Reakcije aglutinacije. Komponente, mehanizam, način ugradnje, primjena. Indirektna reakcija hemaglutinacije. Coombsova reakcija. Reakcija koaglutinacije. Reakcija inhibicije hemaglutinacije. Reakcija indirektne hemaglutinacije Što je preciznije: rnga ili rpga

Indirektni ili pasivni hemaglutinacijski test (IRHA ili RPHA) je osjetljiviji i specifičniji od testa aglutinacije. Ova reakcija se također koristi u dva smjera.

1) Za otkrivanje antitijela u krvnom serumu pacijenta koristi se dijagnostika eritrocita, u kojoj se antigen adsorbira na površini eritrocita tretiranih taninom. U odnosu na ovu reakciju češće se koristi termin RPHA.

Test serum se razblaži u jažice plastičnih ploča i dodaje se eritrocitni dijagnostikum. Uz pozitivnu reakciju, tanak film se pojavljuje duž zidova rupe u obliku "čipkastog kišobrana", s negativnom reakcijom pojavljuje se gusti sediment crvenih krvnih stanica u obliku "dugma".

2) Za otkrivanje toksina i bakterijskih antigena u ispitivanom materijalu koristi se dijagnostika eritrocita antitela, dobijena adsorpcijom antitela na eritrocite. U odnosu na ovu reakciju češće se koristi termin RNGA. Na primjer, uz pomoć dijagnostike antitijela otkrivaju se antigen bacila kuge, egzotoksin difterije i egzotoksin botulinuma.

Coombsov test (aptiglobulinski test)

Reakcija se koristi za otkrivanje nepotpunih antitijela, na primjer, antitijela na Rh faktor. Test serum se dodaje Rh + eritrocitima, u kojima se pretpostavlja prisustvo nekompletnih antitela na Rh faktor. Vezana za crvena krvna zrnca, nekompletna antitijela ne izazivaju aglutinaciju, jer imaju samo jedan aktivni centar. Zatim se dodaje antiglobulinski serum koji sadrži antitijela na humane globuline. U kombinaciji s nepotpunim antitijelima, antiglobulinski serum uzrokuje aglutinaciju crvenih krvnih stanica.

Reakcija precipitacije

Suština reakcije je taloženje (precipitacija) antigena pod utjecajem specifičnih antitijela. Za postizanje vidljive reakcije neophodno je prisustvo elektrolita. Antigen u reakciji precipitacije su molekularno raspršene supstance.

Prstenasta reakcija precipitacije smeštene u uske taložne cevi. Imuni serum se sipa u epruvetu, a na nju se pažljivo slojevito nanosi test materijal. Ako se u njemu nalazi antigen, na granici dvije tekućine formira se neprozirni prsten taloga.

Reakcija se koristi u sudskoj medicini za određivanje vrste proteina u mrljama krvi, sjemenu itd.; za određivanje antigena u dijagnozi antraksa (Ascolijeva reakcija), meningitisa i drugih infekcija; u sanitarno-higijenskim studijama - za utvrđivanje krivotvorenja prehrambenih proizvoda. Imunološki precipitirajući serumi se dobijaju imunizacijom životinja odgovarajućim antigenom. Na primjer, serum za taloženje ljudskih proteina dobiva se imunizacijom zeca ljudskim proteinom. Titar precipitirajućeg seruma je najveće razrjeđenje antigena s kojim reaguje. Serum se obično koristi nerazrijeđen ili u razrjeđenju 1:5.

Reakcija precipitacije agar gela izvedeno na nekoliko metoda. To su reakcija dvostruke imunodifuzije, reakcija radijalne imunodifuzije i reakcija imunoelektroforeze.

Dvostruka imunodifuzijska reakcija(prema Ouchterlony). Otopljeni agar gel se sipa u Petrijevu posudu i nakon stvrdnjavanja u njoj se izrezuju bunari. U neke jažice se stavlja antigen, a u druge imuni serumi koji difundiraju u agar i formiraju talog u obliku bijelih pruga na mjestu susreta.

Radijalna imunodifuzijska reakcija(prema Mancini). Imuni serum se dodaje u otopljeni agar gel i sipa u šolju. Nakon što se agar stvrdne, izrezuju se jažice i u njih se stavljaju antigeni koji, difundirajući u agar, formiraju prstenaste precipitacijske zone oko jažica. Što je veća koncentracija antigena, to je veći prečnik prstena. Reakcija se koristi, na primjer, za određivanje imunoglobulina različitih klasa u krvi. Imunoglobulini klasa IgG, IgM, IgA djeluju kao antigeni u ovoj reakciji, a antitijela protiv njih nalaze se u specifičnim monoreceptorskim serumima.

Imunoelektroforeza. Elektroforeza proteinskih antigena provodi se u agar gelu. Precipitirajući serum se uvodi u žljeb, koji ide paralelno sa smjerom kretanja proteina. Antigeni i antitijela difundiraju u agar i na mjestu susreta formiraju se precipitacijske linije.

Reakcije imunološke lize

Antigen (eritrociti ili bakterije), kombinujući se sa specifičnim antitijelima, formira imuni kompleks za koji se veže komplement (C1), a komplement se aktivira klasičnim putem. Aktivirani komplement lizira crvena krvna zrnca (hemoliza) ili bakterije (bakterioliza). Reakcija bakteriolize se koristi za identifikaciju Vibrio cholerae.

Reakcija hemolize. Antigen u reakciji su eritrociti, antitijela (hemolizini) se nalaze u hemolitičkom serumu. Hemolizini se vežu za crvena krvna zrnca i aktivira se komplement koji lizira crvena krvna zrnca. Zamućena suspenzija crvenih krvnih zrnaca pretvara se u prozirnu jarko crvenu tekućinu - „krv laka“. Pošto se reakcija hemolize javlja samo u prisustvu komplementa, ona se koristi kao indikator za detekciju komplementa.

Lokalna reakcija hemolize u gelu(Erne reakcija) - varijanta reakcije hemolize. Služi za određivanje broja ćelija koje stvaraju antitijela (AFC) u slezeni i limfnim čvorovima.

Otopljeni agar gel se pomiješa sa suspenzijom stanica slezene i crvenih krvnih zrnaca, a nakon što se agar očvrsne, dodaje se komplement. Oko svake ćelije koja proizvodi hemolizin formira se zona hemolize. Broj ćelija koje proizvode hemolizin određen je brojem takvih zona.

Direktna reakcija mikrobne aglutinacije (RA). U ovoj reakciji, antitijela (aglutinini) direktno aglutiniraju korpuskularne antigene (aglutanogene). Obično su predstavljeni suspenzijom inaktiviranih mikroorganizama (reakcija mikrobne aglutinacije). Na osnovu prirode formiranog aglutinata razlikuju se granularna i flokulentna aglutinacija. Granularna aglutinacija nastaje kada se mikrobi koji sadrže O-antigen drže zajedno. Bakterije sa flagelama (H-antigen) aglutiniraju i formiraju velike pahuljice.

Za određivanje vrste mikroorganizama koriste se standardni dijagnostički aglutinirajući serumi. Dobivaju se hiperimunizacijom laboratorijskih životinja suspenzijom bakterija. Titar takvog seruma je njegovo najveće razrjeđenje pri kojem se opaža jasna aglutinacija odgovarajućeg antigena. Međutim, zbog složenosti antigenske strukture bakterija, aglutinirajući serumi sadrže antitijela ne samo na specifične, već i na grupne antigene i mogu dati grupnu aglutinaciju sa srodnim vrstama bakterija. Titri antitela na antigene specifične za vrstu u serumu su uvek veći nego na grupne antigene. Za uklanjanje grupno-specifičnih antitijela, mikroorganizmi koji sadrže grupne antigene se uzastopno dodaju u serum (Castellani metoda). Ova metoda proizvodi adsorbirane serume koji sadrže antitijela na određenu vrstu mikroba.

Metode reakcija aglutinacije. Najčešći su lamelarni (približni) i prošireni RA.

Ploča RA se postavlja na staklo. U ovoj reakciji se koriste blago razrijeđeni ili nerazrijeđeni serumi. Koristi se kao ubrzana metoda za detekciju antitijela ili identifikaciju mikroorganizama. Na staklo se nanese kap seruma, u koju se petljom unese nepoznata bakterijska kultura, promiješa se i nakon 2-3 minute uočava se pojava sitnozrnate ili ljuskaste aglutinacije. Za kontrolu se koristi kap fiziološke otopine, u kojoj se nakon dodavanja bakterija opaža zamućenost. Kod upotrebe neadsorbiranih seruma, reakcija na staklu je samo indikativna.

Prošireni RA se izvodi u epruvetama ili pločama. U tom slučaju, dijagnostički serum se razrijedi do titra i dodaju jednake količine antigena. Ako je rezultat pozitivan, na dnu epruvete se formira labav talog u obliku „kišobrana“, a ako je rezultat negativan, formira se sediment u obliku „dugma“. Budući da su titri grupno-specifičnih antitijela u serumu mnogo niži od titara specifičnih za vrstu antitijela, grupne reakcije se uočavaju samo u malim razrjeđenjima seruma. Ako se aglutinacija dogodi prije titra ili do polovine titra seruma, to je specifično za vrstu.

Za određivanje antitijela u serumu pacijenta (serološka dijagnoza) koristi se standardni mikrobni dijagnostikum koji sadrži suspenziju poznatih mikroba ili njihovih antigena. U ovom slučaju je također moguće ugraditi ploču i raspoređeni RA.

Direktna reakcija aglutinacije stanica. Za određivanje krvnih grupa koriste se standardni serumi krvi donora koji sadrže poznata anti-A ili anti-B antitijela. Reakcije se izvode na staklu ili pločama. Ako eritrociti imaju A (2. krvna grupa), B (3. krvna grupa) ili oba antigena (4. krvna grupa), odgovarajući serumi aglutiniraju eritrocite. Koristi se i test kompatibilnosti krvi, gdje se miješaju kapi krvi davaoca i primaoca i procjenjuje se aglutinacija.

Klinike koriste reakciju aglutinacije leukocita, trombocita i drugih stanica za identifikaciju autoantitijela, kao i za određivanje antigena na tim stanicama.

Reakcija hemaglutinacije zasniva se na fenomenu sljepljivanja crvenih krvnih zrnaca, koje nastaje pod utjecajem različitih faktora. Postoje direktna i indirektna hemaglutinacija.
U reakciji direktne hemaglutinacije, crvena krvna zrnca se lijepe kada se određeni antigeni, kao što su virusi, adsorbiraju na njih.

Indirektna (pasivna) reakcija hemaglutinacije (IRHA, RPHA) temelji se na upotrebi eritrocita (ili lateksa) s antigenima ili antitijelima adsorbiranim na njihovoj površini, čija interakcija s odgovarajućim antitijelima ili antigenima krvnog seruma pacijenata uzrokuje da se eritrociti zalijepe zajedno i ispadnu na dno epruveta ili ćelija u obliku zupčastog sedimenta.

Komponente. Za izvođenje RNGA mogu se koristiti eritrociti ovaca, konja, zečeva, pilića, miševa, ljudi i drugih, koji se pohranjuju za buduću upotrebu tretiranjem formaldehidom ili glutaraldehidom. Kapacitet adsorpcije eritrocita se povećava kada se tretiraju rastvorima tanina ili hrom-hlorida.

Antigeni u RNGA mogu biti polisaharidni antigeni mikroorganizama, ekstrakti bakterijskih vakcina, antigeni virusa i rikecija, kao i druge supstance.

Crvena krvna zrnca senzibilizirana hipertenzijom nazivaju se eritrocitni dijagnostici. Za pripremu eritrocitnog dijagnostikuma najčešće se koriste ovčji eritrociti koji imaju visoku adsorbirajuću aktivnost.

Aplikacija. RNGA se koristi za dijagnostiku infektivnih bolesti, određivanje gonadotropnog hormona u urinu pri utvrđivanju trudnoće, za identifikaciju preosjetljivosti na lijekove, hormone iu nekim drugim slučajevima.

U serološkim studijama koristi se direktna reakcija inhibicije hemaglutinacije, kada se virus izoliran od pacijenta neutralizira specifičnim imunološkim serumom, a zatim kombinira s crvenim krvnim stanicama. Odsustvo hemaglutinacije ukazuje na konzistenciju virusa i korišćenog imunološkog seruma.

Reakcija indirektne hemaglutinacije (pasivna hemaglutinacija) se uočava u slučajevima kada se crvenim krvnim stanicama koje su prethodno tretirane (senzibilizirane) raznim antigenima doda imunološki serum ili serum pacijenta koji sadrži odgovarajuća antitijela. Dolazi do specifičnog lijepljenja crvenih krvnih zrnaca, do njihove pasivne hemaglutinacije.

Reakcija indirektne ili pasivne hemaglutinacije superiorna je po osjetljivosti i specifičnosti u odnosu na druge serološke metode, a koristi se u dijagnostici infekcija uzrokovanih bakterijama, rikecijama i protozoama.

Metoda za izvođenje reakcije indirektne hemaglutinacije sastoji se od nekoliko faza.

· Najprije se crvena krvna zrnca ispiru izotoničnom otopinom natrijum hlorida, zatim se, ako je potrebno (kada se koriste proteinski antigeni), tretiraju rastvorom tanina 1:20.000 i senzibiliziraju rastvorljivim antigenima.

· Nakon ispiranja puferovanim izotoničnim rastvorom natrijum hlorida, antigen eritrocita je spreman za upotrebu.

· Test serumi se razblažuju izotoničnom otopinom natrijum hlorida u epruvetama ili specijalnim plastičnim pločama sa jažicama, a zatim se svakom razblaženju seruma dodaje eritrocitni dijagnostikum.

· Rezultati reakcije indirektne hemaglutinacije uzimaju se u obzir prirodom sedimenta crvenih krvnih zrnaca formiranih na dnu epruvete.

· Rezultat reakcije u kojoj crvena krvna zrnca ravnomjerno pokrivaju cijelo dno epruvete smatra se pozitivnim. U negativnoj reakciji, crvena krvna zrnca u obliku malog diska ili "dugma" nalaze se u središtu dna epruvete.

· Nakon 2 sata inkubacije na 37 °C, rezultati se uzimaju u obzir, procjenjujući izgled sedimenta crvenih krvnih zrnaca (bez mućkanja): kod negativne reakcije pojavljuje se sediment u obliku kompaktnog diska ili prstena na dno bunara; uz pozitivnu reakciju, pojavljuje se karakterističan čipkasti sediment crvenih krvnih zrnaca, tanak film s neravnim rubovima

Reakcija koaglutinacije.

Ova reakcija se zasniva na jedinstvenom svojstvu Staphylococcus aureus, koji sadrži protein A u svom ćelijskom zidu, da se veže za Fc fragmente IgG i IgM.

U tom slučaju, aktivni centri antitijela ostaju slobodni i mogu stupiti u interakciju sa specifičnim determinantama antigena. Kap 2% suspenzije stafilokoka, senzibilizirane odgovarajućim antitijelima, nanosi se na stakalce i dodaje se kap suspenzije bakterije koja se proučava. Ako se antigen poklapa sa antitijelima, jasna aglutinacija stafilokoka napunjenih antitijelima se javlja unutar 30-60 s.

Zahtjevi za imunološki serum koji se koristi za senzibilizaciju stafilokoknih stanica i provođenje procesa senzibilizacije. Da bi se dobio koaglutinirajući reagens, suspenziju stafilokoka treba tretirati imunim serumom protiv željenog antigena. Serum se mora uzeti od životinje čiji IgG ima afinitet za protein A. Najveći afinitet za njega imaju imunoglobulini ljudi, svinja, pasa i zamoraca, najmanji - magarac i zec, a IgG ovce, konji, pacovi i miševi vrlo slabo reaguju na njega.

Pored stroge specifičnosti za željeni antigen, serum koji se koristi u RCOA ne bi trebao sadržavati antitijela na stafilokok kako bi se izbjegla aglutinacija stafilokoknog reagensa zbog specifičnog djelovanja antigena i antitijela, koja treba isključiti u IgG - proteinu Sistem. Kontrola se vrši miješanjem jedne kapi seruma i 10% suspenzije stafilokoknog reagensa na čaši. Ako se nakon 3...5 minuta ne formiraju ljuspice aglutinata, tada se serum smatra pogodnim za reakciju.

Ako dostupni uzorci seruma na ovaj antigen aglutiniraju stafilokok, tada se mogu adsorbirati suspenzijom stafilokoknih stanica koje nemaju protein A (na primjer, Wood-46 sojevi). Na taj način se uklanjaju antitijela koja reaguju sa stafilokokom zbog Fab fragmenata.

Dakle, serum koji se koristi za pripremu koaglutinirajućeg reagensa mora ispunjavati sljedeće zahtjeve:

dobijeno od životinje koja proizvodi IgG ima afinitet za protein A;
mora imati specifičnost za željeni antigen;
ne sadrže antistafilokokna antitela.

· Priprema dijagnostikuma. Pripremljeni 10% stafilokokni reagens se kombinuje sa jednakom zapreminom imunog seruma u prethodno određenom optimalnom radnom razblaženju. Smjesa se mućka 60 minuta na 40...42 °C u shutgel aparatu pri 90 vibracija u minuti. Zatim, nakon 15 minuta, dva puta se isperu sa PBS-om, resuspenduju do 2% suspenzije i konzerviraju sa natrijum mertiolatom (1:10,000).

Lekcija 14

Tema: Indirektne serološke reakcije. Indirektne reakcije hemaglutinacije (IRHA), fiksacija komplementa (IFR).

Antitela

Antitijela su proteinski molekuli sposobni da se specifično vežu za antigene. Antitijela pripadaju gama globulinima. Drugi naziv za antitijela su imunoglobulini. Kod sisara postoji 5 klasa imunoglobulina, koji se razlikuju po svojoj strukturi i nekim svojstvima: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.

Struktura imunoglobulina. IgG ima najtipičniju strukturu. Molekul se sastoji od 4 proteinska lanca: dva laka (L) i dva teška (H), koji su povezani disulfidnim vezama. Područje antitijela koje se vezuje za antigen naziva se aktivno mjesto antitijela. Postoje 2 aktivna centra u IgG molekulu. Formira ga N-terminalni regioni teških i lakih lanaca. Područje teških lanaca smješteno u blizini disulfidnih veza naziva se zglobno područje. Uz pomoć enzima papaina, IgG molekul iznad zglobnog regiona se deli na 3 fragmenta: 2 od njih sadrže laki lanac i deo teškog lanca (Fab fragmenti); a treći fragment se sastoji samo od dijela teških lanaca (Fc fragment). Zahvaljujući pokretnoj šarki, Fab fragmenti mogu promijeniti svoju relativnu poziciju u prostoru.

Aminokiselinske sekvence lakih i teških lanaca podijeljene su na konstantne i varijabilne regije. Varijabilni regioni se nalaze na N-krajevima lakih i teških lanaca (VL i VH). Konstantne regije se nalaze na C-terminima lanaca (CL i CH). U lakim i teškim lancima, aminokiselinske sekvence formiraju nekoliko globularnih struktura koje se nazivaju domeni.

Aktivni centar antitijela formiraju varijabilni domeni lakih i teških lanaca i predstavlja šupljinu ( paratop), koji ima određenu konfiguraciju i distribuciju električnih naboja na svojoj površini. Veličina, oblik i raspodjela naboja aktivnog mjesta određuju njegovu specifičnost, odnosno sposobnost vezivanja za specifičnu antigensku determinantu ( epitop), koji imaju komplementarnu strukturu.

Antigene determinante su područja koja strše na površini molekula antigena. Stoga se interakcija epitop-paratop odvija po principu “ključ-zaključavanje”.

Snagu veze između aktivnog centra antitijela i antigenske determinante karakterizira koncept afiniteta. Afinitet je mjera afiniteta aktivnog mjesta i antigenske determinante.

IgG klase imunoglobulina čine 75% ukupne količine serumskih imunoglobulina. Važno svojstvo IgG je njegova sposobnost da prođe kroz placentu. Dakle, majčina antitijela ulaze u tijelo djeteta i štite ga u prvim mjesecima života od infekcije (prirodni pasivni imunitet).

Oko 10% ukupnog skupa imunoglobulina pripada klasi IgM. Molekul IgM je pentamer, odnosno sastoji se od 5 identičnih molekula, po strukturi sličnih IgG molekulu, i ima 10 aktivnih centara. Podjedinice su međusobno povezane disulfidnim vezama. IgM molekul ima dodatni J lanac koji povezuje podjedinice. IgM antitela ne prolaze placentnu barijeru.

Antitijela IgA klase čine 15-20% ukupnog sadržaja imunoglobulina. IgA molekul se sastoji od 2 laka i 2 teška lanca i ima 2 aktivna centra. U krvnom serumu IgA je prisutan u monomernom obliku, dok je u sekretima sluzokože IgA predstavljen u obliku dimera i naziva se sekretornim ili sIgA, i ima 4 aktivna centra. C-termini teških lanaca u sIgA molekulu povezani su jedan s drugim J-lancem i proteinskim molekulom koji se naziva sekretorna komponenta. Sekretorna komponenta štiti sIgA od razgradnje proteolitičkim enzimima, koji se u velikim količinama nalaze u sekretima sluzokože. Glavna funkcija sIgA je zaštita sluznice od infekcije. IgA ne prodire kroz placentnu barijeru. Visoke koncentracije sIgA nalaze se u majčinom mlijeku, posebno u prvim danima laktacije. Oni štite gastrointestinalni trakt novorođenčeta od infekcije.

IgD se uglavnom nalazi na membrani B limfocita. Imaju strukturu sličnu IgG, 2 aktivna centra. Biološka uloga nije u potpunosti poznata.

IgE - koncentracija ove klase imunoglobulina u krvnom serumu je izuzetno niska. IgE molekuli su uglavnom fiksirani na površini mastocita i bazofila. IgE je po strukturi sličan IgG i ima 2 aktivna centra. Pretpostavlja se da je IgE bitan u razvoju anthelmintičkog imuniteta. IgE igra važnu ulogu u patogenezi nekih alergijskih bolesti (bronhijalna astma, peludna groznica) i anafilaktičkog šoka.

Indirektna reakcija hemaglutinacije

U indirektnim serološkim reakcijama kompleks antigena s antitijelima nije vidljiv golim okom. U takvim slučajevima antigeni se adsorbuju na većim česticama nosača (eritrociti, čestice lateksa), čime se dobija antigeni eritrocitni dijagnostikum. Naknadna aglutinacija takvih čestica sa specifičnim antitijelima omogućava da se aglutinat (precipitat) vidi golim okom. Reakcija indirektne (pasivne) hemaglutinacije (IRHA) otkriva antitijela u krvnom serumu pomoću antigenskog eritrocitnog dijagnostikuma, koji je eritrociti na kojima su adsorbirani antigeni.

Crvena krvna zrnca s adsorbiranim antigenima stupaju u interakciju s odgovarajućim antitijelima u krvnom serumu, što uzrokuje da se crvena krvna zrnca zalijepe zajedno i ispadnu na dno epruvete ili ćelije u obliku zupčastog sedimenta. U negativnoj reakciji crvena krvna zrnca se talože u obliku dugmeta.

RNGA se stavlja u plastične tablete ili u epruvete sa razblaženjima krvnog seruma u koje se dodaje eritrocitni dijagnostikum.

Ponekad se koristi dijagnostikum eritrocita antitijela - crvenih krvnih zrnaca na kojima se adsorbiraju antitijela. Ova reakcija se naziva RONGA - reverzna reakcija indirektne hemaglutinacije.

RNGA komponente:

Krvni serum pacijenta (razrijeđen 1:25);

Erythrocyte diagnosticum (eritrociti napunjeni antigenom patogena koji se proučava);

Rastvor za pranje.

Inscenirao RNGA. Dvije kapi otopine fosfatnog pufera dodaju se u sedam jažica ploče za imunološke studije. U prvu jažicu se dodaju dvije kapi pacijentovog krvnog seruma, nakon čega se 2 kapi prenose iz prve u drugu jažicu, iz druge u treću itd. Iz šeste jažice se uklone 2 kapi. Dodajte 2 kapi dijagnostikuma eritrocita u svih sedam jažica (6 eksperimentalnih i 1 kontrolna). Nakon svake operacije potrebno je isprati pipetu u otopini za pranje. Ploče se ostavljaju na sobnoj temperaturi 45 minuta, nakon čega se bilježe rezultati.

Reakcija fiksacije komplementa

Reakcija fiksacije komplementa je da kada se antigen spoji sa antitijelom, formira se imuni kompleks za koji je komplement vezan preko Fc fragmenta antitijela. Ako se kompleks antigen-antitijelo ne formira, komplement ostaje slobodan. Slobodni komplement se detektuje dodavanjem hemolitičkog sistema koji se sastoji od crvenih krvnih zrnaca ovaca i antitela protiv njih. Pozitivna reakcija je odsustvo hemolize kao rezultat vezivanja komplementa za kompleks antigen + antitijelo. Negativna reakcija je prisustvo hemolize kao rezultat vezivanja komplementa za kompleks eritrocit + anti-eritrocitno antitijelo.

RSK komponente:

Zdrav krvni serum;

Krvni serum pacijenta (razrijeđen 1:5);

Antigenska komponenta reakcije je inaktivirani patogen;

Komplement u razblaženju koje odgovara radnoj dozi. Komplement se dobija iz krvnog seruma zamoraca. Titar komplementa je njegova minimalna doza, koja u prisustvu hemolitičkog seruma izaziva potpunu hemolizu crvenih krvnih zrnaca. Radna doza komplementa koji se koristi u proizvodnji RSC je 30% veća od njegovog titra;

Hemolitički sistem je suspenzija eritrocita ovaca tretiranih zečjim antitelima na eritrocite ovaca.

Rastvor za pranje.

Inscenirao RSK. RSC se stavlja u dvije epruvete - eksperimentalnu i kontrolnu. U epruvetu se doda 0,5 ml krvnog seruma pacijenta, u kontrolnu epruvetu 0,5 ml krvnog seruma zdravog davaoca, u obe epruvete po 0,5 ml lizata patogena, kao i po 0,5 ml dopuna. Nakon svake operacije potrebno je isprati pipetu u otopini za pranje. Epruvete se stavljaju u termostat na 37°C na 30 minuta. Nakon inkubacije, u obje epruvete se dodaje po 1,0 ml hemolitičkog sistema. Epruvete se protresu i stave u termostat na 37°C na 30 minuta. Ako je reakcija pozitivna, dolazi do odlaganja hemolize u epruveti (bezbojna tečnost i sediment crvenih krvnih zrnaca), au kontrolnoj epruveti dolazi do hemolize crvenih krvnih zrnaca.

Literatura za pripremu za lekciju:

1. Borisov mikrobiologija, virologija, imunologija. M., 2002.

2. Medicinska mikrobiologija, virologija i imunologija. Ed. . M., 2004.

3. Pozdeev mikrobiologija. M., GEOTAR-MEDIA, 2005.

Zasniva se na činjenici da crvena krvna zrnca, na kojima se prethodno adsorbiraju antigeni, stiču sposobnost aglutinacije u prisustvu homolognih seruma (antitijela).

U ovom slučaju crvena krvna zrnca djeluju kao nosioci specifičnih determinanti, čija aglutinacija nastaje kao rezultat reakcije antigen + antitijelo.

Crvena krvna zrnca za čiju su površinu antigeni čvrsto vezani nazivaju se eritrocitni antigen diagnosticum, ili eritrociti senzibilizirani antigenom.

Druga vrsta RNGA - antitijela se adsorbiraju na površini eritrocita i njihova naknadna aglutinacija se događa u prisustvu homolognog antigena. U ovom slučaju, takvi eritrociti se nazivaju dijagnostikom eritrocitnih antitijela, ili eritrociti senzibilizirani antitijelima.

Na osnovu ova dva temeljna metodološka pristupa razvijene su i korištene mnoge modifikacije RNGA. Stoga se male standardne čestice lateksa koriste kao nosači. U ovom slučaju, reakcija se naziva reakcija lateks aglutinacije (RLA) ili se koristi Staphylococcus aureus - reakcija koaglutinacije itd. Obično se dijagnostika eritrocita priprema u poduzećima biološke industrije, a glavno iskustvo RNGA provodi se u dijagnostičkim laboratorijama.

Priprema dijagnostikuma eritrocita uključuje sljedeće korake:

fiksacija crvenih krvnih zrnaca s formaldehidom ili glutarnim ili akrilnim aldehidima. Ovako tretirana crvena krvna zrnca se čuvaju dugo vremena. Češće se u tu svrhu koriste eritrociti ovaca, ljudi, pilića itd.;
tretman fiksiranih eritrocita otopinom tanina. Kao rezultat, crvena krvna zrnca stječu sposobnost da nepovratno adsorbiraju proteine (viruse i antitijela) na svojoj površini;
senzibilizacija taniziranih eritrocita virusima ili antitijelima.

Treba napomenuti da su metode za pripremu dijagnostike eritrocita za virusne infekcije različite.

Procedura za izvođenje RNGA za otkrivanje i određivanje titra antitijela je sljedeća:

jednake doze eritrocita senzibiliziranih antigenom dodaju se uzastopnim 2-strukim razrjeđenjima seruma;
smjesa se ostavi 2-3 sata na sobnoj temperaturi ili 16-18 sati na 4 °C;
uzeti u obzir rezultate. Ako serum sadrži antitijela na virus kojim su crvena krvna zrnca senzibilizirana, uočava se hemaglutinacija, koja se procjenjuje u križanjima.

Smatra se da je titar antitijela u serumu najveće razrjeđenje seruma koje još uvijek osigurava hemaglutinaciju pomoću najmanje dva ukrštanja.

RNGA je praćen svim relevantnim kontrolama. Obično se reakcija izvodi mikrometodom.

RNGA vam omogućava da riješite sljedeće dijagnostičke probleme:

detektovati antitijela i odrediti njihov titar u krvnom serumu pomoću poznatog dijagnostikuma antigena eritrocita;
otkriti i identificirati nepoznati virus korištenjem poznate dijagnostike eritrocitnih antitijela.

Prednosti RNGA: visoka osjetljivost, jednostavnost tehnike postavljanja i brzina odgovora. Međutim, važno je napomenuti da se javljaju velike poteškoće u pripremi stabilne dijagnostike eritrocita (velika ovisnost o čistoći korištenih komponenti, potreba za odabirom načina fiksacije, tanizacije i senzibilizacije eritrocita za svaku vrstu virusa).

Stranica pruža referentne informacije samo u informativne svrhe. Dijagnoza i liječenje bolesti moraju se provoditi pod nadzorom specijaliste. Svi lijekovi imaju kontraindikacije. Konsultacija sa specijalistom je obavezna!

Serološki analiza krvi je metoda za laboratorijsko testiranje određenih antigena ili antitijela ( specifičnih proteina) u krvnom serumu pacijenta, na osnovu imunoloških odgovora tijela. Ova metoda se koristi kada dijagnostika zarazne bolesti radi otkrivanja prisutnosti antitijela u krvi pacijenta na određenu vrstu virusa ili bakterija, kao i određivanje krvne grupe.

Materijal koji se proučava

Prije svega, za serološke analize koristi se biološki materijal sakupljen od pacijenta:

krvni serum
pljuvačke
fekalne materije

U nekim slučajevima se ispituje materijal izolovan od određenih objekata okoline:

Metoda analize ili uzorkovanja krvi

Ova analiza ne zahtijeva posebnu pripremu pacijenta. Uzimanje krvi se vrši u jutarnjim satima na prazan želudac i obavlja se u salama za tretmane zdravstvenih ustanova, prema opšteprihvaćenim hematološkim metodama. Za serološko ispitivanje krv se uzima pomoću dvije metode: venska krv se uzima iz pacijentove ulnarne vene, a kapilarna krv iz prstenjaka. Krv se stavlja u sterilne zatvorene epruvete.

Karakteristike transporta krvi i skladištenja seruma

Odmah nakon uzimanja krvi se transportuje u poseban laboratorij, gde se istog dana priprema serum. Sirutka se može čuvati ne više od 4-6 dana u frižideru na temperaturi od 2-4 stepena. Ako je potrebno duže skladištenje, surutka se zamrzava. Kako bi se izbjeglo ugrožavanje kvalitete sirutke, dopušteno je jednom zamrznuti i, shodno tome, odmrznuti. Tokom dugotrajnog skladištenja, antitijela gube svojstva i postaju djelomično neaktivna; imunoglobulini ove klase su najosjetljiviji na smrzavanje M. Nakon odmrzavanja seruma, potrebno ga je dobro promiješati do glatke smjese, što pomaže u obnavljanju koncentracije antitijela sadržanih u ovom serumu.

Za šta se koriste serološki testovi?

Serološke laboratorijske dijagnostičke metode koriste se za identifikaciju bolesti kao npr ehinokokoza, trihineloza, toksokaroza, opistorhijaza, cisticerkoza, toksoplazmoza, amebijaza, giardijaza, kako bi se utvrdila efikasnost tijeka liječenja i, konačno, otkrila recidivirajuća bolest nakon što se pacijent potpuno oporavi.

Osnovne metode serološke dijagnostike

Reakcija imunofluorescencije (RIF)

Ova reakcija je indirektna verzija serološkog testa, odnosno provodi se u dvije faze. U prvoj fazi, potrebno antitijelo se identifikuje u cirkulirajućem kompleksu antigen-antitijelo pomoću antiglobulina, koji je po strukturi sličan proteinima imunološkog seruma. Identifikacija željenog antitela je moguća i proučavanjem unapred pripremljenog antigenskog preparata pod fluorescentnim mikroskopom, bez upotrebe antiglobulina.

Reakcija imunofluorescencije je vrlo radno intenzivan proces koji od specijaliste zahtijeva puno vremena i odgovornosti. Reakcija počinje pripremom rastvora, zatim se titriraju serumi i njihovi kontrolni uzorci ( proces koji vam omogućava da odredite sadržaj određene tvari postupnim miješanjem ispitne otopine s kontroliranom količinom reagensa). Prethodno pripremljena razblaženja i njihovi kontrolni uzorci pažljivo se nanose na staklena stakalca sa antigenom. Zatim se preparati inkubiraju, nakon čega slijedi pranje i sušenje na zraku. Na stakalce sa antigenom nanosi se tanak sloj antiseruma, nakon čega se vrši sekundarna inkubacija preparata i ponavlja čitav prethodni lanac delovanja, koji se završava sušenjem preparata. Kao rezultat, preparat na predmetnom predmetu se tretira glicerolom i ispituje pod fluorescentnim mikroskopom.

Rezultati reakcije se ocjenjuju na skali od četiri tačke, koju karakterizira intenzitet površinskog žuto-zelenog sjaja antigenskih stanica:
+ veoma slab sjaj ćelije, primetan samo na njenoj periferiji
++ slab sjaj periferije ćelije, ali sa jasno uočljivom zelenom nijansom
+++/++++ jarko zeleni sjaj periferije ćelije
Reakcionim titrom se smatra razrjeđenje seruma u kojem najmanje 50% antigenskih stanica pokazuje jasan površinski sjaj, odnosno rezultat reakcije +++ ili ++++ . Vrijednost raspona reakcije je od 1/80 do 1/100.

Intenzitet reakcije zavisi od broja precipitiranih crvenih krvnih zrnaca na dnu formiranih rupa:
– negativna reakcija, koju karakterizira taloženje crvenih krvnih zrnaca na dno jažica u obliku malog prstena s glatkim rubovima ili "dugme"
+ niskog intenziteta, ova reakcija se odlikuje malim pojedinačnim naslagama na dnu rupe. Neaglutinirana crvena krvna zrnca formiraju “mali prsten” u centru bunara
++ srednjeg intenziteta, karakteriše ga formiranje na dnu rupe "širokog gustog prstena" neaglutiniranih eritrocita
+++ intenzivna reakcija, aglutinirani eritrociti formiraju takozvane "kišobrane", u čijem su središtu jasno vidljivi prstenovi formirani od staloženih neaglutiniranih eritrocita
++++ oštro intenzivna reakcija u kojoj se sva crvena krvna zrnca aglutiniraju i, formirajući "kišobrane", oblažu dno jažica.
Titar ove reakcije smatra se posljednjim razrjeđenjem seruma pri kojem se najmanje otkriva očigledna aglutinacija eritrocita. +++ , odnosno sa intenzivnom ili oštro intenzivnom reakcijom.

Pouzdanost i kvaliteta seroloških dijagnostičkih metoda ovise o organizaciji interne i eksterne laboratorijske kontrole, koja se sastoji od nekoliko nezavisnih procedura osmišljenih za procjenu kvalitete rezultata analize.