mga reaksyon sa pag-ulan. Agglutination reaction, precipitation reaction Immunoelectron microscopy

mga reaksyon ng immunodiagnostic. Mga reaksyon at reaksyon ng antigen-antibody na may mga sangkap na may label. Gamitin para sa pagkilala ng mga microorganism at pagsusuri ng mga nakakahawang sakit.

Ginagamit ang mga immune reaction sa diagnostic at immunological na pag-aaral sa mga pasyente at malusog na tao. Para sa layuning ito, mag-apply mga pamamaraan ng serological (mula sa lat. suwero - suwero at mga logo - doktrina), ibig sabihin, mga pamamaraan para sa pag-aaral ng mga antibodies at antigen gamit ang mga reaksiyong antigen-antibody na tinutukoy sa serum ng dugo at iba pang mga likido, pati na rin sa mga tisyu ng katawan.

Ang pagtuklas ng mga antibodies laban sa mga antigen ng pathogen sa serum ng dugo ng pasyente ay ginagawang posible upang masuri ang sakit. Ginagamit din ang mga serological na pag-aaral upang makilala ang mga microbial antigens, iba't ibang biologically active substance, mga grupo ng dugo, tissue at tumor antigens, immune complex, cell receptor, atbp.

Kapag ang isang mikrobyo ay nahiwalay sa isang pasyente, ang pathogen ay nakikilala sa pamamagitan ng pag-aaral ng mga antigenic na katangian nito gamit ang immune diagnostic sera, ibig sabihin, blood sera ng mga hyperimmunized na hayop na naglalaman ng mga partikular na antibodies. Ito ang tinatawag na serological identification mga mikroorganismo.

Sa microbiology at immunology, ang agglutination, precipitation, neutralization reactions, reactions involving complement, gamit ang may label na antibodies at antigens (radioimmunological, enzyme immunoassay, immunofluorescence method) ay malawakang ginagamit. Ang mga nakalistang reaksyon ay naiiba sa nakarehistrong epekto at pamamaraan ng pagtatakda, gayunpaman, lahat ng mga ito ay basic. van sa reaksyon ng pakikipag-ugnayan ng isang antigen sa isang antibody at ginagamit upang makita ang parehong mga antibodies at antigens. Ang mga reaksyon ng kaligtasan sa sakit ay nailalarawan sa pamamagitan ng mataas na sensitivity at pagtitiyak.

Ang mga prinsipyo at pamamaraan ng mga pangunahing immunodiagnostic na reaksyon ay ibinibigay sa ibaba. Detalye ng pamamaraan ang mga setting ng reaksyon ay ibinigay sa. praktikal na mga patnubay para sa immunodiagnostics.

Reaksyon ng aglutinasyon - RA(mula sa lat. aggluti- bansa- bonding) - isang simpleng reaksyon kung saan ang mga antibodies ay nagbubuklod sa mga corpuscular antigens (bacteria, erythrocytes o iba pang mga cell, hindi matutunaw na mga particle na may mga antigen na adsorbed sa kanila, pati na rin ang mga macromolecular aggregates). Ito ay nangyayari sa pagkakaroon ng mga electrolyte, halimbawa, kapag ang isotonic sodium chloride solution ay idinagdag.

Mag-apply iba't ibang mga pagpipilian mga reaksyon ng agglutination: pinalawak, tinatayang, hindi direkta, atbp. Ang reaksyon ng aglutinasyon ay ipinakita sa pamamagitan ng pagbuo ng mga natuklap o sediment

Ginagamit ang RA para sa:

pagpapasiya ng mga antibodies sa serum ng dugo ng mga pasyente, halimbawa, na may brucellosis (mga reaksyon ng Wright, Heddelson), typhoid fever at paratyphoid (Vidal reaction) at iba pang mga nakakahawang sakit;

pagpapasiya ng pathogen na nakahiwalay sa pasyente;

pagpapasiya ng mga pangkat ng dugo gamit ang monoclonal antibodies laban sa erythrocyte allogenes.

Upang matukoy ang mga antibodies ng pasyente ilagaypinahabang reaksyon ng agglutination: idagdag sa mga dilution ng serum ng dugo ng pasyente diagnosticum(suspensyon ng mga napatay na mikrobyo) at pagkatapos ng ilang oras ng pagpapapisa ng itlog sa 37 ° C, ang pinakamataas na serum dilution (serum titer) ay nabanggit, kung saan naganap ang agglutination, ibig sabihin, nabuo ang isang precipitate.

Ang kalikasan at rate ng agglutination ay depende sa uri ng antigen at antibodies. Ang isang halimbawa ay ang pakikipag-ugnayan ng diagnosticums (O- at R-antigens) na may mga tiyak na antibodies. Agglutination reaksyon sa O-diagnosticum(bacteria na pinatay ng init, pinapanatili ang isang thermostable O antigen) ay nangyayari sa anyo ng fine-grained agglutination. Ang agglutination reaction na may H-diagnosticum (bacteria na pinatay ng formalin, pinapanatili ang heat-labile flagellar H-antigen) ay magaspang na butil at nagpapatuloy nang mas mabilis.

Kung kinakailangan upang matukoy ang pathogen na nakahiwalay sa pasyente, ilagay orienting agglutination reaksyon, gamit ang diagnostic antibodies (agglutinating serum), i.e., ang serotyping ng pathogen ay isinasagawa. Tinatayang reaksyon isinasagawa sa isang glass slide. Sa isang patak ng diagnostic agglutinating serum sa isang pagbabanto ng 1:10 o 1:20 magdagdag ng isang purong kultura ng pathogen na nakahiwalay sa pasyente. Ang isang kontrol ay inilalagay sa malapit: sa halip na serum, isang patak ng sodium chloride solution ang inilapat. Kapag lumilitaw ang isang flocculent sediment sa isang drop na may serum at microbes, inilalagay nila malawak na reaksyon ng agglutination sa mga test tube na may pagtaas ng mga dilution ng agglutinating serum, kung saan idinagdag ang 2-3 patak ng suspensyon ng pathogen. Ang aglutination ay isinasaalang-alang ng dami ng sediment at ang antas ng paglilinaw ng likido. Ang reaksyon ay itinuturing na positibo kung ang agglutination ay nabanggit sa isang pagbabanto na malapit sa titer ng diagnostic serum. Kasabay nito, ang mga kontrol ay isinasaalang-alang: ang serum na diluted na may isotonic sodium chloride solution ay dapat na transparent, ang isang suspensyon ng microbes sa parehong solusyon ay dapat na pantay na maputik, nang walang sediment.

Ang iba't ibang kaugnay na bakterya ay maaaring pagsama-samahin ng parehong diagnostic agglutinating serum, na nagpapahirap sa kanilang pagkakakilanlan. Samakatuwid, magsaya adsorbed agglutinating sera, mula sa kung saan ang mga cross-reactive antibodies ay tinanggal sa pamamagitan ng adsorption ng kanilang mga nauugnay na bakterya. Sa gayong sera, nananatili ang mga antibodies na partikular lamang sa bacterium na ito. Ang paghahanda ng monoreceptor diagnostic agglutinating sera sa ganitong paraan ay iminungkahi ni A. Castellani (1902).

Ang reaksyon ng hindi direktang (passive) hemagglutination (RNHA, RPHA) ay batay sa paggamit ng mga erythrocytes na may mga antigen o antibodies na na-adsorbed sa ibabaw, ang pakikipag-ugnayan nito sa mga kaukulang antibodies o antigens ng serum ng dugo ng bola ay nagiging sanhi ng pagdikit ng mga erythrocyte at mahulog sa ilalim ng ang test tube o cell sa ang anyo ng isang scalloped sediment (Larawan 13.2). Sa backlash erythrocytes tumira sa anyo ng isang "button". Karaniwan, ang mga antibodies ay nakikita sa RNHA gamit ang isang antigenic erythrocyte diagnosticum, na mga erythrocytes na may adsorbed. sa mga antigens nila. Minsan gumagamit kami ng antibody erythrocyte diagnostics, kung saan na-adsorb ang mga antibodies. Halimbawa, ang botulinum toxin ay maaaring matukoy sa pamamagitan ng pagdaragdag ng erythrocyte antibody botulinum diagnosticum dito (ang reaksyong ito ay tinatawag na baligtarin ang hindi direktang reaksyon ng hemagglutination- RONGA). Ginagamit ang RNHA upang masuri ang mga nakakahawang sakit, matukoy ang gonadotropic hormone sa ihi kapag ang pagbubuntis ay itinatag, upang matukoy hypersensitivity sa mga gamot, hormones at sa ilang iba pang mga kaso.

Reaksyon ng coagglutination . Ang mga cell ng pathogen ay tinutukoy gamit ang staphylococci, pre-treated na may immune diagnostic serum. Protein na naglalaman ng staphylococci PERO, pagkakaroon ng isang affinity para sa Fc -fragment ng mga immunoglobulin, hindi partikular na nag-adsorb ng mga antimicrobial antibodies, na pagkatapos ay nakikipag-ugnayan sa mga aktibong sentro na may kaukulang microbes na nakahiwalay sa mga pasyente. Bilang resulta ng coagglutination, ang mga natuklap ay nabuo, na binubuo ng staphylococci, diagnostic serum antibodies at ang mikrobyo na tinutukoy.

Hemagglutination inhibition reaction (RTGA) ay batay sa blockade, pagsugpo sa mga antigen ng mga virus sa pamamagitan ng mga antibodies ng immune serum, bilang isang resulta kung saan ang mga virus ay nawawalan ng kakayahang pagsama-samahin ang mga pulang selula ng dugo (Larawan 13.3). Ginagamit ang RTHA upang masuri ang maraming mga sakit na viral, ang mga sanhi ng ahente nito (influenza, tigdas, rubella, tick-borne encephalitis, atbp.) ay maaaring pagsama-samahin ang mga erythrocytes ng iba't ibang hayop.

Agglutination reaksyon para sa pagtukoy ng mga pangkat ng dugo ginamit upang maitatag ang sistema ng ABO (tingnan ang seksyon 10.1.4.1) gamit ang agglutination ng mga erythrocytes na may mga antibodies ng immune serum laban sa mga antigen ng mga pangkat ng dugo A (II), B (III). Ang mga kontrol ay: antibody-free serum, i.e. serum AB (GU) mga pangkat ng dugo; antigens na nakapaloob sa mga erythrocytes ng mga pangkat A (II), B (III). Ang negatibong kontrol ay walang mga antigen, ibig sabihin, ang pangkat 0 (I) erythrocytes ay ginagamit.

AT agglutination reaksyon upang matukoy ang Rh factor(tingnan ang seksyon 10.1.4.1) gumamit ng anti-Rh sera (hindi bababa sa dalawang magkaibang serye). Sa pagkakaroon ng Rh antigen sa lamad ng pinag-aralan na mga erythrocytes, nangyayari ang agglutination ng mga selulang ito. Ang karaniwang Rh-positive at Rh-negative na erythrocytes ng lahat ng pangkat ng dugo ay nagsisilbing mga kontrol.

Agglutination reaksyon para sa pagpapasiya ng anti-Rhesus antibodies ( hindi direktang reaksyon Coombs)ginagamit sa mga pasyente na may intravascular hemolysis. Sa ilan sa mga pasyenteng ito, ang mga anti-Rhesus antibodies ay matatagpuan, na hindi kumpleto, monovalent. Partikular na nakikipag-ugnayan ang mga ito sa Rh-positive erythrocytes, ngunit hindi nagiging sanhi ng kanilang aglutinasyon. Ang pagkakaroon ng mga hindi kumpletong antibodies ay tinutukoy sa hindi direktang reaksyon ng Coombs. Upang gawin ito, ang antiglobulin serum (antibodies laban sa mga immunoglobulin ng tao) ay idinagdag sa sistema ng mga anti-Rh antibodies + Rh-positive erythrocytes, na nagiging sanhi ng agglutination ng mga erythrocytes (Fig. 13.4). Gamit ang reaksyon ng Coombs, ang mga pathological na kondisyon na nauugnay sa intravascular lysis ng mga erythrocytes ng immune na pinagmulan ay nasuri, halimbawa, hemolytic disease ng bagong panganak: ang mga erythrocytes ng isang Rh-positive na fetus ay pinagsama sa hindi kumpletong antibodies sa Rh factor na nagpapalipat-lipat sa dugo, na tumawid ang inunan mula sa isang Rh-negative na ina.

Mga reaksyon sa pag-ulan

reaksyon ng pag-ulan - RP (mula salat. praeci-pito- precipitate,) ay ang pagbuo at pag-ulan ng isang complex ng isang natutunaw na molekular antigen na may mga antibodies sa anyo ng labo, na tinatawag na namuo. Ito ay nabuo sa pamamagitan ng paghahalo ng mga antigen at antibodies sa katumbas na halaga; ang labis sa isa sa mga ito ay binabawasan ang antas ng pagbuo ng immune complex.

Ang mga reaksyon ng pag-ulan ay inilalagay sa mga test tube (reaksyon ng pag-ulan ng singsing), sa mga gel, nutrient media, atbp. Ang mga uri ng reaksyon ng pag-ulan sa isang semi-likidong gel ng agar o agarose ay malawakang ginagamit: double immunodiffusion ayon sa Ouchterlony. radial immunodiffusion, immunoelectrophoresis at iba pa.

Reaksyon ng pag-ulan ng singsing . Ang reaksyon ay isinasagawa sa makitid na precipitating tubes na may immune serum, kung saan ang isang natutunaw na antigen ay layered. Sa pinakamainam na ratio ng antigen at antibodies, isang opaque precipitate ring ang nabuo sa hangganan ng dalawang solusyon na ito (Larawan 13.5). Ang labis na antigen ay hindi nakakaapekto sa resulta ng reaksyon ng pag-ulan ng singsing dahil sa unti-unting pagsasabog ng mga reagents sa hangganan ng likido. Kung pinakuluan at sinala may tubig na katas mga organo o tisyu, kung gayon ang ganitong reaksyon ay tinatawag reaksyon ng thermoprecipitation-iii (reaksyon ng Ascoli, may anthrax /

Oukhteruni double immunodiffusion reaksyon . Upang i-set up ang reaksyon, ang natunaw na agar gel ay ibinuhos sa isang manipis na layer sa isang glass plate, at pagkatapos na tumigas, ang mga butas na 2-3 mm ang laki ay pinutol dito. Ang mga antigen at immune sera ay inilalagay nang hiwalay sa mga balon na ito, na nagkakalat sa isa't isa. Sa tagpuan sa mga katumbas na sukat, bumubuo sila ng isang namuo sa anyo ng isang puting banda. Sa mga multicomponent system, lumilitaw ang ilang linya ng precipitate sa pagitan ng mga balon na may iba't ibang antigen at serum antibodies; para sa magkatulad na antigens, ang mga namuo na linya ay nagsasama; para sa mga hindi magkapareho, sila ay bumalandra (Larawan 13.6).

Radial immunodiffusion reaksyon . Ang immune serum na may molten agar gel ay pantay na ibinubuhos sa baso. Pagkatapos ng solidification sa gel, ang mga balon ay ginawa kung saan inilalagay ang antigen sa iba't ibang mga dilution. Ang antigen, na nagkakalat sa gel, ay bumubuo ng mga ring precipitation zone sa paligid ng mga balon na may mga antibodies (Larawan 13.7). Ang diameter ng precipitation ring ay proporsyonal sa konsentrasyon ng antigen. Ang reaksyon ay ginagamit upang matukoy ang mga antas ng dugo ng mga immunoglobulin ng iba't ibang klase, mga bahagi ng sistema ng pandagdag, atbp.

Immunoelectrophoresis- isang kumbinasyon ng paraan ng electrophoresis at immunoprecipitation: isang halo ng mga antigens ay ipinakilala sa mga balon ng gel at pinaghiwalay sa gel gamit ang electrophoresis. Pagkatapos, kahanay sa mga electrophoresis zone, ang isang immune serum ay ipinakilala sa uka, ang mga antibodies na kung saan, nagkakalat sa gel, ay nabuo sa punto ng pagpupulong kasama ang antigen ng linya ng pag-ulan.

reaksyon ng flocculation(ayon kay Ramon) (mula sa lat. floccus- wool flakes) - ang hitsura ng opalescence o flocculent mass (immunoprecipitation) sa isang test tube sa panahon ng isang toxin-antitoxin o anatoxin-antitoxin reaction. Ito ay ginagamit upang matukoy ang aktibidad ng antitoxic serum o toxoid.

Immune electron microscopy- electron microscopy ng microbes, mas madalas na mga virus, ginagamot ng naaangkop na antibodies. Ang mga virus na ginagamot ng immune serum ay bumubuo ng mga immune aggregate (microprecipitates). Ang isang "corolla" ng mga antibodies ay nabuo sa paligid ng mga virion, contrasted sa phosphotungstic acid o iba pang electron-optically siksik na paghahanda.

Mga reaksyong may kasamang pandagdag

Mga reaksyong may kasamang pandagdagbatay sa activation ng complement ng isang antigen-antibody complex (complement fixation reaction, radial hemolysis, atbp.).

Makadagdag sa reaksyon ng pag-aayos (RSK) ay nakasalalay sa katotohanan na, kapag tumutugma sa bawat isa, ang mga antigen at antibodies ay bumubuo ng isang immune complex, kung saan, sa pamamagitan ng Fc -Ang fragment ng mga antibodies ay sumasali sa complement (C), ibig sabihin, ang complement binding ay nangyayari sa isang antigen-antibody complex. Kung ang antigen-antibody complex ay hindi nabuo, kung gayon ang pandagdag ay nananatiling libre (Larawan 13.8). Ang RSK ay isinasagawa sa dalawang yugto: 1st phase - pagpapapisa ng itlog ng isang halo na naglalaman ng tatlong bahagi ng antigen + antibody + complement; 2nd phase (indicator) - pagtuklas ng libreng pandagdag sa pinaghalong sa pamamagitan ng pagdaragdag dito ng isang hemolytic system na binubuo ng mga erythrocytes ng tupa at hemolytic serum na naglalaman ng mga antibodies sa kanila. Sa 1st phase ng reaksyon, sa panahon ng pagbuo ng antigen-antibody complex, ang complement binding ay nangyayari, at pagkatapos ay sa 2nd phase, ang hemolysis ng erythrocytes na sensitized ng antibodies ay hindi magaganap; positibo ang reaksyon. Kung ang antigen at antibody ay hindi tumutugma sa isa't isa (walang antigen o antibody sa sample ng pagsubok), ang pandagdag ay nananatiling libre at sa ika-2 yugto ay sasali sa erythrocyte-antierythrocyte antibody complex, na nagiging sanhi ng hemolysis; negatibo ang reaksyon.

Ginagamit ang RSK upang masuri ang maraming mga nakakahawang sakit, sa partikular na syphilis (reaksyon ng Wasserman).

Ang reaksyon ng radial hemolysis (RRH ) inilagay sa mga balon ng agar gel na naglalaman ng ram erythrocytes at pandagdag. Pagkatapos magdagdag ng hemolytic serum (antibodies laban sa ram erythrocytes) sa mga balon ng gel, isang hemolysis zone ang nabuo sa paligid nila (bilang resulta ng radial diffusion ng antibodies). Kaya, posible na matukoy ang aktibidad ng pandagdag at hemolytic serum, pati na rin ang mga antibodies sa serum ng dugo ng mga pasyente na may influenza, rubella, tick-borne encephalitis. Upang gawin ito, ang kaukulang mga antigen ng virus ay na-adsorbed sa mga erythrocytes, at ang serum ng dugo ng pasyente ay idinagdag sa mga balon ng gel na naglalaman ng mga erythrocytes na ito. Ang mga antiviral antibodies ay nakikipag-ugnayan sa mga viral antigen na na-adsorb sa mga erythrocytes pagkatapos

Ang mga pandagdag na bahagi ay nakakabit sa kumplikadong ito, na nagiging sanhi ng hemolysis.

Reaksyon ng immune adhesion (RIP ) ay batay sa pag-activate ng complement system ng corpuscular antigens (bacteria, virus) na ginagamot ng immune serum. Bilang resulta, nabuo ang isang activated third complement component (C3b), na nakakabit sa corpuscular antigen bilang bahagi ng immune complex. Sa mga erythrocytes, platelets, macrophage mayroong mga receptor para sa C3b, dahil sa kung saan, kapag ang mga cell na ito ay halo-halong may mga immune complex na may C3b, sila ay pinagsama at pinagsama.

Reaksyon ng neutralisasyon

Nagagawang i-neutralize ng immune serum antibodies ang nakakapinsalang epekto ng mga mikrobyo o ang kanilang mga lason sa mga sensitibong selula at tisyu, na nauugnay sa pagharang ng mga microbial antigen ng mga antibodies, ibig sabihin, ang kanilang neutralisasyon. Reaksyon ng neutralisasyon(RN) ay isinasagawa sa pamamagitan ng paglalagay ng isang antigen-antibody mixture sa mga hayop o sa mga sensitibong bagay na pansubok (cell culture, embryo). Sa kawalan ng nakakapinsalang epekto ng mga microorganism o kanilang mga antigens, mga lason sa mga hayop at mga bagay sa pagsubok, nagsasalita sila ng neutralizing effect ng immune serum at, samakatuwid, ang pagtitiyak ng pakikipag-ugnayan ng antigen-antibody complex (Fig. 13.9).

Reaksyon ng immunofluorescence - RIF (paraan ng Koons)

Mayroong tatlong pangunahing uri ng pamamaraan: direkta, hindi direkta (Larawan 13.10), na may pandagdag. Ang reaksyon ng Koons ay isang mabilis na paraan ng diagnostic para sa pag-detect ng mga microbial antigens o pag-detect ng mga antibodies.

Direktang paraan ng RIF ay batay sa katotohanan na ang mga tissue antigens o microbes na ginagamot sa immune sera na may mga antibodies na may label na fluorochromes ay maaaring kumikinang sa UV rays ng isang fluorescent microscope.

Ang mga bakterya sa isang smear, na ginagamot ng tulad ng isang luminescent serum, ay kumikinang sa paligid ng cell sa anyo ng isang berdeng hangganan.

Hindi direktang paraan ng RIF ay upang matukoy ang antigen-antibody complex gamit ang antiglobulin (anti-antibody) serum na may label na fluorochrome. Upang gawin ito, ang mga smear mula sa isang suspensyon ng mga microbes ay ginagamot ng mga antibodies ng antimicrobial rabbit diagnostic serum. Pagkatapos ay ang mga antibodies na hindi nakagapos ng mga microbial antigens ay hinuhugasan, at ang mga antibodies na natitira sa mga mikrobyo ay makikita sa pamamagitan ng paggamot sa smear na may antiglobulin (anti-rabbit) serum na may label na fluorochromes. Bilang resulta, nabuo ang isang kumplikadong microbe + antimicrobial rabbit antibodies + anti-rabbit antibodies na may label na fluorochrome. Ang kumplikadong ito ay sinusunod sa isang fluorescent microscope, tulad ng sa direktang pamamaraan.

ELISA method, o analysis (ELISA)

ELISA -pagtuklas ng mga antigen gamit ang kanilang kaukulang mga antibodies na pinagsama sa isang may label na enzyme (horseradish peroxidase, beta-galactosidase o alkalina phosphatase). Matapos maisama ang antigen sa immune sera na may label na enzyme, ang substrate/chromogen ay idinagdag sa pinaghalong. Ang substrate ay pinuputol ng enzyme, at nagbabago ang kulay ng produkto ng reaksyon - ang intensity ng kulay ay direktang proporsyonal sa bilang ng mga nakagapos na molekula ng antigen at antibody.

Solid phase ELISA - ang pinakakaraniwang variant ng immunological test, kapag ang isa sa mga bahagi ng immune response (antigen o antibodies) ay na-adsorbed sa isang solidong carrier, halimbawa, sa mga balon ng polystyrene plates

Kapag tinutukoy ang mga antibodies, ang blood serum ng pasyente, antiglobulin serum na may label na enzyme, at ang substrate (chromogen) para sa enzyme ay sunud-sunod na idinaragdag sa mga balon ng mga plato na may adsorbed antigen.

Sa bawat oras pagkatapos ng pagdaragdag ng susunod na bahagi, ang mga hindi nakatali na reagents ay tinanggal mula sa mga balon sa pamamagitan ng masusing paghuhugas. Sa isang positibong resulta nagbabago ang kulay ng chromogen solution. Ang isang solid-phase carrier ay maaaring maging sensitibo hindi lamang sa isang antigen, kundi pati na rin sa mga antibodies. Pagkatapos, ang ninanais na antigen ay ipinapasok sa mga balon na may adsorbed antibodies, ang immune serum laban sa antigen na may label na enzyme ay idinagdag, at pagkatapos ay idinagdag ang substrate para sa enzyme.

Competitive ELISA . ang target na antigen at ang antigen na may label na enzyme ay nakikipagkumpitensya sa isa't isa para sa pagbubuklod ng limitadong halaga ng immune serum antibodies. Ang isa pang pagsubok ay ang mga antibodies na iyong hinahanap

at ang mga may label na antibodies ay nakikipagkumpitensya sa isa't isa para sa mga antigen.

Radioimmunological method, o analysis (RIA)

Isang napakasensitibong pamamaraan batay sa reaksyon ng antigen-antibody gamit ang mga antigen o antibodies na may label na radionuclide (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr, atbp.). Pagkatapos ng kanilang pakikipag-ugnayan, ang nagreresultang radioactive immune complex ay pinaghihiwalay at ang radioactivity nito ay tinutukoy sa naaangkop na counter (beta o gamma radiation):

ang intensity ng radiation ay direktang proporsyonal sa bilang ng mga nakagapos na molekula ng antigen at antibody.

Sa solid-phase na bersyon ng RIA isa sa mga sangkap ng reaksyon (antigen o antibodies) ay na-adsorbed sa isang solidong carrier, halimbawa, sa mga balon ng polystyrene microarrays. Ang isa pang bersyon ng pamamaraan ay mapagkumpitensyang RIA. ang target na antigen at ang radionuclide na may label na antigen ay nakikipagkumpitensya sa isa't isa para sa pagbubuklod ng limitadong halaga ng immune serum antibodies. Ang pagpipiliang ito ay ginagamit upang matukoy ang dami ng antigen sa materyal ng pagsubok.

Ang RIA ay ginagamit upang makita ang mga microbial antigens, matukoy ang mga hormone, enzymes, mga sangkap na panggamot at immunoglobulins, pati na rin ang iba pang mga sangkap na nakapaloob sa materyal ng pagsubok sa mga menor de edad na konsentrasyon - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Ang pamamaraan ay nagpapakita ng isang tiyak na panganib sa kapaligiran.

Immunoblotting

Immunoblotting (IB)- isang napaka-sensitibong pamamaraan batay sa kumbinasyon ng electrophoresis at ELISA o RIA.

Ang antigen ay nakahiwalay gamit ang polyacrylamide gel electrophoresis, pagkatapos ay inilipat ito (blotting - mula sa English. blot, spot) mula sa gel papunta sa activated paper o nitrocellulose membrane at binuo ng ELISA. Ang mga kumpanya ay gumagawa ng gayong mga piraso na may "blots"

antigens. Ang serum ng pasyente ay inilalapat sa mga piraso na ito. Pagkatapos, pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog, ang pasyente ay hugasan mula sa hindi nakatali na mga antibodies ng pasyente at ang serum laban sa mga immunoglobulin ng tao, na may label na isang enzyme, ay inilapat. Ang kumplikadong antigen + antibody ng pasyente + antibody laban sa human Ig na nabuo sa strip ay nakita sa pamamagitan ng pagdaragdag ng substrate / chromogen na nagbabago ng kulay sa ilalim ng pagkilos ng enzyme (Fig. 13.12).

Ang IB ay ginagamit bilang isang diagnostic na paraan para sa impeksyon sa HIV, atbp.

reaksyon ng pag-ulan ay batay sa pagbuo ng isang precipitate - ang pag-ulan ng antigen-antibody immune complexes. Sa mga solusyon, namuo sila, at sa mga gel sila ay idineposito sa anyo ng mga banda. Upang matukoy ang konsentrasyon ng mga antibodies sa materyal ng pagsubok, ginagamit ang mga purified antigens, at maraming mga paraan upang maisagawa ang reaksyon ng pag-ulan.

Pag-ulan sa solusyon

Ang reaksyon ng pag-ulan sa mga solusyon ay may isang tampok: ang dami ng namuo ay depende sa dami ng reagent (antibodies). Kung ang halaga ng mga antibodies ay mas mababa kaysa sa dami ng antigen, kung gayon ang pagtaas sa dami ng huli ay humahantong sa isang mas malaking pagbuo ng isang namuo. Ang pinakamalaking bilang nabubuo ang precipitate na may medyo pantay na dami ng antigens at antibodies. Kung ang antigen ay labis kumpara sa mga antibodies, pagkatapos ay sa isang pagtaas sa konsentrasyon nito, ang halaga ng namuo ay bumababa.

immunodiffusion

Ang pinakakaraniwang paraan ng pagsasagawa ng mga reaksyon ng pag-ulan ay nauugnay sa immunodiffusion - ang kakayahan ng mga antibodies at antigens na tumagos sa gel.
Para sa simpleng radial immunodiffusion, ginagamit ang isang gel na naglalaman ng mga antibodies. Ang mga round cut ay ginawa sa isang manipis na layer ng gel at ang test material na may antigens ay inilalagay sa kanila, na tumagos nang malalim sa gel, nakikipag-ugnayan sa mga antibodies at bumubuo ng mga precipitate ring sa paligid ng mga balon. Sa ganitong paraan, natutukoy ang nilalaman ng mga immunoglobulin sa dugo.
Maraming reagents para sa mga pagsusuri sa biochemical inilabas na naayos sa mga tablet. Ang bawat cell ng tablet ay naglalaman ng isang mahigpit na sinusukat na halaga ng reagent, kaya maaari kang magsagawa ng maraming pagsusuri nang sabay-sabay na may mataas na katumpakan ng mga resulta.
Sa double radial immunodiffusion, dalawang bilog na butas ang pinutol sa isang manipis na layer ng gel sa isang tiyak na distansya mula sa isa't isa. Ang reagent ay inilalagay sa isa, at ang pagsubok na materyal ay inilalagay sa isa pa. Ang mga antibodies at antigens ay tumagos sa gel patungo sa isa't isa. Ang isang precipitate ay nabuo sa site ng kanilang pakikipag-ugnayan.
Upang matukoy ang konsentrasyon ng antigen sa materyal na pagsubok, ang distansya mula sa balon kasama nito hanggang sa namuong linya ay sinusukat.

Sa kaibahan sa reaksyon ng agglutination, ang antigen para sa reaksyon ng pag-ulan ay mga natutunaw na compound, ang laki ng mga particle na lumalapit sa laki ng mga molekula. Ang mga ito ay maaaring mga protina, complex ng mga protina na may carbohydrates at lipids, bacterial extracts, iba't ibang disates o filtrates ng microbial broth cultures. Ang mga antibodies na kasangkot sa reaksyon ng pag-ulan ay tinatawag na precipitin. Ang nagreresultang fine antigen-antibody complex ay natutukoy ng ilang mga pamamaraan ng pagtatanghal ng reaksyon ng pag-ulan.

Ang reaksyon ng pag-ulan ng singsing ay unang iminungkahi ni Ascoli. Ginagamit ito sa pagsusuri ng anthrax, salot, tularemia, meningitis. Ang pamamaraan ay simple at naa-access.

Ang isang tiyak na immune precipitating serum ay ibinubuhos sa makitid na namuong mga tubo at ang antigen ay napakaingat na inilalagay dito. Bilang isang antigen, halimbawa, kapag nag-diagnose ng anthrax, kinukuha ang mga piraso ng balat, lana, balat ng nahulog na hayop, atbp. Ang mga ito ay pinakuluan, ang likido ay sinasala at ginagamit bilang isang antigen. Ang hitsura ng isang singsing sa hangganan ng dalawang likido - isang precipitate ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng kaukulang antigen.

Ang agar gel precipitation reaction, o diffusion precipitation method, ay ginagawang posible na pag-aralan nang detalyado ang komposisyon ng mga kumplikadong nalulusaw sa tubig na antigenic mixtures. Upang i-set up ang reaksyon, isang gel (semi-liquid o mas makapal na agar) ay ginagamit. Ang bawat bahagi na bumubuo sa antigen ay nagkakalat patungo sa kaukulang antibody sa ibang rate. Samakatuwid, ang mga complex ng iba't ibang antigens at kaukulang antibodies ay matatagpuan sa iba't ibang lugar gel, kung saan nabuo ang mga linya ng pag-ulan. Ang bawat isa sa mga linya ay tumutugma lamang sa isang antigen-antibody complex. Ang reaksyon ng pag-ulan ay karaniwang nakatakda sa temperatura ng silid.

Ang paraan ng immunoelectrophoresis ay malawakang ginagamit sa mga nakaraang taon sa pag-aaral ng antigenic na istraktura ng microbes. Ang complex ng antigens ay inilalagay sa balon, na matatagpuan sa gitna ng agar gel, na ibinuhos sa plato. Pagkatapos, ang isang electric current ay dumaan sa agar gel, bilang isang resulta kung saan ang iba't ibang mga antigens na kasama sa complex ay lumipat sa field. agos ng kuryente depende sa kanilang electrophoretic mobility. Matapos makumpleto ang electrophoresis, ang isang tiyak na immune serum ay ipinakilala sa trench na matatagpuan sa gilid ng plato at inilagay sa isang mahalumigmig na silid. Sa mga lugar kung saan nabuo ang antigen-antibody complex, lumilitaw ang mga linya ng pag-ulan.

Ang reaksyon ng pag-ulan ay isang napakasensitibong pamamaraan at ginagamit sa pag-aaral ng iba't ibang protina at polysaccharide antigens sa forensic. medikal na kasanayan upang matukoy ang mga species ng mga mantsa ng dugo, tabod, suwero, na magagamit sa linen at iba't ibang mga bagay. Ang reaksyong ito ay maaari ding gamitin upang matukoy ang iba't ibang mga dumi sa gatas, isda at mga produktong karne, upang matukoy ang likas na katangian ng mga protina na bumubuo sa mga pintura ng mga sinaunang masters ng pagpipinta.

Sa reaksyon ng precipitation, ang isang tiyak na immune complex ay namuo, na binubuo ng isang natutunaw na antigen (lysate, extract, hapten) at isang tiyak na antibody sa pagkakaroon ng mga electrolytes.

Ang maulap na singsing o precipitate na nabuo bilang resulta ng reaksyong ito ay tinatawag na precipitate. Ang reaksyong ito ay naiiba sa reaksyon ng agglutination pangunahin sa laki ng mga partikulo ng antigen.

Ang reaksyon ng pag-ulan ay karaniwang ginagamit upang matukoy ang antigen sa pagsusuri ng isang bilang ng mga impeksiyon (anthrax, meningitis, atbp.); sa forensic medicine - upang matukoy ang mga species ng dugo, tamud, atbp.; sa sanitary at hygienic studies - kapag nagtatatag ng falsification ng mga produkto; sa tulong nito matukoy ang phylogenetic na relasyon ng mga hayop at halaman. Para sa reaksyon na kailangan mo:

1. Antibodies (precipitin) - immune serum na may mataas na titer ng antibodies (hindi mas mababa sa 1:100,000). Ang titer ng precipitating serum ay tinutukoy ng pinakamataas na pagbabanto ng antigen kung saan ito tumutugon. Serum ay karaniwang ginagamit undiluted o diluted 1:5 - 1:10.

2. Antigen - mga dissolved substance ng isang protina o lipoid polysaccharide na kalikasan (kumpletong antigens at haptens).

3. Isotonic solution.

Ang mga pangunahing pamamaraan para sa pagsasagawa ng reaksyon ng pag-ulan ay: reaksyon ng pag-ulan ng singsing at reaksyon ng pag-ulan sa agar (gel).

Pansin! Ang lahat ng mga sangkap na kasangkot sa reaksyon ng pag-ulan ay dapat na ganap na transparent.

Reaksyon ng pag-ulan ng singsing. Ang 0.2-0.3 ml (5-6 patak) ng serum ay idinagdag sa precipitation tube gamit ang Pasteur pipette (ang serum ay hindi dapat mahulog sa mga dingding ng tubo). Ang antigen ay maingat na inilalagay sa serum sa parehong dami, na ibinubuhos ito ng manipis na Pasteur pipette sa dingding ng test tube. Ang test tube ay pinananatili sa isang hilig na posisyon. Sa wastong layering, ang isang malinaw na hangganan ay dapat makuha sa pagitan ng suwero at ng antigen. Maingat, upang hindi paghaluin ang likido, ilagay ang test tube sa isang tripod. Sa isang positibong resulta ng reaksyon, ang isang maulap na "singsing" ay nabuo sa hangganan ng antigen at antibody - isang precipitate (tingnan ang Fig. 48).

Ang reaksyon ay sinusundan ng isang bilang ng mga kontrol (Talahanayan 18). Napakahalaga ng pagkakasunod-sunod ng pagpasok ng mga sangkap ng reaksyon sa test tube. Imposibleng i-layer ang suwero sa antigen (sa kontrol - sa isotonic solution), dahil relatibong density mayroong higit na suwero, ito ay lulubog sa ilalim ng tubo, at ang hangganan sa pagitan ng mga likido ay hindi mabubunyag.

Talahanayan 18

Tandaan. + ang pagkakaroon ng isang "singsing"; - kakulangan ng "singsing".

Ang mga resulta ay naitala pagkatapos ng 5-30 minuto, sa ilang mga kaso pagkatapos ng isang oras, gaya ng nakasanayan, simula sa mga kontrol. Ang "singsing" sa 2nd test tube ay nagpapahiwatig ng kakayahan ng immune serum na pumasok sa isang partikular na reaksyon na may kaukulang antigen. Dapat na walang "mga singsing" sa ika-3-5 na mga tubo ng pagsubok - walang mga antibodies at antigens na tumutugma sa bawat isa. Ang "singsing" sa 1st tube - isang positibong resulta ng reaksyon - ay nagpapahiwatig na ang pagsubok na antigen ay tumutugma sa kinuha na immune serum, ang kawalan ng isang "singsing" ("singsing" lamang sa 2nd tube) ay nagpapahiwatig ng kanilang hindi pagkakapare-pareho - isang negatibong reaksyon resulta.

Reaksyon ng pag-ulan sa agar (gel). Ang kakaiba ng reaksyon ay ang pakikipag-ugnayan ng antigen at antibody ay nangyayari sa isang siksik na daluyan, ibig sabihin, sa isang gel. Ang resultang precipitate ay nagbibigay ng maulap na banda sa kapal ng medium. Ang kawalan ng banda ay nagpapahiwatig ng hindi pagkakatugma sa pagitan ng mga bahagi ng reaksyon. Ang reaksyong ito ay malawakang ginagamit sa biomedical na pananaliksik, lalo na sa pag-aaral ng pagbuo ng toxin sa causative agent ng dipterya.

mga tanong sa pagsusulit

1. Ano ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng reaksyon ng agglutination at precipitation?

2. Bakit hindi maaaring gamitin ang maulap na sangkap sa reaksyon ng pag-ulan?

Mag-ehersisyo

1. I-set up ang ring precipitation reaction at iguhit ang resulta.

2. Pag-aralan ang likas na katangian ng pakikipag-ugnayan ng antigen sa antibody sa agarang reaksyon ng precipitation, iguhit ang resulta (kunin ang tasa mula sa guro).

Reaksyon ng Lysis (immune cytolysis)

Ang immune lysis ay ang paglusaw ng mga selula sa ilalim ng impluwensya ng mga antibodies na may sapilitan na pakikilahok ng pandagdag. Para sa reaksyon na kailangan mo:

1. Antigen - microbes, erythrocytes o iba pang mga cell.

2. Antibody (lysine) - immune serum, bihira ang serum ng pasyente. Ang bacteriaolytic serum ay naglalaman ng mga antibodies na kasangkot sa lysis ng bakterya; hemolytic - mga hemolysin na nag-aambag sa lysis ng mga pulang selula ng dugo; para sa lysis ng spirochetes, spirochetolizins ay kinakailangan, mga cell - itolizins, atbp.

3. Komplemento. Karamihan sa mga pandagdag sa serum mga guinea pig. Ang serum na ito (halo mula sa ilang mga hayop) ay kadalasang ginagamit bilang pandagdag. Ang sariwang (katutubong) pandagdag ay hindi matatag at madaling masira sa pamamagitan ng pag-init, pag-alog, pag-iimbak, kaya maaari itong magamit nang hindi hihigit sa dalawang araw pagkatapos matanggap. Upang mapanatili ang pandagdag, 2% ang idinagdag dito. boric acid at 3% sodium sulfate. Ang pandagdag na ito ay maaaring maimbak sa 4°C nang hanggang dalawang linggo. Ang dry complement ay mas karaniwang ginagamit. Bago gamitin, ito ay natunaw sa isang isotonic na solusyon sa orihinal na dami (ipinahiwatig sa label).

4. Isotonic solution.

Reaksyon ng hemolysis(Talahanayan 19). Para sa reaksyon na kailangan mo:

1. Antigen - 3% na suspensyon ng mga hugasan na erythrocytes ng tupa sa rate na 0.3 ml ng erythrocyte sediment at 9.7 ml isotonic na solusyon.

2. Antibody - hemolytic serum (hemolysin) laban sa mga erythrocytes ng tupa; karaniwang inihanda sa produksyon, lyophilized at ang titer ay ipinahiwatig sa label.

Ang hemolysin titer ay ang pinakamataas na serum dilution kung saan ang kumpletong hemolysis ng 3% suspension ng erythrocytes ay nangyayari sa pagkakaroon ng complement. Para sa reaksyon ng hemolysis, ang hemolysin ay kinuha sa isang triple titer, ibig sabihin, ito ay natunaw ng 3 beses na mas mababa kaysa bago ang titer. Halimbawa, kung ang serum titer ay 1:1200, ang serum ay diluted 1:400 (0.1 ml ng serum* at 39.9 ml ng isotonic saline). Ang labis na hemolysin ay kinakailangan, dahil ang ilan sa mga ito ay maaaring ma-adsorbed ng iba pang mga bahagi ng reaksyon.

* (Mas mababa sa 0.1 ml ng serum ang hindi dapat kunin - naghihirap ang katumpakan ng pagsukat.)

3. Ang pandagdag ay diluted 1:10 (0.2 ml ng pandagdag at 1.8 ml ng isotonic saline).

4. Isotonic solution.

Talahanayan 19. Scheme ng hemolysis reaction

Accounting para sa mga resulta. Sa tamang itinakda na reaksyon sa 1st test tube, magaganap ang hemolysis - magiging transparent ang mga nilalaman nito. Sa mga kontrol, nananatiling maulap ang likido: sa ika-2 tubo, nawawala ang pandagdag para sa simula ng hemolysis, sa ika-3 tubo, walang hemolysin, sa ika-4 na tubo, walang hemolysin o pandagdag, sa ika-5 tubo, ang antigen ay hindi tumutugma sa antibody,

Kung kinakailangan, ang hemolytic serum ay titrated ayon sa sumusunod na pamamaraan (Talahanayan 20).

Bago ang titration, isang paunang serum dilution na 1:100 (0.1 ml ng serum at 9.9 ml ng isotonic saline) ay inihanda, kung saan ang mga kinakailangang dilution ay ginawa, halimbawa:

Sa mga dilution na ito, ang 0.5 ml ng serum ay idinagdag sa mga test tube ng karanasan sa titration, tulad ng ipinapakita sa Talahanayan. dalawampu.

Talahanayan 20. Titration scheme para sa hemolytic serum (hemolysin)

Sa halimbawang ibinigay sa Talahanayan. 20, ang titer ng hemolytic serum ay 1:1200.

Kapag gumagamit ng sariwang hemolytic serum, dapat itong hindi aktibo upang sirain ang pandagdag nito. Upang gawin ito, pinainit ito ng 30 minuto sa 56 ° C sa isang paliguan ng tubig o sa isang inactivator na may termostat. Ang huling paraan ay mas mahusay: inaalis nito ang posibilidad ng sobrang pag-init ng serum, ibig sabihin, ang denaturation nito. Ang denatured sera ay hindi angkop para sa pagsubok.

reaksyon ng bacteriolysis. Sa reaksyong ito, ang bakterya ay kinukumpleto sa pagkakaroon ng naaangkop (homologous) serum. Ang scheme ng reaksyon sa panimula ay katulad ng scheme ng reaksyon ng hemolysis. Ang pagkakaiba ay pagkatapos ng dalawang oras na pagpapapisa ng itlog, ang lahat ng mga test tube ay ibinuhos sa mga Petri dish na may medium na paborable para sa microorganism na kinuha sa eksperimento upang malaman kung ito ay lysed. Sa wastong itinakda na karanasan sa mga pananim mula sa 2nd-5th test tubes (mga kontrol), dapat magkaroon ng masaganang paglaki. Ang kakulangan ng paglaki o mahinang paglaki sa kultura mula sa 1st test tube (eksperimento) ay nagpapahiwatig ng pagkamatay ng mga mikrobyo, ibig sabihin, na sila ay homologous sa antibody.

Pansin! Ang reaksyon ng bacteriolysis ay dapat isagawa sa ilalim ng mga kondisyong aseptiko.

mga tanong sa pagsusulit

1. Ano ang mangyayari sa erythrocytes kung distilled water ang gagamitin sa halip na isotonic sodium chloride solution? Ano ang pinagbabatayan ng hindi pangkaraniwang bagay na ito?

2. Anong reaksyon ang magaganap kapag ang mga erythrocytes ay nakikipag-ugnayan sa homologous immune serum sa kawalan ng complement?

Mag-ehersisyo

I-set up ang reaksyon ng hemolysis. Itala at iguhit ang resulta.

Ang maulap na singsing o precipitate na nabuo bilang resulta ng reaksyong ito ay tinatawag namuo. Ang reaksyong ito ay naiiba sa reaksyon ng agglutination pangunahin sa laki ng mga partikulo ng antigen.

2. Antigen - mga dissolved substance ng isang protina o lipoid polysaccharide na kalikasan (kumpletong antigens at haptens).

3. Isotonic solution.

Ang mga pangunahing pamamaraan para sa pagsasagawa ng reaksyon ng pag-ulan ay: reaksyon ng pag-ulan ng singsing at reaksyon ng pag-ulan sa agar (gel).

Pansin! Ang lahat ng mga sangkap na kasangkot sa reaksyon ng pag-ulan ay dapat na ganap na transparent.

Reaksyon ng pag-ulan ng singsing. Ang 0.2 - 0.3 ml (5-6 na patak) ng serum ay idinagdag sa precipitation tube gamit ang Pasteur pipette (ang serum ay hindi dapat mahulog sa mga dingding ng tubo). Ang antigen ay maingat na inilalagay sa serum sa parehong dami, na ibinubuhos ito ng manipis na Pasteur pipette sa dingding ng test tube. Ang test tube ay pinananatili sa isang hilig na posisyon. Sa wastong layering, ang isang malinaw na hangganan ay dapat makuha sa pagitan ng suwero at ng antigen. Maingat, upang hindi paghaluin ang likido, ilagay ang test tube sa isang tripod. Sa isang positibong resulta ng reaksyon, ang isang maulap na "singsing" ay nabuo sa hangganan ng antigen at antibody - isang precipitate.

Reaksyon ng pag-ulan sa agar(gel). Ang kakaiba ng reaksyon ay ang pakikipag-ugnayan ng antigen at ang antibody ay nangyayari sa isang siksik na daluyan, i.e. sa gel. Ang resultang precipitate ay nagbibigay ng maulap na banda sa kapal ng medium. Ang kawalan ng banda ay nagpapahiwatig ng hindi pagkakatugma sa pagitan ng mga bahagi ng reaksyon. Ang reaksyong ito ay malawakang ginagamit sa biomedical na pananaliksik, lalo na sa pag-aaral ng pagbuo ng toxin sa causative agent ng dipterya.

Reaksyon ng Lysis (immune cytolysis)

immune lysis- ito ang paglusaw ng mga selula sa ilalim ng impluwensya ng mga antibodies na may sapilitan na pakikilahok ng pandagdag. Para sa reaksyon na kailangan mo:

1. Antigen microbes, erythrocytes o iba pang mga cell.

2. Antibody(lysine) - immune serum, bihira ang serum ng pasyente. Ang bacteriaolytic serum ay naglalaman ng mga antibodies na kasangkot sa lysis ng bakterya; hemolytic - mga hemolysin na nag-aambag sa lysis ng mga pulang selula ng dugo; para sa lysis ng spirochetes, spirochetolizins, mga cell - itolizins, atbp ay kinakailangan.

3. Komplemento. Karamihan sa mga pandagdag sa suwero ng mga guinea pig. Ang serum na ito (halo mula sa ilang mga hayop) ay kadalasang ginagamit bilang pandagdag.

4. Isotonic na solusyon.