Podrobna reakcija aglutinacije (RA). Približna reakcija aglutinacije (RA). Reakcije neposredne hemaglutinacije. Reakcija hemaglutinacije je posredna reakcija hemaglutinacije.

Reakcija posredne hemaglutinacije (IRHA)

Uporaba sorbiranih diagnostičnih zdravil temelji na principu imunološkega prepoznavanja površinskih struktur, ki se v naravi nenehno uresničuje. S tega vidika ni bistvenih razlik med uporabo na primer mikrobne celice ali umetnega nosilca, obremenjenega z antigenom (protitelesi). Kot osnova za sorbirane pripravke se uporabljajo različni nosilci - mikrobne celice, eritrociti, lateks, bentonin, holesterol, Sephadex, dermatol, aktivno oglje, spore gliv itd.

Po delu A. T. Kravčenka (1945) so eritrociti, ki jim je bila odvzeta vitalnost in fiksirani z različnimi kemičnimi reagenti, postali najbolj razširjeni kot nosilci antigenov ali protiteles. Na podlagi načela uporabe eritrocitov (tako domačih kot fiksnih) kot nosilca antigena je posredna (pasivna) reakcija hemaglutinacije postala zelo razširjena.

Predlog za uporabo posredne hemaglutinacijske reakcije (IRHA) v diagnostične namene je nastal na podlagi predhodno razvitih spoznanj o visoki sorpcijski aktivnosti eritrocitov. V primerjavi z mnogimi drugimi nosilci antigenov in protiteles imajo eritrociti določene prednosti pri reakciji posredne hemaglutinacije. Prvič, v izotoničnih solnih raztopinah tvorijo dokaj stabilno oprijem in se ne usedejo v kratkem času. Drugič, rdeče krvne celice iste živalske vrste so enake velikosti. In končno, eritrociti relativno enostavno pritrdijo različne serološko aktivne komponente neposredno ali kot rezultat posebne obdelave.

Izdelava eritrocitne diagnostike iz stabiliziranih eritrocitov omogoča premagovanje težav, ki nastanejo pri uporabi nativnih eritrocitov.

Pri proučevanju eritrocitov, obdelanih z različnimi fiksirnimi snovmi, so bile ugotovljene nekatere njihove skupne lastnosti:

Po morfologiji se praktično ne razlikujejo od svežih;

Ne hemolizirajte v hipotoničnih raztopinah, v vodi in po zamrzovanju-odmrzovanju;

Lahko se posuši z zamrzovanjem;

Njihove površinske strukture ohranjajo sposobnost kemične modifikacije (na primer tanin, diazo spojine) in reagirajo z antigeni in protitelesi.

Glavno merilo za kakovost fiksnih eritrocitov je možnost njihove uporabe za pridobivanje senzibiliziranih zdravil v odsotnosti nespecifičnega lepljenja v stabilizacijskih tekočinah.

Pri oblikovanju diagnostičnih zdravil je pomembna priprava površine eritrocitov za povečanje sorpcijske sposobnosti antigenov. Posebej razširjeno je postalo zdravljenje rdečih krvničk s taninom.

Pod njegovim vplivom se spremenijo antigenske lastnosti eritrocitov (prepustnost, hitrost sedimentacije) in poveča njihova odpornost na hemolitične učinke nekaterih maščobnih kislin. Vendar pa je glavna stvar dosežena - tanizirani eritrociti imajo bistveno večjo sorpcijsko sposobnost beljakovin, kar se trenutno pogosto uporablja pri izdelavi visokokakovostne diagnostike antigenov in protiteles.

Poleg strojenja eritrocitov se za izdelavo eritrocitnih diagnostikov in pripravo nosilcev antigenov uporabljajo kemični reagenti, kot so bromelain, triopsin, kalijev perjodat, ki prav tako modificirajo membrane eritrocitov.

Po pripravi površine eritrocitov nastopi najpomembnejši proces - proces hemosenzibilizacije - zadnja faza izdelave eritrocitnih diagnostikov.

Za krepitev povezave med nosilcem in antigenom se uporabljajo različne konjugacijske snovi - bisdiazobenzidin, difluorodinitrobenzin, cianogen klorid, kadmijev klorid in acetat, bromov klorid, formaldehid, glutaraldehid, cianogen bromid, rivanol, amidol itd.

Uporaba konjugiranih snovi pomaga odpraviti slabosti, ki jih imajo tanizirani eritrociti, ki se uporabljajo za senzibilizacijo brez konjugacijskih snovi.

Najpogosteje uporabljene konjugacijske snovi so kromov klorid, glutaraldehid, črni diazol C in amidol. Proces senzibilizacije s kromovim kloridom poteka zelo hitro - od 4 do 10 minut, kar pritegne pozornost raziskovalcev. V tem primeru se uporabljajo koncentracije kromovega klorida od 0,05 do 2%, pH ni nižji od 5,0 pri temperaturi reakcijske zmesi 20-250 C. V procesu senzibilizacije s kromovim kloridom se aktivirajo karboksilne skupine proteinov membrane eritrocitov. . Posledično nastane kovalentna vez med membrano rdečih krvničk in senzitinom.

Reakcija indirektne hemaglutinacije je zelo specifična, saj se adhezija eritrocitov pojavi kot posledica interakcije antigena s protitelesi, adsorbiranimi na eritrocitih. Njegova posebnost je visoka občutljivost: zazna 0,02-0,05 μg protitelesnega proteina. Po občutljivosti je bistveno boljša od reakcij imunodifuzije, imunofluorescence, radialne imunodifuzije, fiksacije komplementa in nevtralizacije. RNGA je manj občutljiva od metod radioimunoelektroforeze, določanja količine beljakovin radioaktivnih protiteles v imunosorbentu in encimskega imunskega testa.

Prednosti RNGA vključujejo dokaj visoko ponovljivost, enostavnost izvedbe in potrebo po minimalnih količinah sestavin, zlasti pri uporabi mikrometode.

V zadnjih letih je RNGA našel široko uporabo pri diagnostiki infekcijskega rinotraheitisa, driske, adenovirusne okužbe, rota in koronavirusnih okužb, parainfluence 3 in respiratorne sincicijske okužbe.

Navajamo primer izdelave in uporabe eritrocitnega diagnostikuma za dokazovanje protiteles proti rotavirusnim in koronavirusnim okužbam.

Metoda priprave diagnostike protiteles za identifikacijo antigenov rota in koronavirusa v RNGA je naslednja: pridobitev suspenzije eritrocitov; fiksacija njihovih akroleinov; tanizacija, ki omogoča stabilno absorpcijo potrebnega proteina na rdečih krvnih celicah; senzibilizacija taniziranih eritrocitov z imunoglobulini; določitev specifičnosti pripravljenega diagnostikuma. Priprava suspenzije eritrocitov poteka z zbiranjem krvi klinično zdrave ovce v bučko s steklenimi kroglicami. Po defibrinaciji krvi je treba rdeče krvne celice 3-5 krat sprati z izotonično (0,9 %) raztopino natrijevega klorida s centrifugiranjem 15-20 minut pri 400 g.

Za stabilizacijo rdečih krvničk jih obdelamo z akroleinom. Kot je znano, je njegov učinek nekoliko blažji od formaldehida in zagotavlja stabilnost in večjo aktivnost rdečih krvničk. Za to zmešamo enake količine 10% suspenzije eritrocitov z 0,2% raztopino akroleina, pripravljeno v raztopini fosfatnega pufra (PBS) s pH 7,2. Nastalo suspenzijo hranimo 30 minut pri 37 °C, temeljito premešamo, čemur sledi odstranitev akroleina s ponovnim centrifugiranjem 5 minut pri 600-800 g, dokler specifični vonj popolnoma ne izgine. Prednost tako pripravljenih rdečih krvničk je v tem, da so shranjene za prihodnjo uporabo in jih je mogoče hraniti dolgo časa, ne da bi pri tem prišlo do hemolize.

Nato se stabilizirane rdeče krvne celice v 10-odstotni koncentraciji dva meseca hranijo pri 2–4 °C v PBS s pH 7,2.

Za povečanje sorpcijske sposobnosti in sedimentacije rdečih krvnih celic jih je potrebno porjaviti z mešanjem enakih delov 10% suspenzije opranih rdečih krvnih celic in raztopine tanina v PBS in pH 7,2 v razredčitvi 1:30.000. Zmes temeljito premešamo in vzdržujemo pri 370 C 15 minut, nato pa rdeče krvne celice temeljito speremo s tanina dvakrat v PBS s pH 7,2 in trikrat z izotonično raztopino natrijevega klorida s pH 7,2-7,4.

Optimalno obdobje za zagotovitev prejema visokokakovostnih diagnostičnih eritrocitov je njihova senzibilizacija v 24-48 urah po obdelavi s taninom.

V procesu izdelave diagnostikumov se kot topilo in konzervans uporablja 0,3% fenolizirana izotonična raztopina natrijevega klorida z 0,1% normalnim kunčjim ali konjskim serumom, ki je bila predhodno 30 minut inaktivirana pri 56°C in adsorbirana z normalnimi ovčjimi eritrociti.37°C 30 minut.

Senzibilizacijo taniziranih eritrocitov je treba opraviti s hiperimunskim serumom proti rota in govejim koronavirusom (proizveden na Vseruskem raziskovalnem inštitutu za eksperimentalno veterinarsko medicino po imenu Y.R. Kovalenko). V tem primeru je senzibilizacijski odmerek (koncentracija beljakovin) protirotavirusnega imunskega seruma 280 μg/ml, imunskega seruma proti koronavirusu pa 260 μg/ml.

Senzibilizacijo izvedemo z mešanjem enakih volumnov porjavelih eritrocitov in imunskega seruma, predhodno segretega 30 minut na 560C v optimalni koncentraciji. Poleg tega dodajte 3 dele izotonične raztopine natrijevega klorida s pH 7,2 in 5 delov 0,1 % raztopine kromovega klorida. Zmes ob občasnem mešanju pustimo pri sobni temperaturi 5 minut. Po določenem času zmes temeljito speremo s PBS s pH 7,2, nato pa pripravljene eritrocitne diagnostike resuspendiramo v konzervansu do 1 % koncentracije. Pripravljen diagnostik obdrži svoje osnovne lastnosti 8 mesecev, če je shranjen pri 4°C.

Na vseh stopnjah izdelave diagnostikuma se spremlja samoaglutinacija. Specifičnost pripravljenih diagnostik se določi s postavitvijo RNGA, kjer so bili kot antigeni uporabljeni standardni diagnostiki virusov IRT, AI-3, adenovirusov, virusne diareje ter antigenov rota in koronavirusa.

Pri izvajanju RNGA pripravimo zaporedne dvojne razredčitve testnega materiala, ki vsebuje virus (20-50% suspenzija fekalnih vzorcev), nato pa v vsako vdolbino dodamo enako količino diagnostične tekočine za eritrocite. Plošče večkrat temeljito pretresemo in pustimo na sobni temperaturi, dokler se eritrociti v kontroli popolnoma ne umirijo. Indikator pozitivne reakcije je aglutinacija eritrocitnega diagnostika z intenzivnostjo aglutinacije 2+ v titru 1:4 in več.

Uporablja rdeče krvne celice ali nevtralne sintetične materiale (na primer delce lateksa), na površini katerih so sorbirani antigeni (bakterijski, virusni, tkivni) ali protitelesa. Do njihove aglutinacije pride, ko dodamo ustrezne serume ali antigene. Rdeče krvničke, senzibilizirane z antigeni, se imenujejo antigenski diagnostik eritrocitov in se uporabljajo za odkrivanje in titriranje protiteles. Eritrociti, senzibilizirani s protitelesi. se imenujejo imunoglobulinski eritrocitni diagnostiki in se uporabljajo za identifikacijo antigenov.

Reakcija pasivne hemaglutinacije se uporablja za diagnosticiranje bolezni, ki jih povzročajo bakterije (tifus in paratifus, dizenterija, bruceloza, kuga, kolera itd.), protozoji (malarija) in virusi (gripa, adenovirusne okužbe, virusni hepatitis B, ošpice, klopi). prenašalni encefalitis, krimska hemoragična mrzlica itd.), pa tudi za določanje nekaterih hormonov, za prepoznavanje bolnikove preobčutljivosti na zdravila in hormone, kot sta penicilin in insulin.

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA). Pasivni hemaglutinacijski test je občutljiva metoda serološke diagnostike in se uporablja tako za zgodnjo in retrospektivno diagnostiko kot tudi za ugotavljanje imunološkega stanja cepljenih oseb. Pri bolnikih s tularemijo se protitelesa običajno odkrijejo ob koncu 1. ali 2. tedna bolezni; po 1-1,5 mesecih titri RPHA dosežejo najvišjo raven (1: 100.000-1: 20.000, redkeje višje), nato pa se zmanjšanje na raven 1: 100-1: 200 se shranijo za dolgo časa.

Pri cepljenih ljudeh se protitelesa stalno odkrijejo, vendar v nižjih titrih, ki ne presegajo 1: 2000-1: 5000 1-1,5 meseca po cepljenju, in ostanejo več let na nizki ravni 1: 20-1: 80.

Antigen za določanje stopnje RPHA je eritrocitni diagnostik tularemije (antigen). Zdravilo so formalizirane ovčje rdeče krvne celice, senzibilizirane z antigenom tularemije, na voljo v tekoči in suhi obliki. Tekoči pripravek - 10% suspenzija rdečih krvnih celic v raztopini formaldehida 10% koncentracije. Suhi liofilizirani pripravek je vakuumsko sušena 10% suspenzija rdečih krvničk brez konzervansa. Pred uporabo ga razredčimo v skladu z navodili na etiketi. Za postavitev reakcije v polistirenskih ploščah se obe zdravili uporabita v 2,5% koncentraciji, pri pripravi reakcije v mikrovolumenih pa v 0,5% koncentraciji.

Tehnika za nastavitev RPGA. Testne serume razredčimo s fiziološko raztopino 1:5 (1:10) in segrevamo 30 minut pri 56 stopinjah C. Nato za odstranitev heterogenih protiteles proti ovčjim eritrocitom serume obdelamo s 50 % suspenzijo formaliniziranih ovčjih eritrocitov. V ta namen dodajte rdeče krvne celice s hitrostjo 2 kapljic (0,05 ml) na 1 ml seruma in temeljito premešajte s stresanjem. Serum pustimo, dokler se eritrociti popolnoma ne usedejo, ali pa ga po eni uri centrifugiramo na sobni temperaturi, nato pa je pripravljen za preiskavo.

Tekočino za redčenje vlijemo v količini 0,5 ml v vrsto vdolbinic na polistirenski plošči. Med predhodnim preučevanjem serumov je priporočljivo, da jih testirate tako, da nastavite reakcijo v kratki vrsti plošče (6 vdolbinic). Če so protitelesa odkrita v kratki seriji, se serumi ponovno testirajo v dolgi seriji razredčitev (12 vdolbinic). Po razlitju tekočine za redčenje dodajte 0,5 ml testnih serumov v razredčitvi 1:5 v prvo vdolbinico vsake vrstice (kratke ali dolge). Nato enake količine seruma titriramo z dvakratnimi razredčinami. Tako dobimo razredčino seruma v kratki seriji od 1:10 do 1:320, v dolgi seriji pa od 1:10 do 1:20480. Po titraciji serumov dodamo v vsako vdolbinico eno kapljico (0,05 ml) delovne 2,5 % suspenzije senzibiliziranih eritrocitov. Vsebino plošč temeljito pretresemo, dokler ne dobimo homogene suspenzije. Krožnike pustimo pri sobni temperaturi na nepremični površini mize. Predhodni zapis reakcije se izvede po 2-3 urah, dokončna določitev titra se opravi po popolni sedimentaciji rdečih krvnih celic v vdolbinicah. Za reakcijo so predvidene naslednje kontrole: 1) testni serum, razredčen v razmerju 1:10 v volumnu 0,5 ml + 1 kapljica 2,5% suspenzije nesenzibiliziranih eritrocitov; 2) tekočina za redčenje v prostornini 0,5 ml + 1 kapljica 2,5% suspenzije nesenzibiliziranih eritrocitov; 3) tekočina za redčenje v prostornini 0,5 ml + 1 kapljica 2,5% suspenzije senzibiliziranih eritrocitov. Vse kontrole morajo dati jasno negativno reakcijo.

Računovodstvo in ocenjevanje RPGA. Reakcija se oceni po naslednji shemi:

1) močno pozitivna reakcija (++++) - rdeče krvne celice padejo na dno luknje v enakomerni plasti v obliki "dežnika", ki ima pogosto nazobčano taljenje robov;

2) pozitivna reakcija (+++) - rdeče krvne celice pokrivajo vsaj 2/3 dna jamice;

3) šibko pozitivna reakcija (++) - aglutinat je majhen in se nahaja v samem središču jamice;

4) vprašljiva reakcija (+) - okoli sedimenta eritrocitov v samem središču jamice so posamezna zrnca aglutinata;

5) negativno (-) - na dnu luknje se rdeče krvne celice usedejo v obliki "gumba" ali majhnega obroča z gladkimi, ostro definiranimi robovi.

Serumski titer se upošteva glede na zadnjo razredčitev seruma, ki je dala zelo jasno reakcijo (vsaj tri pluse). Redčitev 1:100 ali višja velja za diagnostični titer, vendar je treba, tako kot pri RA, spremljati njegovo povečanje.

RPHA za tularemijo je precej specifičen in zazna nekatere navzkrižne reakcije samo s serumi bruceloze. Diferencialno diagnozo lahko izvedemo po višini titrov v RPGA, ki so pri homolognem antigenu bistveno višji.

Tehnika postavljanja RPHA v mikrovolumene. RPGA je mogoče izvajati v mikrovolumnih z uporabo mikrotitratorja tipa Takachi (ali mikroplošč z okroglim dnom z mikropipetami), ki omogoča titracijo materiala v volumnih 25 μl in 50 μl. Reakcijska tehnika in zaporedje vseh operacij sta enaka kot pri študiju na polistirenskih ploščah. Upoštevati pa je treba, da je občutljivost mikrometode običajno za eno razredčitev (tj. 2-krat) nižja od občutljivosti makrometode.

Za vzpostavitev reakcije v mikrotitratorju se v vsako vdolbino s kapalno pipeto doda tekočina za redčenje v volumnu 50 μl. Nato s titratorji s 50 μl glavo zberemo testni serum tako, da vanj potopimo glavo. Prepričajte se, da je tekočina napolnila glavo titratorja. Titrator s serumom prenesemo v prvo vdolbino in ga držimo v navpičnem položaju, izvedemo več rotacijskih gibov v obe smeri. Nato se titrator prenese v naslednjo vdolbino in manipulacija se ponovi. Titracijo lahko izvajamo hkrati v več vrstah. Po titriranju celotne serije titrator z vrtljivimi gibi speremo z destilirano vodo (menjava 2 obrokov), vodo odstranimo iz glave z brisom in sežgemo na plamenu gorilnika.

Po titraciji v jamice dodamo 25 μl diagnostične tekočine za eritrocite. Koncentracija diagnostikuma za RPHA v mikrovolumenih mora biti 0,5% (tj. 2,5% suspenzijo rdečih krvničk dodatno razredčimo 5-krat). Po dodajanju rdečih krvnih celic je treba plošče rahlo pretresati, dokler ne dobimo homogene suspenzije. Rezultate lahko zabeležimo v 1-1,5 urah, kar je bistvena prednost RPGA v mikrotitru. Poleg tega ta tehnika zahteva majhne količine vseh reakcijskih sestavin in testnih serumov.

Reakcija se upošteva po naslednji shemi:

1) "+" - popolna hemaglutinacija, pri kateri rdeče krvne celice padejo na dno vdolbinice v enakomernem sloju v obliki "dežnika", ki zaseda vsaj 2/3 dna;

2) "+-" - delna hemaglutinacija, pri kateri rdeče krvne celice padejo na dno v obliki ohlapnega obroča majhne velikosti;

3) "-" - odsotnost hemaglutinacije, ko rdeče krvne celice padejo na dno v obliki majhnega gumba ali obroča z gladkim robom.

Specifičnost pozitivnega rezultata, pridobljenega pri RPHA, je mogoče testirati s pomočjo trikomponentne reakcije - reakcije pasivne hemaglutinacijske inhibicije (PHA).

Tehnika za nastavitev RTPGA. Ta reakcija se uporablja za potrditev specifičnosti pozitivnega rezultata RPGA, kadar je dvomljiv ali je posebnega epidemiološkega pomena. Mehanizem reakcije je specifična inhibicija hemaglutinacije, ko testnemu serumu dodamo suspenzijo ubitih bakterij tularemije. V reakciji medsebojno delujejo tri komponente: testni serum, specifični tularemični antigen in antigenski eritrocitni diagnostikum RTPHA je običajno postavljen v vrsto 7-8 vdolbinic. Priporočljivo je, da vzporedno z RTPGA namestite ponavljajoč se RPGA. V dve vrsti vdolbinic vlijemo 0,25 ml tekočine za redčenje, nato v prve vdolbinice obeh vrst dodamo testni serum v volumnu 0,25 ml in izvedemo titracijo, pri čemer dobimo dve enaki vrsti razredčin seruma. V vse vdolbinice druge vrste dodamo 0,25 ml tekočine za redčenje, v vdolbinice prve vrste pa 0,25 ml suspenzije bakterij tularemije. Uporabimo Tularemia diagnosticum (vsebuje 25 milijard bakterij tularemije v 1 ml), predhodno 50-krat razredčeno. Ta suspenzija vsebuje 500 milijonov bakterij v 1 ml ali 125 milijonov v prostornini 0,25 ml. Po dodajanju antigena ploščo pustimo 1 uro pri sobni temperaturi, nato dodamo eno kapljico (0,05 ml) eritrocitnega diagnostikuma v vse vdolbinice obeh vrst, ploščo pretresemo in pustimo na ravni površini mize. Obračun se izvede po 2-3 urah.

Računovodstvo in ocenjevanje RTPGA. Če testni serum vsebuje specifična protitelesa proti tularemiji, jih dodani antigen nevtralizira in do hemaglutinacije ne bo prišlo v prvi vrsti vdolbinic ali pa bo pri visokem serumskem titru hemaglutinacija opažena v manjšem (2-4) številu vdolbinic. vodnjakov kot v vrsti z RPHA. V tem primeru je bila potrjena specifičnost rezultatov. Če opazimo hemaglutinacijo v obeh vrstah, tj. Če se rezultati RTPGA in RPGA ujemajo, to kaže na odsotnost protiteles proti tularemiji v testnem serumu. V tem primeru se primarni rezultat RPGA šteje za nespecifičnega.

Tehnika uprizarjanja RTHG v mikrovolumenih. RTPGA, tako kot RPGA, se lahko izvaja v mikrovolumnih z uporabo mikrotitra tipa Takachi. Da bi to naredili, dodajte 0,25 μl tekočine za redčenje v vdolbinice mikroplošč v dveh vrstah po 7-8 vdolbinic. Nato s titratorjem dodamo 0,25 μl testnega seruma in titriramo v obeh vrstah. Nato dodamo 25 μl tularemijskega antigena (katerega koncentracija je 500 milijonov bakterij tularemije v 1 ml) v vsako vdolbino v prvi vrsti in 25 μl tekočine za redčenje v drugo vrsto. Plošče pustimo 1 uro pri sobni temperaturi, nato pa v vse vdolbinice obeh vrst dodamo 25 μl antigenskega zritrocitnega diagnostikuma (koncentracija 0,5 %). Obračunavanje in vrednotenje rezultatov poteka podobno kot pri reakcijah v makrovolumnih.

Reakcija je podana:

1) za odkrivanje polisaharidov, beljakovin, bakterijskih izvlečkov in drugih visoko razpršenih snovi, rikecij in virusov, katerih kompleksov z aglutinini ni mogoče videti v običajnih RA,

2) za odkrivanje protiteles v serumih bolnikov proti tem visoko razpršenim snovem in majhnim mikroorganizmom.

Posredna ali pasivna aglutinacija je reakcija, pri kateri protitelesa medsebojno delujejo z antigeni, predhodno adsorbiranimi na inertnih delcih (lateks, celuloza, polistiren, barijev oksid itd. ali rdeče krvne celice ovc, I(0)-človeška krvna skupina).

Pri reakciji pasivne hemaglutinacije (RPHA) rdeče krvne celice. Rdeče krvničke, obremenjene z antigenom, se zlepijo skupaj v prisotnosti specifičnih protiteles proti temu antigenu in se oborijo. Antigensko senzibilizirane eritrocite uporabljamo v RPGA kot diagnostiko eritrocitov za dokazovanje protiteles (serodiagnostika). Če so rdeče krvničke obremenjene s protitelesi (diagnostikum eritrocitnih protiteles), jih lahko uporabimo za odkrivanje antigenov.

riž. 3. Shema RPGA: rdeče krvničke (1), obremenjene z antigenom (3), vežejo specifična protitelesa (4).

Uprizoritev. V vdolbinicah polistirenskih plošč pripravimo vrsto serijskih razredčin seruma. V predzadnjo vdolbinico dodamo 0,5 ml očitno pozitivnega seruma in v zadnjo vdolbinico 0,5 ml fiziološke raztopine (kontrole). Nato v vse vdolbinice dodamo 0,1 ml razredčenega eritrocitnega diagnostika, pretresemo in za 2 uri postavimo v termostat.

Računovodstvo. V pozitivnem primeru se rdeče krvne celice usedejo na dno jamice v obliki enakomerne plasti celic z zavihanim ali nazobčanim robom (obrnjen dežnik), v negativnem primeru pa se usedejo v obliki gumba ali obročka. .

Slika 4. Računovodstvo za RNGA (RPGA).

Upoštevanje rezultatov rentgenskega testa, opravljenega za odkrivanje botulinskega toksina.

Povzročitelj botulizma Clostridium botulinum proizvaja toksine sedmih serovarjev (A, B, C, D, E, F, G), pogostejši pa so serovari A, B in E. Vsi toksini se razlikujejo po antigenskih lastnostih in lahko razlikovati v reakcijah z uporabo tipsko specifičnih serumov. V ta namen lahko izvedemo pasivno (indirektno) hemaglutinacijsko reakcijo s pacientovim serumom, v katerem domnevamo prisotnost toksina, in rdečimi krvnimi celicami, obremenjenimi s protitelesi antitoksičnih antibotulinskih serumov tipa A, B, E. Normalno serum služi kot kontrola.

riž. 3. Izjava in rezultat RNGA.

Računovodstvo. V pozitivnem primeru se rdeče krvne celice usedejo na dno jamice v obliki enakomerne plasti celic z zavihanim ali nazobčanim robom (obrnjen dežnik), v negativnem primeru pa se usedejo v obliki gumba ali obročka. .

Zaključek: V bolnikovem serumu je bil odkrit botulinski toksin tipa E.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HRT).

riž. 8. Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HAI) (shema).

Načelo reakcije temelji na sposobnosti AT, da veže različne viruse in jih nevtralizira, kar onemogoča aglutinacijo rdečih krvnih celic. Vizualno se ta učinek kaže v "zaviranju" hemaglutinacije. RTGA se uporablja pri diagnostiki virusnih okužb za identifikacijo specifičnih antihemaglutininov in identifikacijo različnih virusov po njihovih hemaglutininih, ki kažejo lastnosti Ag.

Tipizacija virusa se izvede v reakciji RTGA z nizom tipsko specifičnih serumov. Rezultati reakcije se upoštevajo z odsotnostjo hemaglutinacije. Podtipe virusa tipa A z antigeni H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 in drugimi je mogoče razlikovati v RTGA z nizom homolognih za tip specifičnih serumov

riž. 9. Rezultati RTGA za tipizacijo virusa gripe

Legenda: - zaviranje hemaglutinacije (gumb); - hemaglutinacija (dežnik).

Sklepi: Preučevani material vsebuje virus influence tipa A z antigenom H3N2

Reakcija se izvaja za odkrivanje antigenov patogenov v testnem materialu z dodajanjem imunskega seruma. V prisotnosti homolognega antigena se protitelesa vežejo, zato po dodajanju eritrocitov, senzibiliziranih z antigenom, ne pride do njihove aglutinacije, kar ocenjujemo kot pozitiven rezultat. Za večjo občutljivost reakcije se testnemu materialu doda specifični imunski serum v minimalni količini (2 hemaglutinacijski enoti). Titer imunskega seruma se najprej določi z uporabo RNGA. Ena hemaglutinacijska enota je največja razredčina seruma, ki povzroči lepljenje rdečih krvničk.

Metodologija. V vdolbinice polistirenskih plošč ali aglutinacijskih epruvet dodamo 0,025 ml 1 % raztopine normalnega kunčjega seruma in naredimo serijske 2-kratne razredčitve preskusnega materiala. Nato v vse vdolbinice dodamo 0,025 ml imunskega seruma, ploščo pretresemo in pustimo 30 minut pri temperaturi 37ºC ali 1 uro pri sobni temperaturi. Nato v vse vdolbinice dodamo 0,025 ml antigenskega diagnostika, pretresemo in pustimo 2 uri, nato pa upoštevamo rezultate.

Pri izvedbi te reakcije se kontroli za RNHA doda še imunsko serumska specifičnost, ki jo sestavljajo specifični antigen, imunski serum (2, 1, 0,5 hemaglutinacijske enote) in suspenzija senzibiliziranih eritrocitov.

RTNGA se uporablja tudi za odkrivanje specifičnih protiteles (kompletnih in blokirajočih), za katera se v testni serum doda odmerjena količina antigena. Če vsebuje protitelesa, jih veže antigen, zato se po dodajanju s protitelesi senzibiliziranih eritrocitov (2. stopnja RTNGA) eritrociti ne zlepijo.

Zahvaljujoč uporabi minimalne količine antigena (2 nevtralizacijski odmerki) je reakcija zelo občutljiva. Število nevtralizirajočih odmerkov v pripravku antigena določimo z RNGA, medtem ko naredimo serijske 2-kratne razredčitve antigena v 1% raztopini normalnega kunčjega seruma in v jamice dodamo protitelesni eritrocitni diagnostik. Nevtralizacijski odmerek antigena se šteje za njegovo največjo razredčitev, ki zagotavlja popolno adhezijo senzibiliziranih eritrocitov.

Pred reakcijo testne serume razredčimo 1:5-1:10 in inaktiviramo pri temperaturi 56°C 30 minut. Za adsorpcijo hemaglutininov dodamo serumu 50% suspenzijo formaliniziranih ali sveže opranih ovčjih eritrocitov v razmerju 0,1 ml suspenzije na 1 ml razredčenega seruma. Zmes stresamo in inkubiramo 30 minut pri 37 °C ali 1 uro pri sobni temperaturi, nato pa rdeče krvne celice oborimo s centrifugiranjem. Serum lahko pustite v hladilniku do naslednjega dne, da se rdeče krvničke usedejo.

Pri izvajanju poskusa se preskusni material razredči v 1% raztopini normalnega kunčjega seruma v volumnu 0,025 ml v vdolbinicah mikrotitrske plošče. Nato v vsako jamico dodamo 2 nevtralizacijski dozi antigena v volumnu 0,025 ml. Plošče pretresemo in pustimo 30 minut pri 37 °C ali 1 uro pri sobni temperaturi. Nato v vse vdolbinice dodamo 0,025 ml protitelesnega eritrocitnega diagnostika. Plošče se stresajo in inkubirajo 1,5-2 uri pri sobni temperaturi, nato pa se upoštevajo rezultati reakcije. Obračun se lahko opravi tudi naslednji dan. Titer testnega seruma se šteje za njegovo največjo razredčino, pri kateri se rdeče krvničke ne zlepijo.

Poskus spremljajo naslednje vrste nadzora:

1) stabilnost senzibiliziranih eritrocitov (eritrociti + 1% raztopina normalnega kunčjega seruma);

2) popolnost izločanja hemaglutinina v vsakem testnem serumu (testni serum v najnižji razredčitvi + formalinizirani eritrociti);

3) pravilnost določanja najmanjšega nevtralizacijskega odmerka antigena (2, 1 in 0,5 nevtralizacijskega odmerka antigena + protitelesni eritrocitni diagnostik).

Reakcija povratne indirektne hemaglutinacije (ronga) se uporablja za označevanje bakterijskih in virusnih antigenov v testnem materialu, pa tudi za hitro diagnozo številnih okužb.

Za razliko od RNGA pri tej reakciji rdeče krvne celice niso senzibilizirane z antigenom, temveč s protitelesi, katerih aglutinacija se pojavi, ko dodamo antigen.

Rdeče krvne celice so predhodno fiksirane s formaldehidom ali glutaraldehidom in nato vezane na gama globulin, ki je izoliran iz imunskih serumov in prečiščen iz drugih serumskih beljakovin. Vezava gama globulina na površino rdečih krvnih celic se pojavi s pomočjo kromovega klorida. Za to dodajte 1 volumen imunoglobulinov, izoliranih iz imunskega seruma, 1 volumen 50% suspenzije formaliniziranih eritrocitov in 1 volumen 0,1-0,2% raztopine kromovega klorida v 8 volumnov destilirane vode. Mešanico pustimo 10-15 minut pri sobni temperaturi, nato z rdečimi krvnimi celicami obdelamo kot pri reakciji pasivne hemaglutinacije.

Specifičnost protitelesnega diagnostika se preverja v reakciji inhibicije pasivne hemaglutinacije s homolognim antigenom. Reakcijo mora vsaj 16-krat inhibirati homologni antigen in je ne sme inhibirati heterologni. Za zagotovitev odsotnosti spontane hemaglutinacije se uporablja kontrola.

S to reakcijo so patogeni indicirani v materialu, vzetem iz organov mrtvih ljudi in živali, na primer iz možganov, vranice in jeter pljuč. Pripravite 10 % suspenzijo teh organov v izotonični raztopini natrijevega klorida, jih centrifugirajte 30-60 minut pri 10.000 obratih na minuto in uporabite supernatant kot antigen.

Metodologija. Pripravite 2-kratne razredčine testnega materiala (antigena) v stabilizacijski raztopini. Dodajte 1 kapljico vsake razredčine antigena v 3 sosednje vdolbinice mikropanele (reakcija zavzame 3 vzporedne vrste vdolbinic). Dodajte 1 kapljico stabilizacijske raztopine v vsako vdolbinico prve vrste, 1 kapljico homolognega imunskega seruma, razredčenega 1:10 v vdolbinice druge vrste, 1 kapljico heterolognega imunskega seruma v tretjo vrsto. Druga in tretja vrstica služita kot kontrola za specifičnost reakcije. Zmes pustimo 20 minut pri sobni temperaturi.

V vse vdolbinice dodajte po 1 kapljico 1 % suspenzije senzibiliziranih eritrocitov (diagnostikum eritrocitnih protiteles) in plošče dobro pretresite. Rezultati reakcije se upoštevajo po 30-40 minutah. V prisotnosti specifičnega antigena opazimo hemaglutinacijo v prvi in ​​tretji vrsti (s heterolognim serumom) in je odsotna v drugi vrsti, kjer je antigen predhodno nevtraliziran s homolognim serumom.

Reakcijo spremljajo kontrole senzibiliziranih eritrocitov za spontano aglutinacijo.

Reakcija inhibicije povratne indirektne hemaglutinacije (RTONGA) omogoča določanje prisotnosti protiteles v serumih ljudi in živali.

Metodologija. Serume 10-krat razredčimo z izotonično raztopino natrijevega klorida, segrevamo 20 minut pri temperaturi 65 °C, da uničimo nespecifične inhibitorje, nato pa pripravimo 2-kratne razredčitve serumov v stabilizacijski raztopini in delovnem odmerku antigen, ki vsebuje 4 aglutinacijske enote. V vdolbinice mikropanela dodajte 1 kapljico vsake razredčine seruma in jim dodajte 1 kapljico antigena, katerega razredčitev ustreza delovnemu odmerku. Po 20-minutnem stiku komponent zmesi pri sobni temperaturi dodajte 1 kapljico diagnostikuma eritrocitnih protiteles v vse vdolbinice in dobro pretresite. Po 1,5-2 urah inkubacije pri sobni temperaturi se rezultati reakcije upoštevajo pri hemaglutinaciji. Titer seruma je njegova najvišja razredčitev, ki popolnoma zavre reakcijo hemaglutinacije s štirimi enotami aglutinacijskega antigena.

Reakcijo spremljajo kontrole senzibiliziranih eritrocitov za spontano aglutinacijo v prisotnosti: a) stabilizacijske raztopine; b) normalni antigen (iz materiala, ki ne vsebuje virusa); c) testni serum. Prednost reakcije je njena vsestranskost in možnost uporabe za odkrivanje različnih antigenov.

Vrednotenje rezultatov hemaglutinacije. Rezultati RNGA, RONGA in RTONGA se upoštevajo glede na stopnjo aglutinacije eritrocitov: (++++) – popolna aglutinacija; (+++) – manj popolna aglutinacija; (++) – delna aglutinacija; (+) – sledovi aglutinacije; (–) – odsotnost aglutinacije.

Reakcija se šteje za pozitivno, če je aglutinacija popolna (++++) ali skoraj popolna (+++), diagnostikum ne daje spontane aglutinacije v prisotnosti vsake komponente reakcije in nadzor specifičnosti antigen ali protitelo pozitivno.

Temelji na dejstvu, da rdeče krvne celice, na katere so predhodno adsorbirani antigeni, pridobijo sposobnost aglutinacije v prisotnosti homolognih serumov (protiteles).

V tem primeru rdeče krvne celice delujejo kot nosilci s specifičnimi determinantami, katerih aglutinacija se pojavi kot posledica reakcije antigen + protitelo.

Rdeče krvne celice, na površino katerih so antigeni trdno pritrjeni, se imenujejo eritrocitni antigenski diagnostik ali eritrociti, senzibilizirani z antigenom.

Druga vrsta RNGA - protitelesa se adsorbirajo na površini eritrocitov in njihova kasnejša aglutinacija se pojavi v prisotnosti homolognega antigena. V tem primeru se takšni eritrociti imenujejo eritrocitni protitelesni diagnostikum ali eritrociti, senzibilizirani s protitelesi.

Na podlagi teh dveh temeljnih metodoloških pristopov so bile razvite in uporabljene številne modifikacije RNGA. Tako se kot nosilci uporabljajo majhni standardni delci lateksa. V tem primeru se reakcija imenuje reakcija aglutinacije lateksa (RLA) ali se uporablja Staphylococcus aureus - reakcija koaglutinacije itd. Običajno se diagnostika eritrocitov pripravlja v podjetjih biološke industrije, glavna izkušnja RNGA pa se izvaja v diagnostičnih laboratorijih.

Priprava diagnostike eritrocitov vključuje naslednje korake:

• fiksacija rdečih krvničk s formaldehidom ali glutarnimi ali akrilnimi aldehidi. Tako obdelane rdeče krvničke so shranjene dolgo časa. Pogosteje se v ta namen uporabljajo eritrociti ovac, ljudi, kokoši itd.;
• obdelava fiksnih eritrocitov z raztopino tanina. Posledično rdeče krvne celice pridobijo sposobnost ireverzibilne adsorpcije beljakovin (virusov in protiteles) na svoji površini;
• preobčutljivost taniziranih eritrocitov z virusi ali protitelesi.

Treba je opozoriti, da so metode za pripravo diagnostike eritrocitov za virusne okužbe različne.

Postopek za izvajanje RNGA za odkrivanje in določanje titra protiteles je naslednji:

• enaki odmerki eritrocitov, senzibiliziranih z antigenom, se dodajo zaporednim 2-kratnim razredčitvam seruma;
• zmes pustimo 2-3 ure pri sobni temperaturi ali 16-18 ur pri 4 °C;
• upoštevati rezultate. Če serum vsebuje protitelesa proti virusu, s katerim so bile senzibilizirane rdeče krvne celice, opazimo hemaglutinacijo, ki jo ocenimo v križih.

Titer protiteles v serumu se šteje za najvišjo razredčino seruma, ki še zagotavlja hemaglutinacijo z vsaj dvema križanjema.

RNGA spremljajo vse ustrezne kontrole. Običajno se reakcija izvaja z mikrometodo.

RNGA vam omogoča reševanje naslednjih diagnostičnih težav:

• odkrivanje protiteles in določanje njihovega titra v krvnem serumu z znanim diagnostikom eritrocitnega antigena;
• odkrivanje in identifikacijo neznanega virusa z uporabo znane diagnostike protiteles proti eritrocitom.

Prednosti RNGA: visoka občutljivost, enostavnost tehnike namestitve in hitrost odziva. Vendar je pomembno opozoriti, da se pri pripravi stabilne diagnostike eritrocitov pojavijo velike težave (velika odvisnost od čistosti uporabljenih komponent, potreba po izbiri načina fiksacije, tanizacije in senzibilizacije eritrocitov za vsako vrsto virusa).