromatografskog prečišćavanja interferona. To uzrokuje nestabilnost u procesu oslobađanja interferona, dovodi do smanjenja njegove kvalitete i ograničava mogućnost korištenja gornje sheme za industrijsku proizvodnju interferona.

Nedostaci ovog plazmida i soja baziranog na njemu su upotreba u plazmidu jakog neregulisanog promotora faga T7 u soju E. coli BL21 (DE3), u kojem se gen T7 RNA polimeraze nalazi ispod promotora lac operon i koji uvijek "teče". Posljedično, u ćeliji se kontinuirano odvija sinteza interferona, što dovodi do disocijacije plazmida i smanjenja vitalnosti ćelija soja, a kao rezultat toga i smanjenja prinosa interferona.

Za dobivanje velikih količina IFN-a koriste se šestodnevne monoslojne kulture stanica pilećih embrija ili kultiviranih leukocita ljudske krvi inficiranih određenom vrstom virusa. Drugim riječima, da bi se dobio IFN, kreira se određeni sistem virus-ćelija.

Gen odgovoran za biosintezu IFN izolovan je iz ljudske ćelije. Egzogeni ljudski IFN se proizvodi korištenjem tehnologije rekombinantne DNK. Postupak za izolaciju cDNK IFN-a je sljedeći:

1) mRNA je izolirana iz ljudskih leukocita, frakcionirana po veličini, reverzno transkribirana i umetnuta na mjesto modificiranog plazmida.

2) Dobijeni proizvod se koristi za transformaciju E. coli; rezultirajući klonovi su podijeljeni u grupe koje su identificirane.

3) Svaka grupa klonova je hibridizovana sa IFN - mRNA.

4) Iz dobijenih hibrida koji sadrže cDNK i chRNA, mRNA se izoluje i prevodi u sistem sinteze proteina.

5) Odrediti antivirusnu aktivnost interferona svake mješavine dobivene kao rezultat translacije. Grupe koje su pokazale aktivnost interferona sadrže klon sa cDNK hibridizovanom sa IFN - mRNA; klon koji sadrži cDNK humanog IFN-a pune dužine je ponovo identificiran.

2. Mehanizmi djelovanja interferona

IFN pokazuju neke aktivnosti kao limfokini i imunomodulatori. IFN tipa I, koji prvenstveno djeluju kao inhibitori replikacije virusa u ćeliji, ispoljavaju svoj učinak stimulirajući proizvodnju staničnih enzima ribozomima stanica domaćina, koji inhibiraju proizvodnju virusa, ometajući translaciju virusne mRNA i sintezu virusni proteini.

IFN proizvodi većina životinjskih vrsta, ali manifestacija njihove aktivnosti je specifična za vrstu, tj. djeluju samo u vrsti životinja u kojoj su proizvedeni.

IFN izazivaju indukciju tri enzima:

protein kinaza, koja remeti početnu fazu izgradnje peptidnog lanca;

oligoizoadenilat sintetaza, koja aktivira RNKazu, koja uništava virusnu RNK;

fosfodiesteraza, koja uništava konačne nukleotide tRNA, što dovodi do poremećaja elongacije peptida.

Uzimajući u obzir antivirusno i imunomodulatorno djelovanje IFN-a, NPO Biomed je predložio i uspješno testirao čepiće sa IFNan1 i probioticima za liječenje disbioze virusne i bakterijske etiologije, kandidijaze; u ginekološkoj praksi za liječenje endometritisa, kolpita, vaginitisa i ginekološkog herpesa.

3. Terapeutska upotreba humane INF

Postoje dvije generacije interferonskih lijekova. Prvu generaciju karakterizira prirodno porijeklo, u kojem se dobiva iz krvi davalaca. Od njega se dobija suvi ljudski leukocitni interferon koji se koristi za inhalaciju i ukapavanje u nosne prolaze. Takođe proizvode interferon u supozitorijama, prečišćeni koncentrovani interferon u suvom obliku i leukinferon.

Ova metoda proizvodnje lijekova na bazi interferona prilično je skupa i nedostupna, pa su krajem 20. stoljeća genetskim inženjeringom stvoreni interferonski lijekovi druge generacije.

Tako je bilo moguće razviti lijekove Viferon, Interal i druge koji sadrže rekombinantni humani interferon alfa

Zbog svojih jedinstvenih svojstava, preparati interferona koriste se u liječenju i prevenciji svih respiratornih bolesti, većine karcinoma, te za liječenje mnogih virusnih bolesti i gripa. Preparati interferona se široko koriste u liječenju hepatitisa B i C: interferon ograničava razvoj virusa, sprječava nastanak ciroze i eliminira smrt.

Neki interferonski lijekovi imaju nuspojave, kao što su osip na koži, alergije i bolesti hematopoetskog sistema.

Uz dugotrajnu upotrebu interferona, tijelo proizvodi antitijela na interferon, što ga čini nesposobnim da se bori protiv virusa. Razlog za ove pojave leži u prisustvu albumina u preparatima na bazi interferona.

Albumin se dobija iz krvi, tako da postoji rizik (iako minimalan) od zaraze hepatitisom i drugim bolestima koje se prenose krvlju.

Ime droge	Podtip INF	Način dobijanja	farmakološki efekat	Indikacije za upotrebu
Interferon		Biosinteza u kultivisanim leukocitima krvi donora pod uticajem virusa	Antivirusno, imunomodulatorno, antiproliferativno	Virusne bolesti, leukemija, maligni melanom, rak bubrega, karcinoidni sindrom
Interlock		Biosinteza u kultivisanim leukocitima krvi donora pod uticajem paramikovirusa	Suzbija aktivnost brojnih virusa	Virusne bolesti oka, hepatitis	Rekombinantna	Antivirusno, imunomodulatorno, inhibira proliferaciju širokog spektra tumorskih ćelija	Epitelni oblik akutne i rekurentne virusne infekcije oka; onkološke bolesti
Interferon alfa-2a		Rekombinantna. Protein koji sadrži 165 aminokiselina	Antivirusno, antitumorsko djelovanje	Leukemijska retikuloendotelioza, Kaposijev sarkom, rak bubrega, rak mokraćne bešike, melanom, herpes zoster
Reaferon		Rekombinantni INF proizveden od bakterijskog soja pseudomonasa, čiji genetski aparat sadrži gen za humani leukocitni IFN α2. Identično IFN α2 humanih leukocita.		Virusne, tumorske bolesti
Interferon alfa – n1		Visoko pročišćeni ljudski INF	Antivirusno	Hronični aktivni infektivni hepatitis B
Inreferon beta		Superprodukcija humanih fibroblasta stimulatorom u prisustvu metaboličkih inhibitora	Antivirusno, imunomodulatorno, antitumorsko djelovanje	Hronične virusne infekcije u oftalmologiji, ginekologiji i urologiji, dermatologiji, hepatologiji, onkologiji
Interferon gama		Rekombinantna	Antivirusno, imunomodulatorno, antitumorsko djelovanje	Hronične granulomatozne bolesti

1. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml

2. www.interferon.su/php/content.php?id=71

3. www.pharmvestnik.ru

4. Privremeni farmakopejski članak 42U-23/60-439-97. Interferon humani rekombinantni alfa-2.

5. Gavrikov A.V. Optimizacija biotehnološke proizvodnje rekombinantnih humanih interferonskih supstanci - M., 2003,

6. Glick B., Pasternak J. Molekularna biotehnologija / B. Glick, J. Pasternak. – M., Mir, 2002.

7. Državna farmakopeja SSSR-a. XI izd., broj 1.- P. 175.

8. Državni registar lijekova / Ed. A.V. Katlinsky i drugi - M., 2002.

9. Naroditsky B.S. Molekularna biotehnologija interferona. // zbornik naučno-praktične konferencije “Interferon – 50 godina”. – M., 2007, str. 17-23

10. Osnovi farmaceutske biotehnologije: Udžbenik / T.P. Prishchep, V.S. Čučalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhaleva. – Rostov na Donu: Phoenix; Tomsk: Izdavačka kuća NTL, 2006.

11. Frolov A.F., Vovk A.D., Dyadyun S.T. i dr. Efikasnost rekombinantnog alfa-dva-interferona kod virusnog hepatitisa B // Medicinski poslovi - Kijev, 1990. - Br. 9. - P. 105–108.

Interferoni- glikoproteini koje stanice proizvode kao odgovor na virusnu infekciju i druge podražaje. Oni blokiraju reprodukciju virusa u drugim ćelijama i učestvuju u interakciji ćelija imunog sistema. Postoje dve serološke grupe interferona: tip I - IFN-α i IFN-β; Tip II - IFN-.γ Interferoni tipa I imaju antivirusno i antitumorsko dejstvo, dok interferon tipa II reguliše specifičan imuni odgovor i nespecifičnu rezistenciju.

α-interferon (leukocit) proizvode leukociti tretirani virusima i drugim agensima. β-interferon (fibroblast) proizvode fibroblasti tretirani virusima.

IFN tipa I, vezivanjem za zdrave ćelije, štiti ih od virusa. Antivirusni učinak tipa I IFN-a također može biti posljedica činjenice da je u stanju inhibirati proliferaciju stanica ometajući sintezu aminokiselina.

IFN-γ proizvode T limfociti i NK ćelije. Stimuliše aktivnost T- i B-limfocita, monocita/makrofaga i neutrofila. Inducira apoptozu aktiviranih makrofaga, keratinocita, hepatocita, ćelija koštane srži, endotelnih ćelija i potiskuje apoptozu perifernih monocita i neurona inficiranih herpesom.

Genetski modifikovani interferon leukocita proizvodi se u prokariotskim sistemima (Escherichia coli). Biotehnologija za proizvodnju leukocitnog interferona obuhvata sledeće korake: 1) tretman leukocitne mase induktorima interferona; 2) izolovanje mešavine mRNK iz tretiranih ćelija; 3) dobijanje ukupne komplementarne DNK korišćenjem reverzne transkriptaze; 4) umetanje cDNK u plazmid E. coli i njegovo kloniranje; 5) selekcija klonova koji sadrže interferonske gene; 6) uključivanje jakog promotera u plazmid za uspešnu transkripciju gena; 7) ekspresija gena za interferon, tj. sinteza odgovarajućeg proteina; 8) uništavanje prokariotskih ćelija i prečišćavanje interferona afinitetnom hromatografijom.

Interferoni primijeniti za prevenciju i liječenje brojnih virusnih infekcija. Njihov učinak je određen dozom lijeka, ali visoke doze interferona imaju toksični učinak. Interferoni se široko koriste za gripu i druge akutne respiratorne bolesti. Lijek je efikasan u ranoj fazi bolesti i primjenjuje se lokalno. Interferoni imaju terapeutski učinak protiv hepatitisa B, herpesa, kao i malignih neoplazmi.

Interferon odnosi se na važne zaštitne proteine imunog sistema. Otkriven tokom proučavanja virusne interferencije, odnosno fenomena kada životinje ili ćelijske kulture zaražene jednim virusom postanu neosjetljivi na infekciju drugim virusom. Ispostavilo se da je smetnja posljedica nastalog proteina, koji ima zaštitna antivirusna svojstva. Ovaj protein se zvao interferon.

Interferon je porodica glikoproteinskih proteina koje sintetišu ćelije imunog sistema i vezivnog tkiva. U zavisnosti od toga koje ćelije sintetišu interferon, postoje tri tipa: α, β i γ-interferoni.

Alfa interferon proizveden od leukocita i naziva se leukocit; beta interferon naziva se fibroblastnim, jer ga sintetiziraju fibroblasti - ćelije vezivnog tkiva, i gama interferon- imuni, jer ga proizvode aktivirani T-limfociti, makrofagi, prirodne ćelije ubice, odnosno imune ćelije.

Interferon se konstantno sintetizira u tijelu, a njegova koncentracija u krvi se održava na približno 2 IU/ml (1 međunarodna jedinica - IU - je količina interferona koja štiti ćelijsku kulturu od 1 CPD 50 virusa). Proizvodnja interferona se naglo povećava tokom infekcije virusima, kao i kada je izložena induktorima interferona, kao što su RNK, DNK i složeni polimeri. Takvi induktori interferona se nazivaju interferonogena.

Osim antivirusnog djelovanja, interferon ima i antitumorsku zaštitu, jer usporava proliferaciju (razmnožavanje) tumorskih stanica, kao i imunomodulatorno djelovanje, stimulira fagocitozu, prirodne stanice ubice, reguliše stvaranje antitijela od B stanica, aktivira ekspresiju glavnih kompleks histokompatibilnosti.

Mehanizam djelovanja interferon je kompleksan. Interferon ne utiče direktno na virus izvan ćelije, već se vezuje za posebne ćelijske receptore i utiče na proces reprodukcije virusa unutar ćelije u fazi sinteze proteina.

Upotreba interferona. Djelovanje interferona je efikasnije što se ranije počinje sintetizirati ili ulaziti u tijelo izvana. Stoga se koristi u profilaktičke svrhe kod mnogih virusnih infekcija, kao što je gripa, kao i u terapeutske svrhe kod kroničnih virusnih infekcija, kao što su parenteralni hepatitis (B, C, D), herpes, multipla skleroza itd. Interferon daje pozitivan rezultira u liječenju malignih tumora i bolesti povezanih s imunodeficijencijama.

Interferoni su specifični za vrstu, odnosno ljudski interferon je manje efikasan za životinje i obrnuto. Međutim, specifičnost ove vrste je relativna.

Primanje interferona. Interferon se dobija na dva načina: a) inficiranjem ljudskih leukocita ili limfocita sigurnim virusom, usled čega zaražene ćelije sintetišu interferon, koji se potom izoluje i od njega se konstruišu preparati interferona; b) genetski modifikovani - uzgojem rekombinantnih sojeva bakterija sposobnih da proizvode interferon u proizvodnim uslovima. Obično se koriste rekombinantni sojevi pseudomonas i Escherichia coli sa interferonskim genima ugrađenim u njihovu DNK. Interferon dobijen genetskim inženjeringom naziva se rekombinantnim. U našoj zemlji rekombinantni interferon je dobio službeni naziv “Reaferon”. Proizvodnja ovog lijeka je na mnogo načina efikasnija i jeftinija od lijeka za leukocite.

Rekombinantni interferon je pronašao široku upotrebu u medicini kao preventivno i terapeutsko sredstvo za virusne infekcije, neoplazme i imunodeficijencije.

Plijesni su proizvođači antibiotika. Osobine ćelijske strukture i razvojnog ciklusa tokom fermentacije. Antibiotici koje proizvode plijesni.

Biotehnologija (Bykov 2009) str.28-40.

Kalupi, ili kalup- razne gljive (uglavnom zigo- i askomicete) koje formiraju razgranate micelije bez velikih plodnih tijela lako vidljivih golim okom.

Porodice i vrste kalupa

Penicillium spp.
Aspergillus
Moniliaceae
Dematiaceae
Fusarium
Acremonium
Scytalidium dimidiatum (Nattrassia magniferae)
Onychocola canadensis

Rasprostranjenost u prirodi

Plijesni su sveprisutne. U osnovi, ekstenzivne kolonije rastu na toplim, vlažnim mjestima, u hranljivim medijima.

Procijedite(iz njemačkog. Stammen, doslovno - pojaviti) - čista kultura virusa, bakterija, drugih mikroorganizama ili ćelijska kultura, izolirana u određeno vrijeme i na određenom mjestu. Budući da se mnogi mikroorganizmi razmnožavaju mitozom (diobom), bez sudjelovanja seksualnog procesa, u suštini vrste takvih mikroorganizama se sastoje od klonskih linija koje su genetski i morfološki identične izvornoj ćeliji. Soj nije taksonomska kategorija; najniži takson u svim organizmima je vrsta; isti soj se ne može izolovati drugi put iz istog izvora u neko drugo vrijeme.

Određivanje mikroorganizma određenoj vrsti zasniva se na prilično širokim karakteristikama, kao što su tip nukleinske kiseline i struktura kapsida kod virusa; sposobnost rasta na određenim ugljovodonicima i vrstu oslobođenih metaboličkih proizvoda, kao i očuvane sekvence genoma u bakterijama. Unutar vrste postoje varijacije u veličini i obliku plakova (negativnih „kolonija” virusa) ili kolonija mikroorganizma, nivou proizvodnje enzima, prisutnosti plazmida, virulenciji itd.

Ne postoji globalno prihvaćena nomenklatura za imenovanje sojeva, a imena koja se koriste su prilično proizvoljna. U pravilu se sastoje od pojedinačnih slova i brojeva, koji se pišu iza naziva vrste. Na primjer, jedan od najpoznatijih sojeva E. coli je E. coli K-12.

Ljudski kalupi se široko koriste.

Sojevi gljivica Aspergillus niger koristi se za proizvodnju limunske kiseline iz slatkih tvari
Sojevi Botrytis cinerea(„Plemenita trulež”) je uključen u sazrijevanje nekih vina (šeri).
Druge vrste kalupa (tzv. “plemeniti kalup”) koriste se za proizvodnju specijalnih sorti sira (rokfor, kamember).
Često plijesan pogađa plodna tijela jestivih gljiva i čini ih neprikladnim za berbu. Ali ponekad takve gljive postaju posebni predmeti lova na gljive, pogledajte o "gljivama jastoga" u članku Hypomyces lactifluorum.

Šteta od plijesni

Opasnost za ljude

Mikotoksini i antibiotici

Mnoge plijesni proizvode sekundarne metabolite - antibiotike i mikotoksine, koji djeluju depresivno ili toksično na druge žive organizme. Sljedeće supstance su najpoznatije

mikotoksini:

Aflatoksin

antibiotici:

Penicilin
Cefalosporini
Ciklosporin

Mnogi antibiotici su prisiljeni da se koriste u koncentracijama blizu toksičnim. Dakle, antibiotici gentamicin, streptomicin, dihidrostreptomicin, kanamicin i drugi mogu imati nefro- i ototoksično djelovanje.

Patogeni

Neke plijesni mogu uzrokovati bolesti kod životinja i ljudi - aspergilozu, onihomikozu i druge.

Plijesni i poljoprivreda

Neke plijesni, iako značajno smanjuju prinos, mogu negativno utjecati na zdravlje domaćih životinja.

Gljive napadaju zalihe žitarica, stočnu hranu, slamu i sijeno. Ponekad proizvodi postaju neupotrebljivi zbog toksičnosti metabolita gljivica.

Sa snažnim razvojem plijesni u slami, moguće je samozagrijavanje i ravnomjerno paljenje naslaga.

Mehanizmi otpora

Mikroorganizam možda nema strukturu na koju antibiotik djeluje (na primjer, bakterije iz roda Mycoplasma (lat. Mycoplasma) su neosetljivi na penicilin, jer nemaju ćelijski zid);
Mikroorganizam je nepropustan za antibiotik (većina gram-negativnih bakterija je imuna na penicilin G, jer je ćelijski zid zaštićen dodatnom membranom);
Mikroorganizam je u stanju da pretvori antibiotik u neaktivan oblik (mnogi stafilokoki (lat. Staphylococcus) sadrže enzim β-laktamazu, koji uništava β-laktamski prsten većine penicilina)
Zbog mutacija gena, metabolizam mikroorganizma može se promijeniti na način da reakcije blokirane antibiotikom više nisu kritične za život organizma;
Mikroorganizam je u stanju da ispumpa antibiotik iz ćelije [ izvor nije naveden 85 dana] .

Aplikacija

Antibiotici(od starogrčkog ἀντί - anti - protiv, βίος - bios - život) - supstance prirodnog ili polusintetičkog porekla koje potiskuju rast živih ćelija, najčešće prokariotskih ili protozoa.

Prema GOST 21507-81 (ST SEV 1740-79)

Antibiotik je tvar mikrobnog, životinjskog ili biljnog porijekla koja može suzbiti rast mikroorganizama ili uzrokovati njihovu smrt.

Antibiotike prirodnog porijekla najčešće proizvode aktinomicete, rjeđe nemicelijske bakterije.

Neki antibiotici imaju snažan inhibicijski učinak na rast i razmnožavanje bakterija i istovremeno uzrokuju relativno malo ili nimalo oštećenja stanica makroorganizma, pa se stoga koriste kao lijekovi.

Neki antibiotici se koriste kao citostatski (antitumorski) lijekovi u liječenju raka.

Antibiotici ne djeluju na viruse i stoga su beskorisni u liječenju bolesti uzrokovanih virusima (na primjer, gripa, hepatitis A, B, C, vodene kozice, herpes, rubeola, boginje).

Terminologija

Potpuno sintetički lijekovi, koji nemaju prirodne analoge i imaju inhibitorni učinak sličan antibioticima na rast bakterija, tradicionalno se nazivaju ne antibiotici, već antibakterijski lijekovi za kemoterapiju. Konkretno, kada su među antibakterijskim hemoterapijskim lekovima bili poznati samo sulfonamidi, bilo je uobičajeno da se o čitavoj klasi antibakterijskih lekova govori kao o „antibioticima i sulfonamidima“. Međutim, posljednjih desetljeća, zbog pronalaska mnogih vrlo jakih antibakterijskih lijekova za kemoterapiju, posebno fluorokinolona, koji su blizu ili premašuju djelovanje „tradicionalnih“ antibiotika, koncept „antibiotika“ je počeo da se zamagljuje i širi i sada se često koristi ne samo u odnosu na prirodne i polusintetičke spojeve, već i na mnoge jake antibakterijske lijekove za kemoterapiju.

Sinteza različitih klasa humanog interferona u genetski modifikovanim mikrobnim ćelijama. Ekspresija gena ugrađenih u plazmid.

Citokini su grupa polipeptidnih medijatora međućelijske interakcije, prvenstveno uključenih u formiranje i regulaciju odbrambenih reakcija organizma prilikom unošenja patogena i narušavanja integriteta tkiva, kao i u regulaciji niza normalnih fizioloških funkcija. Citokini se mogu razdvojiti u novi nezavisni regulatorni sistem koji postoji uz nervni i endokrini sistem za održavanje homeostaze, a sva tri sistema su usko povezana i međuzavisna.

Istorija proučavanja citokina počela je 40-ih godina dvadesetog veka. Tada su opisani prvi efekti kahektina, faktora prisutnog u krvnom serumu i sposobnog da izazove kaheksiju ili gubitak tjelesne težine. Nakon toga, ovaj medijator je izolovan i pokazano je da je identičan faktoru tumorske nekroze (TNF). U protekle dvije decenije klonirani su geni većine citokina i dobijeni su rekombinantni analozi koji u potpunosti repliciraju biološka svojstva prirodnih molekula. Sada je poznato više od 200 pojedinačnih supstanci koje pripadaju porodici citokina.

Citokini uključuju interferone, faktore stimulacije kolonija (CSF), hemokine, transformirajuće faktore rasta; faktor tumorske nekroze; interleukina sa istorijski utvrđenim serijskim brojevima i nekim drugim endogenim medijatorima. Interleukini, koji imaju serijske brojeve koji počinju od 1, ne pripadaju istoj podgrupi citokina povezanih zajedničkim funkcijama. Oni se, pak, mogu podijeliti na proinflamatorne citokine, faktore rasta i diferencijacije limfocita i pojedinačne regulatorne citokine.

Klasifikacija citokina se može izvršiti prema njihovim biohemijskim i biološkim svojstvima, kao i prema tipovima receptora preko kojih citokini vrše svoje biološke funkcije. Ispod je kombinovana strukturna i funkcionalna klasifikacija, gde su svi citokini podeljeni u grupe, prvenstveno uzimajući u obzir njihovu biološku aktivnost, kao i gore navedene strukturne karakteristike molekula citokina i njihovih receptora [Simbirtsev A.S., 2004].

Klasifikacija citokina

1. Interferoni tipa I (IFN a,b,d,k,w,t, IL-28, IL-29 (IFN l));

2. Faktori koji stimulišu kolonije, hematopoetini:

– faktor matičnih ćelija;

– gp140 ligandi (IL-3, IL-5, GM-CSF);

– Eritropoetin, trombopoetin.

3. Familija faktora tumorske nekroze (TNF, limfotoksini α i β);

4. Superfamilija interleukina-1 i faktora rasta fibroblasta (FGF):

– FRF porodica

– IL-1 familija (IL-1α, IL-1β, IL-33, itd.).

5. Porodica interleukina-6 (IL-6, IL-11, IL-31).

6. Porodica interleukina-10 (IL-10,19,20,22,24,26)

7. Porodica interleukina-12 (IL-12,23,27)

8. Citokini T-pomoćnih klonova i regulatorne funkcije limfocita (IL-2, IL-4-5, IL-7, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-21, IFNg)

9. Porodica interleukina 17 (IL-17A, B, C, D, E, F)

10. Hemokini.

11. Faktori rasta:

– Superfamilija faktora rasta živaca, faktora rasta koji potiče od trombocita i transformirajućih faktora rasta

– Familija epidermalnih faktora rasta (ERF, TRFα, itd.);

– Porodica faktora rasta sličnih insulinu (IGF-I, IGF-II).

Citokini se mogu izolovati u novi samostalni sistem za regulaciju osnovnih funkcija organizma, koji postoji uz nervnu i endokrinu regulaciju i prvenstveno povezan sa održavanjem imunološke homeostaze tokom unošenja patogena i narušavanja integriteta tkiva. Unutar imunog sistema, citokini posreduju u dvosmjernom odnosu između nespecifičnih faktora odbrane i specifičnog imuniteta.

U kliničkoj praksi postoje tri glavna područja upotrebe citokina:

1. citokinoterapija za aktiviranje odbrambenih reakcija tijela, imunomodulaciju ili nadoknadu nedostatka endogenih citokina;

2. anti-citokinska imunosupresivna terapija koja ima za cilj blokiranje bioloških efekata citokina i njihovih receptora;

3. genska terapija citokina u cilju poboljšanja antitumorskog imuniteta ili korekcije genetskih defekata u citokinskom sistemu.

Citokini se koriste u kliničkoj praksi i za sistemsku i za lokalnu primjenu. Sistemska primena je opravdana u slučajevima kada je potrebno obezbediti delovanje citokina u više organa radi efikasnije aktivacije imunog sistema ili aktivirati ciljne ćelije koje se nalaze u različitim delovima tela. Trenutno su najveću kliničku primjenu našli citokini iz grupe interferona (IFN), prvenstveno alfa-IFN i beta-IFN, te u manjoj mjeri gama-IFN.

Interferoni su grupa proteina s antivirusnim djelovanjem, koje proizvode eukariotske stanice kao odgovor na uvođenje niza bioloških agenasa - interferonogena (RNA genomski virusi, dvolančana RNA, razni polianioni, bakterijski LPS).

IFN izazivaju različite efekte koji se manifestuju i na ćelijskom i na sistemskom nivou. IFN se odlikuje prisustvom tri glavna dejstva – nespecifičnog antivirusnog, antitumorskog i imunomodulatornog. Interferoni inhibiraju reprodukciju mnogih virusa. Antivirusni učinak interferona zasniva se na supresiji veze virusne RNK sa ćelijskim ribosomima, što onemogućuje razmnožavanje virusa u ćeliji.

Sedamdesetih godina, svi IFN-i su podijeljeni u 2 tipa: oni inducirani virusima (leukociti i fibroblasti), koji su klasifikovani kao prvi tip, i oni inducirani mutagenima (imuni), koji su klasifikovani kao drugi. Trenutno je ova klasifikacija izgubila svoje značenje. Komitet stručnjaka Svjetske zdravstvene organizacije je 1980. godine usvojio i preporučio za upotrebu klasifikaciju prema kojoj su svi ljudski IFN podijeljeni u 3 klase. Kodirani su različitim geni i imaju niz aminokiselina karakterističnih za svaku klasu od koje su izgrađene njihove molekule. Kada su dostupne rekombinantne varijante IFN-a, obično se označavaju rimskim slovima.

Tabela 11 – Klasifikacija humanih interferona

Trenutno, sva stečena znanja o IFN-u mogu se generalizirati u nauku o „interfenologiji“, koja uključuje teorijske i praktične (medicinske i farmaceutske) aspekte ovog problema. U posljednjoj deceniji dogodila su se 4 najvažnija događaja u interfenologiji (istaknuo prof. F.I. Ershov, 1996):

Formulisan je koncept „interferonskog sistema“ i identifikovane njegove direktne i inverzne veze sa imunološkim i neuroendokrinim sistemom;

Otkriveno je mnoštvo gena IFN-ct (više od 20 u ljudskim ćelijama);

Uz pomoć savremenih tehnoloških tehnika, poboljšani su postojeći preparati IFN-a i stvorena je nova generacija, testirani su originalni induktori IFN-a;

Utvrđene su indikacije i kontraindikacije za kliničku primjenu IFN-a i njihovih induktora kod virusnih i nevirusnih bolesti.

Vakcinalni soj virusa Newcastle bolesti ili Sendai virusa koristi se kao induktor interferonogeneze. Preliminarna kultivacija virusa se vrši u danima razvoja 9-11. pilećih embriona. Osnovne tehnološke operacije: ovoskopija, klađenje, inkubacija pilećih embriona, unošenje infektivne suspenzije u alantoisnu šupljinu, nakon čega slijedi inkubacija 48-72 sata i uklanjanje inficirane tekućine iz mrtvih pilećih embriona. Alantoična tečnost koja sadrži virus se centrifugira

Vrlo važna operacija koja određuje kvalitetu gotovog proizvoda je uklanjanje nečistoća crvenih krvnih zrnaca iz koncentrata leukemije (faza 1). Prisustvo eritrocita u koncentratu leukemije najpotpunije se eliminiše njihovom selektivnom lizom rastvorom amonijum hlorida u fiziološkoj koncentraciji.

Tabela 12 – Tehnološka šema za biosintezu IFN-a

Tehnološka faza	Uslovi
1. Izolacija leukocita	Frakcionisanje leukomase sa dekstra-
	nom i polivinil alkohol sa naknadnim
	duva hemoliza. Ovo proizvodi 3
	sloj. Gornja 2 sloja se centrifugiraju
	digestiju i resuspendovanje sedimenta u
	hranljivi medij.
2. Pripremanje (aktivacija	Leukociti 10-20 miliona/ml u medijumu br. 199 s
metabolizam leukocita) -	5% krvne plazme davaoca, 3 jedinice/ml,
2-10 sati, 37,5°C	0,0015 jedinica/ml insulina, 200 IU/ml prirodnog
	IFN
3. Uvođenje virusa induktora
3.1.Indukcija 1 sat, 37,5°C	Virus Newcastle bolesti (NDV), doza 5
	RCC 50 po 1 leukocitu
3.2. Odvajanje neupijajućeg	Centrifugiranje 600x d- 15 minuta.,
pali virus	prikupljanje induciranog ćelijskog sedimenta.
4. Biosinteza 18 h, 37,5°C	Suspenzija kulture Leukociti 6 miliona/ml u medijumu br. 199 sa 5% plazme gamaglobulina, 5 ml natrijum sukcinata, natrijum bikarbonata do pH 7,5, antibiotici. Prinos IFN-a je 3-4 IU na 1.000 leukocita.
5. Inaktivacija virusa interferona	Dovođenje pH medijuma na 2,2-2,4 i izlaganje poluproizvoda najmanje 7 dana.
6. Prečišćavanje interferona	Korak po korak: bistrenje, ultrafiltracija, sterilizacija filtracije

U fazi uzgoja leukocita (faza 2), koncentrat leukocita se resuspendira u tečnosti kulture, koja, osim glavnih komponenti, sadrži i neke proteine krvnog seruma, bez kojih se biosinteza IFN-a praktički ne događa. Također je utvrđeno da se kultivacijom leukocita, posebno pri velikoj gustoći suspenzije (10 7 ćelija/ml), u njima aktiviraju metabolički procesi, što je praćeno stvaranjem kiselih produkata. S tim u vezi, važno je održavati pH okoline u optimalnim granicama tokom perioda prajminga i biosinteze IFN-a. Za održavanje pH medijuma na potrebnom nivou, u medijum se dodaju različite supstance sa puferskim kapacitetom.

Optimalni uslovi za proizvodnju IFN-a (faza 4) se stvaraju kultivisanjem leukocita na 37-37,5°C. Smanjenje temperature inkubacije na 35°C i niže, ili, obrnuto, povećanje na 38°C i više dovelo je do značajnog slabljenja proizvodnje IFN-a.

IFN-a se može proizvesti kako u stacionarnim uslovima kultivacije, tako iu kulturama sa stalnim mešanjem ćelija. Vjeruje se da suspendirane stanice intenzivnije proizvode IFN-a. Od velikog značaja za opstanak ćelija u suspenzijskim kulturama je oblik sudova, visina tečnog sloja i dovoljne količine kiseonika u vazduhu. Optimalni uslovi za dobijanje titara IFN-a stvaraju se kultivacijom leukocita u tikvicama sa okruglim dnom, prekrivenim folijom, do pola napunjenim ćelijskom suspenzijom, uz stalno mešanje. Prethodno tretiranje leukocita malim dozama IFN-a dovelo je do povećanja prinosa IFN-a za 3-10 puta.

Nakon resuspenzije, leukociti se induciraju alantoičnim (bez ovojnice) virusima Newcastle ili Sendai bolesti. Nakon inkubacije od 20 sati na 37,5°C, tokom koje je od primarnog značaja održavanje vitalnosti kulture i visokog ćelijskog metabolizma pri konstantnom pH, ćelije se odvajaju centrifugiranjem pri maloj brzini (2000 rpm) u trajanju od 40 minuta. Aktivnost interferona u preparatima dobijenim opisanim postupkom je 30-200.000 U/ml.

U modernoj biotehnologiji sve se više koriste metode genetskog inženjeringa. Već u mnogim laboratorijama širom svijeta uspješno se dobivaju geni koji kodiraju formiranje niza biološki aktivnih supstanci i integriraju u genetski aparat kultiviranih bakterijskih ili somatskih stanica.

Funkcionalni geni za biotehnološku proizvodnju se rekreiraju reverznom transkripcijom ili sintetiziraju iz pojedinačnih nukleotida, izolovanih iz DNK odgovarajućih hromozoma.

Eksperimenti o prijenosu ljudskih IFN gena u bakterijske stanice počeli su kasnih 70-ih godina. Gotovo istovremeno u 3 istraživačke grupe: na Institutu za molekularnu biologiju I Univerziteta u Cirihu pod vodstvom Weissmanna, na odjelu za biohemiju Instituta za istraživanje raka u Tokiju pod vodstvom T. Taniguchija i u SAD-u, ogranak Genentech-a pod vodstvom J. Goeddela.

Sve tri istraživačke grupe koristile su reverznu transkripciju interferonske mRNA za kloniranje. Kao primjer, pogledajmo napredak eksperimenata Weismanove grupe.

Za kloniranje gena IFN-α, kao polazni materijal korištena je 12 S poli(A) mRNA frakcija (messenger adenilovana RNA) dobivena iz ćelija leukocita induciranih Sendai virusom. Na osnovu glasničke RNK dobijena je komplementarna DNK koja se sastoji od 2 lanca. Rezultirajuća dvolančana DNK je digestirana korištenjem restrikcijskih enzima kako bi se formirao oligo-dG ljepljivi kraj. Slična operacija je izvedena sa plazmidom kako bi se formirao ljepljivi oligo-dC kraj. Koristeći ligaze, komplementarna DNK koja sadrži informacije o strukturi IFN-α ubačena je u plazmu pBR322.

Ovaj plazmid nosi gene koji određuju otpornost na dva antibiotika: tetraciklin i ampicilin. Insercija DNK interferona inaktivira gen odgovoran za rezistenciju na ampicilin, pa je primarni odabir ćelija koje su primile hibridne plazmide baziran na rezistenciji na tetraciklin.

Za odabir željenih klonova korištena je sljedeća metoda: mješavina nekoliko plazmida iz različitih klonova, od kojih jedan može sadržavati interferonsku DNK, denaturira se i veže na čvrsti nosač. Uzorci RNK dobijeni iz ljudskih ćelija koje proizvode IFN hibridiziraju se s ovom DNK, filteri se isperu, RNA se eluira pod uslovima denaturacije, a eluat se ubrizgava u oocite afričke zelene žabe da bi se otkrila mRNA interferona. Među hibridizirajućim klonovima odabran je jedan, nazvan Hif-2h, koji ima umetak koji odgovara veličini kompletnog gena IFN a.

Ćelije Escherichia coli koje sadrže hibridne plazmide koji nose takav umetak sposobne su da sintetiziraju polipeptid s biološkom aktivnošću interferona.

Rad na kloniranju interferonskih gena ponovili su i razvili i gore pomenuti autori i druge grupe istraživača u mnogim zemljama. U SSSR-u je 1982. opisano prvo uspješno kloniranje gena za leukocitni interferon. akad. Ovčinnikov, fibroblast 1983. - Yu.I. Kozlov, imun - 1985. godine E.D. Sverdlov.

Trenutno se geni IFN-a eksprimiraju ne samo u ćelijama Escherichia coli, već iu ćelijama drugih gram-negativnih bakterija (Pseudomonas) - to čini osnovu za industrijsku proizvodnju IFN-a u Rusiji. Trenutno se smatra da je najefikasnija upotreba kvasca u ove svrhe.

Kvasci iz roda Saccharomyces nisu patogeni za ljude, imaju stoljećima iskustva u njihovoj upotrebi. Kvasac nije podložan lizi ili autolizi, lako se odvaja i koristi jeftine supstrate. Biomasa kvasca ne sadrži toksične i pirogene faktore, poput ćelija gram-negativnih bakterija.

Vrlo važna okolnost je i sličnost sekretornih mehanizama kvasca i viših eukariota, što sugerira da će klonirani preinterferonski geni uspjeti da proizvedu zreli IFN kao rezultat pravilne obrade.

Razvijena je tehnologija za masovnu kultivaciju rekombinantnih ćelija koje proizvode IFN. Dakle, za domaći lijek Reaferon uključuje:

· uzgoj bakterijskog soja koji proizvodi reaferon u 100 l fermentora sa prinosom 5-7x103 ME iz 1 l tečnosti kulture,

· uništavanje biomase metodom koja omogućava povećanje procesa sa 60-70% prinosa ciljnog proizvoda,

· preliminarno prečišćavanje reaferona na jonskom izmjenjivaču; Završno pročišćavanje lijeka provodi se na imunosorbentu s monoklonskim antitijelima na leukocitni IFN-a tip 5AC.

Glavni proizvođači rekombinantnog IFN-a su bakterijski sojevi, u čijoj citoplazmi se sintetiše IFN i čini samo delić procenta ukupne mase bakterijskih proteina. Nakon što se u posebnim fermentorima nakupi dovoljno visoka koncentracija ćelija, one se uklanjaju iz fermentora i uništavaju (liziraju). Glavne metode lize su: osmotski šok, zamrzavanje-odmrzavanje, homogenizacija i tretman deterdžentima. Zatim, uz pomoć sekvencijalnih postupaka filtracije, centrifugiranja, hromatografije jonske izmjene i gel hromatografije, IFN se prethodno pročišćava, što rezultira čistim bakterijskim ekstraktom u kojem IFN još uvijek ne čini više od 1-2% ukupnog proteina. Završno prečišćavanje lijeka korištenjem imunosorbenta s monoklonskim antitijelima na IFN.

Monoklonska antitela na IFN su „vezana” za granule nosača i smeštena u hromatografsku kolonu. Zatim se na kolonu nanosi bakterijski ekstrakt koji sadrži rekombinantni IFN. Samo IFN se veže za antitijela, dok ostale komponente ekstrakta, uključujući sve bakterijske toksine, slobodno prolaze kroz kolonu i uklanjaju se otopinom za ispiranje. Za ekstrakciju rekombinantnog IFN adsorbiranog na antitijelima iz kolone, kroz nju se propušta elucijski puferski rastvor koji ima slabo kiselu reakciju. U tom slučaju dolazi do prekida veze između molekula IFN-a i antitijela. IFN prelazi sa površine čestica Sepharose u puferski rastvor i može se prikupiti kao čista supstanca bez kontaminirajućih proteina.

Brza ekspanzija upotrebe rekombinantnih IFN-a i paralelno smanjenje novije upotrebe prirodnih lijekova uglavnom je posljedica nestašice sirovina za proizvodnju potonjih (donatorske krvi), kao i širenja virusnih bolesti koje se prenose putem krv (HIV, hepatitis C). Stoga, unatoč prisutnosti nekih prednosti prirodnih IFN lijekova, u klinici se koriste gotovo samo rekombinantni lijekovi.

Porodica IFN-a sadrži oko 20 podtipova, tako da su prirodni preparati - Humani leukocitni interferon, Egiferon, Wellferon - višekomponentni i sadrže sve ili barem većinu podtipova. Prirodni IFN nemaju antigena svojstva i ne izazivaju senzibilizaciju pri dugotrajnoj ponovljenoj primjeni. Naprotiv, neki rekombinantni IFN, kada se daju injekcijom, mogu uzrokovati stvaranje neutralizirajućih ili vezujućih antitijela.

Najčešće korišteni su obični (ne-PEGilirani) i PEGilirani alfa- i beta-IFN. Na primjer, rekombinantni IFN-a2a (Reaferon, Roferon, Pegasis), rekombinantni IFN-a2b (Intron A, Realdiron, Peg-Intron), koji su analozi prirodnih podtipova sa tačkastim mutacijama u strukturi proteina lis-his, arg-his , arg-arg, koji imaju mali uticaj na aktivnost, ali su značajni sa stanovišta senzibilizacije. Dakle, lijekovi IFN-a2a, koji nisu tipični za ljudsku populaciju, imaju visok rizik od izazivanja senzibilizacije i stvaranja antitijela, što će u visokim titrima smanjiti njihov terapeutski potencijal.

Imuni interferon (IFN gama) može se smatrati komponentom lijekova namijenjenih za liječenje virusnih, onkoloških i autoimunih bolesti. Brojni lijekovi na bazi njega su kreirani u inostranstvu: Immuneron (SAD), Immunomax (Japan), Imukin (Njemačka). U Rusiji je razvijena efikasna šema za dobijanje visoko prečišćenog Deltaferona, zasnovana na dve uzastopne hromatografije na istom sorbentu, ali na različitim pH vrednostima. Ova shema omogućava dobivanje rekombinantnog Deltaferona u preparativnim količinama s prihvatljivim sadržajem visokopolimernih nečistoća. Promjene u proteinskom molekulu (skraćivanje molekula za 10 aminokiselina i 3 aminokiselinske zamjene) dovele su do 20-strukog gubitka antivirusne aktivnosti u odnosu na IFN-γ pune dužine, ali nisu utjecale na njegova imunomodulatorna svojstva. Kao rezultat ove modifikacije, deltaferon je postao otporan na proteolitičke enzime. Razvijeni su eksperimentalni oblici doziranja deltaferona koji omogućavaju očuvanje proteina u svom prirodnom stanju bez gubitka specifične aktivnosti. Oblici doziranja Deltaferona imaju imunomodulatorna svojstva svojstvena originalnom interferonu gama.

Sa farmakološke tačke gledišta, preparate IFN treba posmatrati, pre svega, kao imunomodulatore koji utiču na funkcionalnu aktivnost efektorskih ćelija imunog sistema i pre svega T-limfocita i monocita (makrofaga). Pod uticajem IFN-a povećava se efikasnost imunološkog prepoznavanja antigena i povećavaju se fagocitne i citolitičke funkcije u cilju eliminacije patogena ili antigen modifikovanih ćelija. Interferon cirkuliše u organizmu oko 2 nedelje, što treba uzeti u obzir kada se koristi kao profilaktičko sredstvo.

Dugogodišnje iskustvo je pokazalo da kada se daje intranazalno, IFN ima izraženu preventivnu efikasnost protiv različitih virusa gripe i parainfluence. Zaštitni učinak je najizraženiji kada se lijek svakodnevno koristi pomoću inhalatora ili nebulizatora. Ponovljene intranazalne instalacije ili udisanje otopine lijeka kroz nos i usta u obliku aerosola tokom prva dva dana bolesti doveli su do bržeg smanjenja simptoma intoksikacije i febrilne reakcije. Ozbiljnost upalnih pojava u gornjim respiratornim putevima također se brže smanjivala. Nedavne studije su pokazale da IFN suzbija proliferaciju tumorskih ćelija, što ga čini efikasnim u liječenju tumorskih bolesti. Antitumorski efekat IFN-a može se objasniti stimulacijom prirodnih odbrambenih mehanizama organizma, posebno na limfocite koji ubijaju ćelije raka ili formiraju antitela.

Do danas je identifikovan niz bolesti za koje je efikasna upotreba IFN-a. Virusne infekcije uključuju ARVI, gripu, encefalitis, virusni hepatitis, herpetične lezije očiju (konjunktivitis, keratokonjunktivitis), sluzokože i očiju. Prema kliničarima, kod herpetičnih lezija kože i sluznica prednost treba dati lokalnoj upotrebi lijeka. IFN je pronašao upotrebu u transplantaciji organa kao sredstvo za prevenciju sekundarnih virusnih infekcija. Kratka analiza nam omogućava da zaključimo da IFN može imati pozitivan učinak na razvoj širokog spektra bolesti virusne etiologije. Njegova efikasnost je najizraženija kod akutnih infekcija, u ranim stadijumima bolesti. Za kliničku upotrebu, prednost treba dati lokalnoj primjeni, koja osigurava minimalnu potrošnju lijeka. Osim toga, lokalnom primjenom izbjegavaju se negativni efekti uočeni kod sistemske primjene visokih doza IFN-a.

Svaki oblik doziranja ima svoje područje primjene, određeno njegovim imunobiološkim i farmakološkim svojstvima. Ova odredba je formulirana na sljedeći način:

Preparati IFN-a ne bi trebali uzrokovati pojavu senzibilizacije pri dugotrajnoj ponovljenoj primjeni u povremenim kursevima. Biosinteza IFN-a za pripremu različitih doznih oblika može se provesti prema jednoj tehnološkoj shemi, ali metode za pročišćavanje IFN-a i njegovi kriteriji moraju zadovoljiti ciljeve terapije. U doznim oblicima za injekcije, nečistoće koje su antigene za ljude moraju biti odsutne. Njihov nivo u preparatima za lokalnu upotrebu treba da bude ispod praga senzibilizacije.

Teoretski, prirodni preparati IFN-a mogu sadržavati 3 glavne grupe antigena:

· antigeni virusa induktora i alantoične tečnosti piletine;

· eritrocitni antigeni koji određuju krvnu grupu i Rh status;

leukocitni antigeni HLA.

Biotehnologija za proizvodnju IFN-a treba da uključuje operacije koje ograničavaju mogućnost prodiranja ovih antigena u dozne oblike. Tehnološki, najteži zadatak je uklanjanje antigena grupe I, jer se u fazi indukcije unose u suspenziju u velikim količinama.

Preparati prirodnog IFN-a, u zavisnosti od metoda prečišćavanja, mogu se podeliti u dve grupe - nativne i koncentrisane. Preparati nativnog tipa se praktički ne razlikuju po sastavu proteina od originalnih poluproizvoda, odlikuju se niskom specifičnom aktivnošću - do 1-104 IU na 1 mg proteina, ali zadržavaju sve citokine proizvedene tokom procesa interferonogeneze u njihovom prirodnom odnosu. Stoga imaju visok potencijal za imunobiološko djelovanje.

Biotehnologija za proizvodnju koncentriranih lijekova uključuje kemijsko prečišćavanje, što dovodi do smanjenja potencijala za imunobiološko djelovanje zbog gubitka citokina. Međutim, ovi lijekovi su također vrijedni za praktičnu zdravstvenu zaštitu. Na primjer, visokokoncentrirani humani leukocitni IFN – CLI za injekcije – i dalje je nezamjenjiv u situacijama kada je potrebno primijeniti visoke pojedinačne doze (limfoblastna leukemija u akutnoj fazi), kao i u liječenju virusnih i onkoloških lezija lokaliziranih iza krvno-moždanu barijeru. Koncentrirani lijekovi također uključuju interlock, koji se uspješno koristi za lokalno liječenje virusnih infekcija oka.

Treću grupu čine rekombinantni IFN, predstavljeni reaferonom i realdonom. Za mnoge oblike patologije, lokalni preparati (intranazalne kapi, mast, rektalne supozitorije, očni filmovi itd.) su efikasniji od injekcija. Na primjer, kod aktivnog kroničnog HBV-a, upotreba rektalnih supozitorija koje sadrže samo 100.000 IU IFN-a daje iste rezultate kao intramuskularna primjena visoko koncentriranog lijeka u dozi od 3 IU. Potrošnja lijeka i troškovi liječenja pri korištenju rektalnih supozitorija su deset puta smanjeni.

Savremeni rekombinantni IFN preparati:

Reaferon(humani rekombinantni IFN-a2) proizveden od strane NPO „Vektor“, Novosibirsk.

· dobijen kultivacijom bakterijskog soja Pseudomonas sporogenosa, koji u svom genetskom aparatu sadrži integrisani rekombinantni plazmid humanog IFN-a2 gena.

· namenjen za intramuskularnu, subkonjunktivnu i lokalnu upotrebu.

Dostupan u obliku liofiliziranog praha u ampulama.

Intron A(humani rekombinantni IFN-a2b) iz Schering Plougha, SAD.

Lijek je dobiven korištenjem rekombinantne DNK tehnologije korištenjem bakterijske E. coli koja sadrži genetski modificirani gen koji kodira ovaj ljudski protein.

Specifikacija aktivnosti 2*108 IU/mg proteina.

Unošenje velikih doza proteina je praćeno povećanjem temperature, glavoboljom, gastrointestinalnim smetnjama (mučnina, ponekad pogoršanje hepatitisa), a javljaju se i poremećaji u radu kardiovaskularnog sistema.

Na osnovu proučavanja ontogeneze IFN sistema, razvijen je novi domaći lijek, viferon-čepići, uključujući rekombinantni IFN-a i lijekove sa antioksidativnim djelovanjem. Viferon se dokazao u liječenju virusnih i bakterijskih bolesti novorođenčadi: intrauterini herpes, klamidija, ARVI, kandidijaza

Pegilirani interferoni

Antivirusna terapija je jedno od glavnih područja obećavajuće upotrebe PEGiliranih lijekova sa peptidnom strukturom. Upečatljiv primjer upotrebe koncepta pegilacije biotehnoloških lijekova je stvaranje pegiliranih interferona (peg-IFN). Pegilirani analozi interferona alfa - PEG-interferon-alfa 2b (Pegintron; Shering Plough) i PEG-interferon-alfa 2a (Pegasys; Hoffmann La Roche) - trenutno se koriste u kliničkoj praksi.

Odlučio to sintetišu se interferoni u ćeliji, prvo u obliku prekursora koji sadrže signalni peptid na N-kraju polipeptidnog lanca, koji se zatim odcjepljuje i kao rezultat nastaje zreli interferon koji ima punu biološku aktivnost. Bakterije ne sadrže enzime koji bi mogli odcijepiti signalni peptid i formirati zreli protein. Da bi bakterije sintetizirane zreli interferon, U plazmid treba uvesti samo dio gena koji ga kodira, a ukloniti dio gena koji kodira signalni peptid. Procedura zahtijeva usklađenost sa sljedećim uslovima:

Gen za interferon mora sadržavati tri mjesta cijepanja sa restrikcijskim enzimom Sau 3A1, od kojih se jedno nalazi pored signalnog dijela.

Nepotpuno cijepanje gena ovim enzimom omogućava izolaciju genskog fragmenta koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira zreli interferon.

ATG triplet koji kodira cistein cijepa enzim zajedno sa signalnim dijelom.

Da bi se obnovila polinukleotidna sekvenca kompletnog gena, hemijski je sintetizovan fragment DNK koji sadrži ovaj triplet, kao i susedni ATG triplet, početnu tačku sinteze proteina.

Ovaj fragment je vezan za izolovani dio zrelog gena, što je rezultiralo restauracijom kompletnog zrelog gena za interferon.

Rekonstruisani gen je uveden u plazmid na način da se pored njega nalazi region promotora DNK, koji obezbeđuje početak sinteze mRNA.

Ekstrakti iz E. coli koji sadrže takav plazmid , imao antivirusnu aktivnost.

Interferon sintetiziran genetskim inženjeringom izolovan je, pročišćen, a njegova fizičko-hemijska svojstva su se pokazala sličnima svojstvima interferona dobijenog iz krvi donora. Uspeo da dobijem bakterije, sposoban sintetizirati do 5 mg interferona po 1 litri bakterijske suspenzije koja sadrži približno 10 11 bakterijskih ćelija, što je 5000 puta veće od količine interferona koja se može izdvojiti iz 1 litre krvi donora.

Trenutno su geni interferona klonirani u kvasac i ćelije viših eukariota sposobne za glikolizu.

1991. godine u SAD-u su po prvi put korištene genetski modificirane stanice kvasca za sintezu interferona humanih leukocita. Saccharomyces cerevisiae. Rezultirajuća efikasna ekspresija LeIF gena i zamjena bakterija stanicama kvasca omogućila je povećanje proizvodnje interferona za 10 puta.

U Rusiji je 1994. godine izvršena potpuna sinteza gena α- I veličine oko 600 n. n. (nukleotidne tačke) u Institutu za bioorgansku hemiju pod rukovodstvom N. M. Kolosova.

Unatoč uspjesima postignutim u proizvodnji interferona korištenjem tehnologija genetskog inženjeringa i njihovoj upotrebi u liječenju različitih virusnih bolesti, uključujući i rak, ostaje riješena mnoga pitanja u vezi s dešifriranjem mehanizama njihove biosinteze i interakcije s drugim supstancama.

Dijagram biološkog djelovanja interferona prikazan je na slici 8.34.

Rice. 8.34. Mehanizam djelovanja interferona

Mehanizam djelovanja interferona može se svesti na sljedeće glavne faze:

1. Vezivanjem za ćelijske receptore, interferoni iniciraju sintezu enzima 5"-oligoadenilan sintetaze i protein kinaze zbog pokretanja transkripcije odgovarajućih gena;

2. Oba enzima pokazuju svoju aktivnost u prisustvu dvolančane DNK, koji su proizvodi replikacije mnogih virusa;

3. Enzim 5"-oligoadenilan sintetaza katalizira sintezu 2" 5"-oligoadenilata (iz ATP-a), koji aktiviraju ćelijsku ribonukleazu;

4. Protein kinaza fosforilira i time aktivira faktor inicijacije translacije IF 2. Kao rezultat ovih događaja inhibira se biosinteza proteina i reprodukcija virusa (razgradnja mRNA i rRNA) u inficiranoj ćeliji, što uzrokuje njenu lizu.