Aglutinacijske reakcije. Komponente, mehanizem, načini namestitve, uporaba. Reakcija posredne hemaglutinacije. Coombsova reakcija. Reakcija koaglutinacije. Reakcija inhibicije hemaglutinacije. Indirektna hemaglutinacijska reakcija Kaj je bolj natančno: rnga ali rpga

Indirektni ali pasivni hemaglutinacijski test (IRHA ali RPHA) je bolj občutljiv in specifičen kot aglutinacijski test. Tudi ta reakcija se uporablja v dveh smereh.

1) Za odkrivanje protiteles v pacientovem krvnem serumu se uporablja diagnostika eritrocitov, pri kateri se antigen adsorbira na površini eritrocitov, obdelanih s taninom. V zvezi s to reakcijo se pogosteje uporablja izraz RPHA.

Testni serum razredčimo v vdolbinicah plastičnih ploščic in dodamo eritrocitni diagnostik. S pozitivno reakcijo se vzdolž sten luknje pojavi tanek film v obliki "čipkastega dežnika", z negativno reakcijo pa se pojavi gosta usedlina rdečih krvničk v obliki "gumba".

2) Za odkrivanje toksinov in bakterijskih antigenov v testnem materialu se uporablja protitelesna eritrocitna diagnostika, pridobljena z adsorpcijo protiteles na eritrocitih. V zvezi s to reakcijo se pogosteje uporablja izraz RNGA. Na primer, s pomočjo diagnostike protiteles se odkrije antigen bacila kuge, eksotoksin davice in eksotoksin botulina.

Coombsov test (test aptiglobulina)

Reakcija se uporablja za odkrivanje nepopolnih protiteles, na primer protiteles proti faktorju Rh. Testni serum dodamo Rh + eritrocitom, v katerih se domneva prisotnost nepopolnih protiteles proti Rh faktorju. Po vezavi na rdeče krvne celice nepopolna protitelesa ne povzročijo aglutinacije, saj imajo le en aktiven center. Nato dodamo antiglobulinski serum, ki vsebuje protitelesa proti humanim globulinom. V kombinaciji z nepopolnimi protitelesi antiglobulinski serum povzroči aglutinacijo rdečih krvnih celic.

Reakcija padavin

Bistvo reakcije je sedimentacija (obarjanje) antigena pod vplivom specifičnih protiteles. Za dosego vidne reakcije je potrebna prisotnost elektrolita. Antigen v reakciji obarjanja so molekularno razpršene snovi.

Obročna reakcija obarjanja vstavljene v ozke precipitacijske cevi. Imunski serum vlijemo v epruveto in nanj previdno nanesemo testni material. Če je v njej antigen, se na meji med obema tekočinama oblikuje neprozoren obroč oborine.

Reakcija se uporablja v sodni medicini za določanje vrste beljakovin v krvnih madežih, semenu itd.; za določanje antigena pri diagnozi antraksa (Ascolijeva reakcija), meningitisa in drugih okužb; v sanitarnih in higienskih študijah - za ugotavljanje ponarejanja živilskih izdelkov. Imunski precipitacijski serumi se pridobijo z imunizacijo živali z ustreznim antigenom. Na primer, serum za obarjanje človeških beljakovin se pridobi z imunizacijo zajca s človeškimi beljakovinami. Titer precipitiranega seruma je največja razredčitev antigena, s katerim reagira. Serum se običajno uporablja nerazredčen ali v razredčitvi 1:5.

Reakcija obarjanja agarskega gela izvajajo z uporabo več metod. To so reakcija dvojne imunodifuzije, reakcija radialne imunodifuzije in reakcija imunoelektroforeze.

Dvojna imunodifuzijska reakcija(po Ouchterlonyju). Stopljeni agar gel vlijemo v petrijevko in po strditvi vanj izrežemo jamice. V nekatere vdolbinice damo antigen, v druge pa imunske serume, ki difundirajo v agar in na mestu srečanja tvorijo oborino v obliki belih trakov.

Radialna imunodifuzijska reakcija(po Manciniju). Imunski serum dodamo stopljenemu agar gelu in vlijemo v skodelico. Ko se agar strdi, vdolbinice izrežemo in vanje namestimo antigene, ki z difuzijo v agar tvorijo okrog vdolbinic obročaste precipitacijske cone. Večja kot je koncentracija antigena, večji je premer obroča. Reakcija se uporablja na primer za določanje imunoglobulinov različnih razredov v krvi. Imunoglobulini razredov IgG, IgM, IgA v tej reakciji delujejo kot antigeni, protitelesa proti njim pa so v specifičnih monoreceptorskih serumih.

Imunoelektroforeza. Elektroforezo proteinskih antigenov izvajamo v agar gelu. Obarjajoči serum se vnese v utor, ki poteka vzporedno s smerjo gibanja proteinov. Antigeni in protitelesa difundirajo v agar in tam, kjer se srečajo, nastanejo precipitacijske črte.

Reakcije imunske lize

Antigen (eritrociti ali bakterije) v kombinaciji s specifičnimi protitelesi tvori imunski kompleks, na katerega se veže komplement (C1), ki se aktivira po klasični poti. Aktivirani komplement razgradi rdeče krvne celice (hemoliza) ali bakterije (bakterioliza). Reakcija bakteriolize se uporablja za identifikacijo Vibrio cholerae.

Reakcija hemolize. Antigen v reakciji so eritrociti, protitelesa (hemolizini) so v hemolitičnem serumu. Hemolizini se vežejo na rdeče krvničke in aktivira se komplement, ki lizira rdeče krvne celice. Motna suspenzija rdečih krvnih celic se spremeni v prozorno svetlo rdečo tekočino - "lak kri". Ker se reakcija hemolize pojavi samo v prisotnosti komplementa, se uporablja kot indikator za dokazovanje komplementa.

Lokalna reakcija hemolize v gelu(Ernejeva reakcija) - različica reakcije hemolize. Služi za določanje števila celic, ki tvorijo protitelesa (AFC) v vranici in bezgavkah.

Stopljeni agar gel zmešamo s suspenzijo vraničnih celic in rdečih krvničk, po strditvi agarja pa dodamo komplement. Okrog vsake celice, ki proizvaja hemolizin, se oblikuje območje hemolize. Število celic, ki proizvajajo hemolizin, je določeno s številom takih con.

Reakcija direktne mikrobne aglutinacije (RA). Pri tej reakciji protitelesa (aglutinini) neposredno aglutinirajo korpuskularne antigene (aglutanogene). Običajno so predstavljeni s suspenzijo inaktiviranih mikroorganizmov (mikrobna reakcija aglutinacije). Glede na naravo nastalega aglutinata ločimo granularno in flokulentno aglutinacijo. Zrnata aglutinacija nastane, ko se mikrobi, ki vsebujejo O-antigen, zlepijo. Bakterije z bički (H-antigen) aglutinirajo in tvorijo velike kosmiče.

Za določitev vrste mikroorganizmov se uporabljajo standardni diagnostični aglutinacijski serumi. Pridobijo jih s hiperimunizacijo laboratorijskih živali s suspenzijo bakterij. Titer takega seruma je njegova najvišja razredčitev, pri kateri opazimo jasno aglutinacijo ustreznega antigena. Vendar pa zaradi kompleksnosti antigenske strukture bakterij aglutinacijski serumi vsebujejo protitelesa ne le proti vrstno specifičnim, ampak tudi proti skupinskim antigenom in lahko povzročijo skupinsko aglutinacijo s sorodnimi vrstami bakterij. Titri protiteles proti vrstno specifičnim antigenom v serumu so vedno višji kot proti skupinskim antigenom. Za odstranitev skupinsko specifičnih protiteles se v serum zaporedno dodajajo mikroorganizmi, ki vsebujejo skupinske antigene (metoda Castellani). Ta metoda proizvaja adsorbirane serume, ki vsebujejo protitelesa proti določeni vrsti mikroba.

Metode aglutinacijske reakcije. Najpogostejši sta lamelarni (približni) in razširjeni RA.

Plošča RA je postavljena na steklo. Pri tej reakciji se uporabljajo rahlo razredčeni ali nerazredčeni serumi. Uporablja se kot pospešena metoda za odkrivanje protiteles ali identifikacijo mikroorganizmov. Na kozarec nanesemo kapljico seruma, v katero z zanko vnesemo neznano bakterijsko kulturo, premešamo in po 2-3 minutah opazimo pojav drobnozrnate ali kosmičaste aglutinacije. Za kontrolo uporabimo kapljico fiziološke raztopine, v kateri po dodajanju bakterij opazimo motnost. Pri uporabi neadsorbiranih serumov je reakcija na steklu le okvirna.

Razširjena RA se izvaja v epruvetah ali vdolbinicah na ploščah. V tem primeru diagnostični serum razredčimo do titra in dodamo enake količine antigena. Če je rezultat pozitiven, se na dnu epruvete tvori rahla usedlina v obliki »dežnika«, če je rezultat negativen, se tvori usedlina v obliki »gumba«. Ker so titri skupinsko specifičnih protiteles v serumu veliko nižji od titrov vrstno specifičnih protiteles, so skupinske reakcije opažene le pri majhnih razredčinah seruma. Če pride do aglutinacije pred titrom ali do polovice titra seruma, je vrstno specifična.

Za določanje protiteles v bolnikovem serumu (serološka diagnostika) se uporablja standardni mikrobni diagnostikum, ki vsebuje suspenzijo znanih mikrobov ali njihovih antigenov. V tem primeru je možna tudi namestitev plošče in razporejenega RA.

Neposredna reakcija celične aglutinacije. Za določanje krvnih skupin se uporabljajo standardni krvni serumi darovalcev, ki vsebujejo znana protitelesa anti-A ali anti-B. Reakcije se izvajajo na steklu ali ploščah. Če imajo eritrociti A (2. krvna skupina), B (3. krvna skupina) ali oba antigena (4. krvna skupina), ustrezni serumi aglutinirajo eritrocite. Uporablja se tudi test združljivosti krvi, kjer se zmešata kapljici krvi dajalca in prejemnika ter oceni aglutinacija.

Klinike uporabljajo reakcijo aglutinacije levkocitov, trombocitov in drugih celic za identifikacijo avtoprotiteles, pa tudi za določanje antigenov na teh celicah.

Reakcija hemaglutinacije temelji na pojavu lepljenja rdečih krvničk, ki se pojavi pod vplivom različnih dejavnikov. Obstajata neposredna in posredna hemaglutinacija.
V reakciji neposredne hemaglutinacije se rdeče krvne celice zlepijo, ko se nanje adsorbirajo določeni antigeni, kot so virusi.

Indirektna (pasivna) reakcija hemaglutinacije (IRHA, RPHA) temelji na uporabi eritrocitov (ali lateksa) z adsorbiranimi antigeni ali protitelesi na njihovi površini, katerih interakcija z ustreznimi protitelesi ali antigeni pacientovega krvnega seruma povzroči, da se eritrociti zlepijo in izpadejo na dno. epruveto ali celico v obliki nazobčane usedline.

Komponente. Za izvedbo RNGA se lahko uporabijo eritrociti ovc, konj, zajcev, kokoši, miši, ljudi in drugih, ki jih shranijo za prihodnjo uporabo tako, da jih obdelajo s formaldehidom ali glutaraldehidom. Adsorpcijska sposobnost eritrocitov se poveča, če jih obdelamo z raztopinami tanina ali kromovega klorida.

Antigeni v RNGA so lahko polisaharidni antigeni mikroorganizmov, izvlečki bakterijskih cepiv, antigeni virusov in rikecij ter druge snovi.

Rdeče krvne celice, senzibilizirane s hipertenzijo, se imenujejo eritrocitni diagnostiki. Za pripravo eritrocitnega diagnostika se najpogosteje uporabljajo ovčji eritrociti, ki imajo visoko adsorpcijsko aktivnost.

Aplikacija. RNGA se uporablja za diagnosticiranje nalezljivih bolezni, določanje gonadotropnega hormona v urinu pri ugotavljanju nosečnosti, za prepoznavanje preobčutljivosti na zdravila, hormone in v nekaterih drugih primerih.

V seroloških študijah se uporablja reakcija inhibicije neposredne hemaglutinacije, ko virus, izoliran od bolnika, nevtraliziramo s specifičnim imunskim serumom in nato kombiniramo z rdečimi krvničkami. Odsotnost hemaglutinacije kaže na skladnost virusa in uporabljenega imunskega seruma.

Reakcijo indirektne hemaglutinacije (pasivno hemaglutinacijo) opazimo v primerih, ko eritrocitom, ki so bili predhodno obdelani (senzibilizirani) z različnimi antigeni, dodamo imunski serum ali pacientov serum z ustreznimi protitelesi. Pojavi se specifično lepljenje rdečih krvnih celic, njihova pasivna hemaglutinacija.

Posredna ali pasivna hemaglutinacijska reakcija je po občutljivosti in specifičnosti boljša od drugih seroloških metod in se uporablja pri diagnozi okužb, ki jih povzročajo bakterije, rikecije in praživali.

Metoda za izvedbo indirektne hemaglutinacijske reakcije je sestavljena iz več stopenj.

· Najprej rdeče krvne celice speremo z izotonično raztopino natrijevega klorida, nato pa jih po potrebi (pri uporabi proteinskih antigenov) obdelamo z raztopino tanina 1: 20.000 in senzibiliziramo s topnimi antigeni.

· Po izpiranju s pufrano izotonično raztopino natrijevega klorida je eritrocitni antigen pripravljen za uporabo.

· Testirane serume razredčimo z izotonično raztopino natrijevega klorida v epruvetah ali posebnih plastičnih ploščicah z vdolbinicami, nato vsaki razredčitvi seruma dodamo eritrocitni diagnostik.

· Rezultati reakcije indirektne hemaglutinacije se upoštevajo glede na naravo usedline rdečih krvnih celic, ki nastane na dnu epruvete.

· Pozitiven je rezultat reakcije, pri katerem rdeče krvne celice enakomerno prekrijejo celotno dno epruvete. Pri negativni reakciji se rdeče krvne celice v obliki majhnega diska ali "gumba" nahajajo na sredini dna epruvete.

· Po 2 urah inkubacije pri 37 °C se upoštevajo rezultati, pri čemer se oceni videz usedline rdečih krvničk (brez stresanja): pri negativni reakciji se pojavi usedlina v obliki kompaktnega diska ali obroča pri dno jamice; s pozitivno reakcijo se pojavi značilna čipkasta usedlina rdečih krvnih celic, tanek film z neravnimi robovi

Reakcija koaglutinacije.

Ta reakcija temelji na edinstveni lastnosti Staphylococcus aureus, ki vsebuje protein A v svoji celični steni, da se veže na Fc fragmente IgG in IgM.

V tem primeru aktivni centri protiteles ostanejo prosti in lahko komunicirajo s specifičnimi determinantami antigenov. Na predmetno stekelce nanesemo kapljico 2% suspenzije stafilokokov, senzibiliziranih z ustreznimi protitelesi, in dodamo kapljico suspenzije proučevane bakterije. Če se antigen ujema s protitelesi, pride do jasne aglutinacije stafilokokov, obremenjenih s protitelesi, v 30-60 s.

Zahteve za imunski serum, ki se uporablja za senzibilizacijo stafilokoknih celic in potek procesa senzibilizacije. Za pridobitev koaglutinacijskega reagenta je treba suspenzijo stafilokokov obdelati z imunskim serumom proti želenemu antigenu. Serum je treba vzeti od živali, katere IgG ima afiniteto za protein A. Največjo afiniteto zanj imajo imunoglobulini ljudi, prašičev, psov in morskih prašičkov, najmanj - osla in kunca, IgG ovc, konj, podgane in miši z njim zelo slabo deluje.

Poleg stroge specifičnosti za želeni antigen serum, ki se uporablja pri RCOA, ne sme vsebovati protiteles proti stafilokoku, da bi se izognili aglutinaciji stafilokoknega reagenta zaradi specifičnega učinka antigena in protiteles, ki jih je treba izključiti v IgG - proteinu. Sistem. Kontrola poteka z mešanjem ene kapljice seruma in 10% suspenzije stafilokoknega reagenta na kozarcu. Če po 3...5 minutah ne nastanejo aglutinirani kosmiči, se šteje, da je serum primeren za reakcijo.

Če razpoložljivi vzorci seruma za ta antigen aglutinirajo stafilokoke, jih je mogoče adsorbirati s suspenzijo stafilokoknih celic, ki nimajo proteina A (na primer sevi Wood-46). Na ta način se odstranijo protitelesa, ki reagirajo s stafilokokom zaradi fragmentov Fab.

Zato mora serum, uporabljen za pripravo koaglutinacijskega reagenta, izpolnjevati naslednje zahteve:

pridobljeno iz živali proizvajalk, katerih IgG ima afiniteto za protein A;
imeti mora specifičnost za želeni antigen;
ne vsebuje protiteles proti stafilokoku.

· Priprava diagnostike. Pripravljen 10% stafilokokni reagent združimo z enako količino imunskega seruma v predhodno določeni optimalni delovni razredčini. Zmes stresamo 60 minut pri 40...42 °C v shutgel aparatu pri 90 nihajih na minuto. Nato jih po 15 minutah dvakrat speremo s PBS, resuspendiramo v 2 % suspenzijo in konzerviramo z natrijevim mertiolatom (1:10.000).

Lekcija 14

Tema: Indirektne serološke reakcije. Reakcije posredne hemaglutinacije (IRHA), fiksacije komplementa (IFR).

Protitelesa

Protitelesa so beljakovinske molekule, ki se lahko specifično vežejo na antigene. Protitelesa spadajo med gama globuline. Drugo ime za protitelesa je imunoglobulin. Pri sesalcih obstaja 5 razredov imunoglobulinov, ki se razlikujejo po strukturi in nekaterih lastnostih: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.

Struktura imunoglobulinov. IgG ima najbolj "tipično" strukturo. Molekulo sestavljajo 4 beljakovinske verige: dve lahki (L) in dve težki (H), ki sta povezani z disulfidnimi vezmi. Področje protitelesa, ki se veže na antigen, se imenuje aktivno mesto protitelesa. V molekuli IgG sta 2 aktivna centra. Tvorijo ga N-končna področja težke in lahke verige. Območje težkih verig, ki se nahaja v bližini disulfidnih vezi, se imenuje območje tečaja. S pomočjo encima papain se molekula IgG nad zgibno regijo razdeli na 3 fragmente: 2 od njih vsebujeta lahko verigo in del težke verige (Fab fragmenti); in tretji fragment je sestavljen samo iz dela težkih verig (Fc fragment). Zahvaljujoč premičnemu tečajnemu območju lahko fragmenti Fab spreminjajo svoj relativni položaj v prostoru.

Aminokislinska zaporedja lahkih in težkih verig so razdeljena na konstantne in variabilne regije. Variabilne regije se nahajajo na N-koncih lahke in težke verige (VL in VH). Konstantne regije se nahajajo na C-koncih verig (CL in CH). V lahkih in težkih verigah aminokislinske sekvence tvorijo več globularnih struktur, imenovanih domene.

Aktivno središče protitelesa tvorijo variabilne domene lahke in težke verige in je votlina ( paratop), ki ima določeno konfiguracijo in porazdelitev električnih nabojev na svoji površini. Velikost, oblika in porazdelitev naboja aktivnega mesta določajo njegovo specifičnost, to je sposobnost vezave na specifično antigensko determinanto ( epitop), ki ima komplementarno strukturo.

Antigenske determinante so področja, ki štrlijo na površini molekul antigena. Zato se interakcija epitop-paratop zgodi po principu "ključ-ključavnica".

Moč povezave med aktivnim središčem protiteles in antigensko determinanto označuje koncept afinitete. Afiniteta je merilo afinitete aktivnega mesta in antigenske determinante.

Imunoglobulini razreda IgG predstavljajo 75% celotne količine serumskih imunoglobulinov. Pomembna lastnost IgG je njegova sposobnost prehajanja skozi placento. Tako materina protitelesa vstopijo v otrokovo telo in ga v prvih mesecih življenja zaščitijo pred okužbo (naravna pasivna imunost).

Približno 10% celotnega bazena imunoglobulinov spada v razred IgM. Molekula IgM je pentamer, to je, da je sestavljena iz 5 enakih molekul, po strukturi podobnih molekuli IgG, in ima 10 aktivnih centrov. Podenote so med seboj povezane z disulfidnimi vezmi. Molekula IgM ima dodatno verigo J, ki povezuje podenote. Protitelesa IgM ne prehajajo placentne pregrade.

Protitelesa razreda IgA predstavljajo 15-20% celotne vsebnosti imunoglobulinov. Molekula IgA je sestavljena iz 2 lahkih in 2 težkih verig in ima 2 aktivna centra. V krvnem serumu je IgA prisoten v monomerni obliki, medtem ko je v izločkih sluznice IgA v obliki dimerov in se imenuje sekretorni ali sIgA in ima 4 aktivne centre. C-konci težkih verig v molekuli sIgA so med seboj povezani z J-verigo in proteinsko molekulo, imenovano sekretorna komponenta. Sekretorna komponenta ščiti sIgA pred razgradnjo s proteolitičnimi encimi, ki jih v velikih količinah vsebujejo izločki sluznice. Glavna naloga sIgA je zaščita sluznice pred okužbo. IgA ne prodre skozi placentno pregrado. Visoke koncentracije sIgA najdemo v materinem mleku, zlasti v prvih dneh laktacije. Ščitijo prebavila novorojenčka pred okužbo.

IgD se nahaja predvsem na membrani limfocitov B. Imajo podobno strukturo kot IgG, 2 aktivna centra. Biološka vloga ni povsem znana.

IgE - koncentracija tega razreda imunoglobulinov v krvnem serumu je izjemno nizka. Molekule IgE so v glavnem fiksirane na površini mastocitov in bazofilcev. IgE je po strukturi podoben IgG in ima 2 aktivna centra. Domneva se, da je IgE bistvenega pomena za razvoj anthelmintične imunosti. IgE ima pomembno vlogo v patogenezi nekaterih alergijskih bolezni (bronhialna astma, seneni nahod) in anafilaktičnega šoka.

Reakcija posredne hemaglutinacije

Pri posrednih seroloških reakcijah kompleks antigenov s protitelesi s prostim očesom ni viden. V takšnih primerih se antigeni adsorbirajo na večjih nosilnih delcih (eritrocitih, delcih lateksa), pri čemer dobimo antigenski eritrocitni diagnostikum. Kasnejša aglutinacija takšnih delcev s specifičnimi protitelesi omogoča, da aglutinat (oborino) vidimo s prostim očesom. Posredna (pasivna) hemaglutinacijska reakcija (IRHA) zazna protitelesa v krvnem serumu s pomočjo antigenskega diagnostika eritrocitov, ki so eritrociti z adsorbiranimi antigeni.

Rdeče krvne celice z adsorbiranimi antigeni medsebojno delujejo z ustreznimi protitelesi v krvnem serumu, kar povzroči, da se rdeče krvne celice zlepijo in izpadejo na dno epruvete ali celice v obliki nazobčane usedline. Pri negativni reakciji se rdeče krvničke usedejo v obliki gumba.

RNGA se nahaja v plastičnih tabletah ali v epruvetah z razredčinami krvnega seruma, ki jim je dodan eritrocitni diagnostik.

Včasih se uporablja protitelesni eritrocitni diagnostik - rdeče krvne celice, na katerih so adsorbirana protitelesa. Ta reakcija se imenuje RONGA - reakcija povratne indirektne hemaglutinacije.

Komponente RNGA:

pacientov krvni serum (razredčen 1:25);

Eritrocitni diagnostik (eritrociti, obremenjeni z antigenom proučevanega patogena);

Raztopina za pranje.

Uprizoritev RNGA. Dve kapljici raztopine fosfatnega pufra dodamo v sedem vdolbinic plošče za imunološke študije. Dve kapljici pacientovega krvnega seruma dodamo v prvo vdolbinico, nato pa 2 kapljici prenesemo iz prve v drugo vdolbinico, iz druge v tretjo itd. 2 kapljici odstranimo iz šeste vdolbinice. V vseh sedem vdolbinic (6 eksperimentalnih in 1 kontrolno) dodamo po 2 kapljici eritrocitnega diagnostika. Po vsaki operaciji je potrebno pipeto sprati s pralno raztopino. Plošče pustimo pri sobni temperaturi 45 minut, nato pa zabeležimo rezultate.

Reakcija fiksacije komplementa

Reakcija fiksacije komplementa je, da ko se antigen združi s protitelesom, nastane imunski kompleks, na katerega je vezan komplement preko Fc fragmenta protiteles. Če kompleks antigen-protitelo ne nastane, ostane komplement prost. Prosti komplement odkrijemo tako, da zmesi dodamo hemolitični sistem, ki ga sestavljajo ovčje rdeče krvničke in protitelesa proti njim. Pozitivna reakcija je odsotnost hemolize kot posledica vezave komplementa na kompleks antigen + protitelo. Negativna reakcija je prisotnost hemolize kot posledica vezave komplementa na kompleks eritrocit + antieritrocitno protitelo.

Komponente RSK:

Zdrav krvni serum;

pacientov krvni serum (razredčen 1:5);

Antigenska komponenta reakcije je inaktiviran patogen;

Komplement v razredčitvi, ki ustreza delovnemu odmerku. Komplement se pridobiva iz krvnega seruma morskih prašičkov. Titer komplementa je njegov najmanjši odmerek, ki v prisotnosti hemolitičnega seruma povzroči popolno hemolizo rdečih krvničk. Delovni odmerek komplementa, ki se uporablja pri proizvodnji RSC, je za 30 % večji od njegovega titra;

Hemolitični sistem je suspenzija ovčjih eritrocitov, obdelanih s kunčjimi protitelesi proti ovčjim eritrocitom.

Raztopina za pranje.

Uprizoritev RSK. RSC se postavi v dve epruveti - poskusno in kontrolno. V epruveto dodamo 0,5 ml krvnega seruma pacienta, v kontrolno 0,5 ml krvnega seruma zdravega darovalca, v obe epruveti po 0,5 ml lizata povzročitelja in 0,5 ml dopolnjujejo. Po vsaki operaciji je potrebno pipeto sprati s pralno raztopino. Epruvete postavimo v termostat pri 37 °C za 30 minut. Po inkubaciji v obe epruveti dodamo 1,0 ml hemolitičnega sistema. Epruvete pretresemo in postavimo v termostat pri 37 °C za 30 minut. Če je reakcija pozitivna, pride do zakasnitve hemolize v epruveti (brezbarvna tekočina in usedlina rdečih krvničk), v kontrolni epruveti pa do hemolize rdečih krvničk.

Literatura za pripravo na lekcijo:

1. Borisov mikrobiologija, virologija, imunologija. M., 2002.

2. Medicinska mikrobiologija, virologija in imunologija. Ed. . M., 2004.

3. Pozdeev mikrobiologija. M., GEOTAR-MEDIA, 2005.

Temelji na dejstvu, da rdeče krvne celice, na katere so predhodno adsorbirani antigeni, pridobijo sposobnost aglutinacije v prisotnosti homolognih serumov (protiteles).

V tem primeru rdeče krvne celice delujejo kot nosilci s specifičnimi determinantami, katerih aglutinacija se pojavi kot posledica reakcije antigen + protitelo.

Rdeče krvne celice, na površino katerih so antigeni trdno pritrjeni, se imenujejo eritrocitni antigenski diagnostik ali eritrociti, senzibilizirani z antigenom.

Druga vrsta RNGA - protitelesa se adsorbirajo na površini eritrocitov in njihova kasnejša aglutinacija se pojavi v prisotnosti homolognega antigena. V tem primeru se takšni eritrociti imenujejo eritrocitni protitelesni diagnostikum ali eritrociti, senzibilizirani s protitelesi.

Na podlagi teh dveh temeljnih metodoloških pristopov so bile razvite in uporabljene številne modifikacije RNGA. Tako se kot nosilci uporabljajo majhni standardni delci lateksa. V tem primeru se reakcija imenuje reakcija aglutinacije lateksa (RLA) ali se uporablja Staphylococcus aureus - reakcija koaglutinacije itd. Običajno se diagnostika eritrocitov pripravlja v podjetjih biološke industrije, glavna izkušnja RNGA pa se izvaja v diagnostičnih laboratorijih.

Priprava diagnostike eritrocitov vključuje naslednje korake:

fiksacija rdečih krvničk s formaldehidom ali glutarnimi ali akrilnimi aldehidi. Tako obdelane rdeče krvničke so shranjene dolgo časa. Pogosteje se v ta namen uporabljajo eritrociti ovac, ljudi, kokoši itd.;
obdelava fiksnih eritrocitov z raztopino tanina. Posledično rdeče krvne celice pridobijo sposobnost ireverzibilne adsorpcije beljakovin (virusov in protiteles) na svoji površini;
preobčutljivost taniziranih eritrocitov z virusi ali protitelesi.

Treba je opozoriti, da so metode za pripravo diagnostike eritrocitov za virusne okužbe različne.

Postopek za izvajanje RNGA za odkrivanje in določanje titra protiteles je naslednji:

enaki odmerki eritrocitov, senzibiliziranih z antigenom, se dodajo zaporednim 2-kratnim razredčitvam seruma;
zmes pustimo 2-3 ure pri sobni temperaturi ali 16-18 ur pri 4 °C;
upoštevati rezultate. Če serum vsebuje protitelesa proti virusu, s katerim so bile senzibilizirane rdeče krvne celice, opazimo hemaglutinacijo, ki jo ocenimo v križih.

Titer protiteles v serumu se šteje za najvišjo razredčino seruma, ki še zagotavlja hemaglutinacijo z vsaj dvema križanjema.

RNGA spremljajo vse ustrezne kontrole. Običajno se reakcija izvaja z mikrometodo.

RNGA vam omogoča reševanje naslednjih diagnostičnih težav:

odkrivanje protiteles in določanje njihovega titra v krvnem serumu z znanim diagnostikom eritrocitnega antigena;
odkrivanje in identifikacijo neznanega virusa z uporabo znane diagnostike protiteles proti eritrocitom.

Prednosti RNGA: visoka občutljivost, enostavnost tehnike namestitve in hitrost odziva. Vendar je pomembno opozoriti, da se pri pripravi stabilne diagnostike eritrocitov pojavijo velike težave (velika odvisnost od čistosti uporabljenih komponent, potreba po izbiri načina fiksacije, tanizacije in senzibilizacije eritrocitov za vsako vrsto virusa).

Spletno mesto ponuja referenčne informacije samo v informativne namene. Diagnozo in zdravljenje bolezni je treba izvajati pod nadzorom specialista. Vsa zdravila imajo kontraindikacije. Potreben je posvet s strokovnjakom!

Serološki analiza krvi je metoda za laboratorijsko testiranje določenih antigenov ali protiteles ( specifične beljakovine) v bolnikovem krvnem serumu na podlagi imunskih odzivov telesa. Ta metoda se uporablja, ko diagnostiko nalezljive bolezni za odkrivanje prisotnosti protiteles v bolnikovi krvi proti določeni vrsti virusa ali bakterije, pa tudi za določitev krvne skupine.

Material v študiji

Najprej se za serološko analizo uporabi biološki material, zbran od pacienta:

krvni serum
slina
fekalne snovi

V nekaterih primerih se pregleda material, izoliran iz določenih okoljskih predmetov:

Metoda analize ali odvzem krvi

Ta analiza ne zahteva posebne priprave bolnika. Vzorčenje krvi se izvaja zjutraj na prazen želodec in se izvaja v prostorih za zdravljenje zdravstvenih ustanov po splošno sprejetih hematoloških metodah. Za serološko preiskavo odvzamemo kri na dva načina: vensko kri vzamemo iz ulnarne vene in kapilarno kri iz prstanca. Kri se da v sterilne zaprte epruvete.

Značilnosti transporta krvi in shranjevanja seruma

Takoj po odvzemu krvi se prepelje v poseben laboratorij, kjer se še isti dan pripravi serum. Sirotko lahko shranjujete največ 4–6 dni v hladilniku pri temperaturi 2–4 stopinje. Če je potrebno daljše skladiščenje, sirotko zamrznemo. Da ne bi ogrozili kakovosti sirotke, jo je dovoljeno enkrat zamrzniti in v skladu s tem odmrzniti. Pri dolgotrajnem skladiščenju protitelesa izgubijo svoje lastnosti in postanejo delno neaktivna, imunoglobulini razreda so najbolj občutljivi na zamrzovanje M. Po odtajanju seruma je potrebno temeljito premešati do gladkega, kar pomaga obnoviti koncentracijo protiteles, ki jih vsebuje ta serum.

Za kaj se uporabljajo serološki testi?

Serološke laboratorijske diagnostične metode se uporabljajo za ugotavljanje bolezni kot npr ehinokokoza, trihineloza, toksokaroza, opistorhoza, cisticerkoza, toksoplazmoza, amebiaza, giardijaza, za ugotavljanje učinkovitosti poteka zdravljenja in končno za odkrivanje ponavljajoče se bolezni po tem, ko bolnik popolnoma okreva.

Osnovne metode serološke diagnostike

Imunofluorescenčna reakcija (RIF)

Ta reakcija je posredna različica serološkega testa, to je, da se izvaja v dveh fazah. Na prvi stopnji se zahtevano protitelo identificira v krožečem kompleksu antigen-protitelo s pomočjo antiglobulina, ki je po strukturi podoben proteinom imunskega seruma. Identifikacija želenega protitelesa je možna tudi s proučevanjem vnaprej pripravljenega antigenskega preparata pod fluorescenčnim mikroskopom, brez uporabe antiglobulinov.

Imunofluorescenčna reakcija je zelo delovno intenziven proces, ki od strokovnjaka zahteva veliko časa in odgovornosti. Reakcija se začne s pripravo raztopin, nato se serumi in njihovi kontrolni vzorci titrirajo ( postopek, ki omogoča določanje vsebnosti določene snovi s postopnim mešanjem preskusne raztopine z nadzorovano količino reagenta). Predhodno pripravljene razredčine in njihove kontrolne vzorce previdno nanesemo na stekelca z antigenom. Nato pripravke inkubiramo, čemur sledi pranje in sušenje na zraku. Na stekelca z antigenom se nanese tanek sloj antiseruma, nato se izvede sekundarna inkubacija preparatov in ponovi celotna predhodna veriga dejanj, ki se zaključi s sušenjem preparata. Posledično preparat na stekelcu obdelamo z glicerolom in pregledamo pod fluorescenčnim mikroskopom.

Rezultati reakcije se ocenjujejo na štiristopenjski lestvici, za katero je značilna intenzivnost površinskega rumeno-zelenega sijaja antigenskih celic:
+ zelo šibek sijaj celice, opazen le na njenem obrobju
++ šibek sijaj periferije celice, vendar z jasno opaznim zelenim odtenkom
+++/++++ svetlo zelen sijaj periferije celice
Reakcijski titer se šteje za razredčino seruma, kjer ima vsaj 50 % antigenskih celic jasen površinski sijaj, kar je rezultat reakcije. +++ oz ++++ . Vrednost reakcijskega območja je od 1/80 do 1/100.

Intenzivnost reakcije je odvisna od števila oborjenih rdečih krvnih celic na dnu oblikovanih lukenj:
– negativna reakcija, za katero je značilno odlaganje rdečih krvnih celic na dno vdolbinic v obliki majhnega obroča z gladkimi robovi ali "gumba"
+ nizke intenzivnosti, so za to reakcijo značilne majhne posamezne usedline na dnu luknje. Neaglutinirane rdeče krvne celice tvorijo "majhen obroč" v središču jamice
++ srednje intenzivnosti, zanj je značilna tvorba na dnu luknje "širokega gostega obroča" neaglutiniranih eritrocitov
+++ intenzivna reakcija, aglutinirani eritrociti tvorijo tako imenovane "dežnike", v središču katerih so jasno vidni obroči, ki jih tvorijo usedli neaglutinirani eritrociti.
++++ zelo intenzivna reakcija, pri kateri vse rdeče krvne celice aglutinirajo in tvorijo "dežnike" na dnu vdolbinic.
Titer te reakcije velja za zadnjo razredčino seruma, pri kateri je zaznana vsaj očitna aglutinacija eritrocitov. +++ , to je z intenzivno ali močno intenzivno reakcijo.

Zanesljivost in kakovost seroloških diagnostičnih metod sta odvisni od organizacije notranjega in zunanjega laboratorijskega nadzora, ki ga sestavlja več neodvisnih postopkov, namenjenih ocenjevanju kakovosti rezultatov analize.