mga kultura ng cell

Mga hayop

Indikasyon ng mga virus sa pamamagitan ng mga sumusunod na phenomena

pag-unlad pagkaantala,

kamatayan, pagbabago

mga shell ng embryo, RGA

CPP, plaque formation, RIF, RGads, interference

sakit, kamatayan,

mga pagbabago sa histological

sa mga tisyu, mga inklusyon

Titration ng nakahiwalay na virus; pagpili ng dosis ng pagtatrabaho.

Titer ng virus- ang maximum na pagbabanto ng materyal na naglalaman ng virus, kung saan ang inaasahang epekto ay sinusunod pa rin (CPE, RHA, pagkamatay ng hayop).

Pagkilala sa nakahiwalay na virus sa mga reaksyon ng neutralisasyon, RTGads, RSK, pagsugpo sa pagbuo ng plaka, atbp. na may diagnostic sera. Uri (uri) ng virus tinutukoy ng neutralisasyon ng tiyak na epekto ng virus ng kaukulang immune serum.

Tandaan: ang titration at pagkilala sa virus ay ginagawa gamit ang parehong phenomenon.

Paglilinang ng virus

gawaing kurso

"Mga paraan ng clinical virology"

Panimula

Ang pagsusuri sa laboratoryo ng mga impeksyon sa viral ay pangunahing isinasagawa gamit ang electron microscopy, mga sensitibong kultura ng cell at immunological na pamamaraan. Bilang isang patakaran, ang anumang isang paraan ay pinili para sa pagsusuri, depende sa yugto ng impeksyon sa viral. Kaya, halimbawa, ang lahat ng tatlong diskarte ay maaaring maging kapaki-pakinabang sa pagsusuri ng bulutong-tubig, ngunit ang matagumpay na paggamit ng mga pamamaraan ng microscopy at cell culture ay nakasalalay sa kakayahang mangolekta ng mga kasiya-siyang sample sa medyo maagang yugto ng sakit.

Sa isang malaking lawak tagumpay viral diagnostics depende sa kalidad ng mga nakuhang sample. Para sa kadahilanang ito, ang mga kawani ng laboratoryo mismo ay dapat na direktang kasangkot sa koleksyon ng mga kinakailangang sample. Ang mga katangian ng mga sample, pati na rin ang mga paraan ng kanilang paghahatid sa laboratoryo, ay inilarawan ni Lennett, Schmidt, Krist et al.

Karamihan sa mga reagents at instrumento na ginagamit sa mga diagnostic ng laboratoryo ay makukuha mula sa iba't ibang kumpanya. Sa karamihan ng mga kaso, ang parehong reagent ay ginawa nang sabay-sabay ng ilang mga kumpanya. Para sa kadahilanang ito, hindi kami naglista ng mga indibidwal na kumpanya, maliban kung ang reagent ay ibinibigay lamang ng isang kumpanya. Sa lahat ng iba pang mga kaso, dapat kang sumangguni sa pangkalahatang listahan ng mga supplier na nakasaad sa Talahanayan. 1.

Hindi namin nilalayon ang isang komprehensibong paglalarawan ng lahat ng kasalukuyang magagamit na mga pamamaraan para sa pag-diagnose ng mga impeksyon sa viral ng tao. Una sa lahat, inilarawan namin ang mga pangunahing pamamaraan. Habang nakakakuha ka ng karanasan pansariling gawain ang mga pangunahing pamamaraan na ito ay maaaring gamitin upang malutas ang mas kumplikadong mga problema.

1. Electron microscopy

Para sa electron microscopic diagnosis ng mga impeksyon sa viral, maaaring gamitin ang manipis na mga seksyon ng apektadong tissue. Ang pinakakaraniwang materyal para sa electron microscopy ay feces o likido.

Talahanayan 1. Listahan ng mga kumpanyang nagbibigay ng mga reagents at kagamitan

mga vesicle na nagpapakilala sa ilang mga sakit, halimbawa bulutong. Sa pagsusuri ng naturang materyal, ang mga virus ay maaaring makita gamit ang negatibong paglamlam, na humahantong sa delineation ng mga bahagi ng virion na may materyal na siksik ng elektron. Ang pamamaraan ay epektibo sa mataas na konsentrasyon ng virus sa mga specimen ng pagsubok, tulad ng sa mga dumi o vesicular fluid. Sa mga kaso kung saan ang nilalaman ng mga viral particle sa mga sample ay mababa, ang posibilidad ng pag-detect ng virus ay maaaring tumaas sa pamamagitan ng pag-concentrate ng virus sa pamamagitan ng ultracentrifugation o sa pamamagitan ng pagsasama-sama nito sa mga partikular na antibodies. Ang huling paraan ay maginhawa din para sa pagtukoy ng mga virus. Dito inilalarawan namin ang electron microscopic na paraan para sa pag-diagnose impeksyon ng rotavirus at ang paraan ng immunoelectron microscopy sa halimbawa ng pagtuklas ng mga tiyak na antibodies sa mga parvovirus. Ang mga pamamaraan ng electron microscopy ay inilarawan nang mas detalyado ng Field.

2.1 Direktang electron microscopy ng mga dumi

1. Ang dulo ng Pasteur pipette ay inilulubog sa mga dumi at sapat na materyal ang nakolekta upang makakuha ng 1 cm smear.

2. Muling suspindihin ang fecal smear sa negative electron microscope stain hanggang sa makakuha ng translucent suspension. Ang negatibong contrast stain ay isang 2% na solusyon ng phosphotungstic acid sa distilled water.

3. Upang makakuha ng isang electron microscopic na paghahanda, isang suspension droplet ay inilalagay sa isang electron microscopy grid na pinahiran ng carbon-formvar film. Sa panahon ng operasyong ito, ang mesh ay hinahawakan gamit ang isang pares ng pinong sipit.

4. Ang gamot ay naiwan sa hangin sa loob ng 30 segundo.

5. Ang labis na likido ay tinanggal sa pamamagitan ng pagpindot sa gilid ng baso na may filter na papel.

6. Ang gamot ay pinatuyo sa hangin.

7. Kung kinakailangan, ang mabubuhay na virus ay hindi aktibo sa pamamagitan ng pag-iilaw sa magkabilang panig ng grid na may ultraviolet light sa intensity na 440,000 μW-s/cm 2 . Gumagamit ito ng shortwave lampara ng ultraviolet may filter. Ang lampara ay dapat nasa layo na 15 cm mula sa grid; oras ng pag-iilaw ng bawat panig - 5 min.

8. Ang mga virion ng Rotavirus ay maaaring makilala sa ilalim ng paghahatid electron microscope na may pagtaas mula 30,000 hanggang 50,000.

2.2 Immunoelectron microscopy

Ang paraan ng immunoelectron microscopy na inilarawan sa ibaba ay isa lamang sa maraming mga immunological na pamamaraan. Upang pag-aralan ang mga antibodies na partikular sa virus, bilang karagdagan, ginagamit ang isang paraan na nagsasangkot ng pagbubuklod sa isang mikroskopikong network ng protina A. Ang gumaganang konsentrasyon ng mga antiviral antibodies ay tinutukoy ng pagsubok at pagkakamali sa saklaw mula 1/10 hanggang 1/1000. Ang konsentrasyon na ipinahiwatig sa amin, bilang panuntunan, ay ginagamit sa karaniwang gawain. Upang makakuha ng pinakamainam na resulta ng pakikipag-ugnayan ng mga antibodies sa virus, ang serum na naglalaman ng parvovirus ay titrated sa parehong paraan.

1. 10 µl ng human parvovirus antiserum na diluted 100-fold na may PBS. Ang solusyon ay pinainit sa isang paliguan ng tubig sa 56 ° C.

2. Matunaw ang 10 ml ng 2% agarose sa PBS sa karaniwang paraan at palamig sa 56°C sa isang paliguan ng tubig.

3. Sa 56°C, paghaluin ang 1 ml ng diluted antiserum na may 1 ml ng 2% agarose.

4. Ilipat ang 200 µl ng nagresultang timpla sa dalawang balon ng 96-well microtiter plate.

5. Hayaang tumigas ang agarose sa temperatura ng silid. Ang plato ay maaaring itago sa 4°C sa loob ng ilang linggo kung tinatakan ng adhesive tape.

6. Magdagdag ng 10 µl ng serum na naglalaman ng parvovirus sa balon na naglalaman ng pinaghalong agarose at antiserum.

7. Ang isang electron microscopy grid na may pre-prepared carbon-formvar coating ay inilalagay na may hindi gaanong makintab na bahagi sa isang patak ng serum.

8. Ang grid ay pinananatili sa loob ng 2 oras sa 37 °C sa isang mahalumigmig na silid.

9. Gamit ang manipis na sipit, ang mesh ay kinuha at ang isang drop ng 2% phosphotungstic acid ay inilapat sa ibabaw ng mesh na ay sa contact na may serum.

10. Pagkatapos ng 30 s, ang labis na pintura ay hugasan, ang paghahanda ay tuyo at ang virus ay hindi aktibo.

Ang pinagsama-samang mga partikulo ng viral ay sinusuri sa ilalim ng isang transmission electron microscope sa isang magnification na 30,000 hanggang 50,000.

3. Pagkilala sa mga viral antigens

Ang mga virus sa mga tissue o tissue fluid ay maaaring matukoy ng mga protina na partikular sa virus gamit ang antigen-antibody reaction. Ang produkto ng reaksyon ng antigen-antibody ay sinusuri para sa isang label, na direktang ipinapasok sa mga antiviral antibodies o sa mga antibodies na nakadirekta laban sa mga antibodies na partikular sa virus. Ang mga antibodies ay maaaring mamarkahan ng fluorescein, radioactive iodine, o isang enzyme na pumuputol sa substrate na may pagbabago ng kulay. Bilang karagdagan, ang isang reaksyon ng hemagglutination ay ginagamit upang makilala ang virus. Sa pang-araw-araw na pagsasanay, ang mga pamamaraan na inilarawan ay pangunahing ginagamit upang makita ang mga antigen ng virus ng hepatitis B sa dugo at upang maghanap ng mga antigen ng iba't ibang mga virus na nagdudulot ng iba't ibang mga sakit sa paghinga.

Sa kasalukuyan, maraming mga kumpanya ang gumagawa ng mga erythrocyte, radioactive at enzymatic diagnosticum, kabilang ang mga para sa pagtuklas ng hepatitis B virus. Hindi namin itinuturing na angkop na ilarawan ang mga paraan ng pagtatrabaho sa mga diagnosticum na ito: sapat na upang sundin ang mga nakalakip na tagubilin. Sa ibaba ay tututuon natin ang paraan ng immunofluorescent para sa pagtukoy ng respiratory syncytial virus sa mga pagtatago ng nasopharyngeal.

3.1 Pagkilala sa respiratory syncytial virus sa nasopharyngeal secretions sa pamamagitan ng immunofluorescence

Ang paraan para sa pagkuha ng mga paghahanda ng nasopharyngeal secretions ay inilarawan ni Gardner at McQuilin. Sa mga kondisyon ng laboratoryo, ang operasyong ito ay isinasagawa sa dalawang yugto. Una, ang isang smear ay inihanda mula sa nasopharyngeal mucus sa isang glass slide. Ang mga nakuhang pamunas ay maaaring itago sa isang nakapirming estado sa -20°C sa loob ng maraming buwan. Sa ikalawang yugto, ang mga smear ay nabahiran upang makita ang antigen ng respiratory syncytial virus. Para sa layuning ito, ang paraan ng hindi direktang immunofluorescence ay ginagamit.

3.1.1 Paghahanda ng nasopharyngeal secretions

1. Ang uhog mula sa mga espesyal na forceps ay hugasan ng 1-2 ml ng PBS at inilipat sa isang centrifuge tube.

2. Centrifuge sa loob ng 10 minuto sa 1500 rpm sa isang tabletop centrifuge.

3. Ang supernatant ay itinatapon.

4. Ang cell pellet ay malumanay na muling sinuspinde sa 2-3 ml PBS hanggang sa makuha ang isang homogenous na suspension. Upang gawin ito, gumamit ng isang malawak na bibig na Pasteur pipette.

5. Ang resultang suspensyon ay inililipat sa isang test tube.

6. Magdagdag ng isa pang 2-4 ml ng PBS sa suspensyon at ihalo sa pamamagitan ng pipetting. Ang malalaking clots ng mucus ay tinanggal.

7. Centrifuge sa loob ng 10 minuto sa 1500 rpm sa isang tabletop centrifuge.

8. Ang supernatant ay pinatuyo, ang precipitate ay muling sinuspinde sa dami ng PBS na ang resultang suspensyon ay madaling mahihiwalay sa mga dingding ng test tube.

9. Ang resultang suspensyon ay inilapat sa minarkahang glass slide.

10. Ang baso ay tuyo sa hangin.

Ayusin sa acetone sa loob ng 10 min sa 4°C.

12. Pagkatapos ayusin, ang salamin ay muling tuyo sa hangin.

13. Ang mga resultang paghahanda ay agad na nabahiran o nakaimbak sa -20 °C.

3.1.2. Pamamaraan ng paglamlam

1. I-print at palabnawin ang komersyal na antiserum laban sa RSV sa PBS sa inirerekomendang konsentrasyon sa pagtatrabaho.

2. Maglagay ng isang patak ng antiserum sa inihandang paghahanda gamit ang Pasteur pipette.

3. Ang gamot ay inilalagay sa isang mahalumigmig na silid.

4. Ang paghahanda ay incubated para sa 30 minuto sa 37 °C.

5. Ang mga sample ay maingat na hinuhugasan gamit ang PBS upang maalis ang labis na antibodies sa isang espesyal na tangke.

6. Ang mga sample ay hinuhugasan sa tatlong shift ng PBS sa loob ng 10 min bawat isa.

7. Patuyuin ang mga sample, alisin ang labis na PBS gamit ang filter na papel at tuyo sa hangin.

Mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological— mga pamamaraan para sa pag-aaral ng biology ng mga virus at ang kanilang pagkakakilanlan. Sa virology, ang mga pamamaraan ng molecular biology ay malawakang ginagamit, sa tulong kung saan posible na maitatag ang molekular na istraktura ng mga particle ng viral, kung paano sila tumagos sa cell at ang mga tampok ng pagpaparami ng mga virus, ang pangunahing istraktura ng mga viral nucleic acid. at mga protina. Ang mga pamamaraan para sa pagtukoy ng pagkakasunud-sunod ng mga bumubuo ng mga elemento ng viral nucleic acid at protina amino acids ay binuo. Nagiging posible na maiugnay ang mga pag-andar ng mga nucleic acid at ang mga protina na naka-encode ng mga ito sa pagkakasunud-sunod ng nucleotide at upang maitaguyod ang mga sanhi ng mga proseso ng intracellular na gumaganap. mahalagang papel sa pathogenesis ng impeksyon sa viral.

Ang mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological ay batay din sa mga proseso ng immunological (pakikipag-ugnayan ng antigen sa mga antibodies), mga biological na katangian ng virus (kakayahang mag-hemagglutinate, hemolysis, aktibidad ng enzymatic), mga tampok ng pakikipag-ugnayan ng virus sa host cell (ang likas na katangian ng cytopathic epekto, ang pagbuo ng intracellular inclusions, atbp.) .

Sa pagsusuri ng mga impeksyon sa viral, sa paglilinang, paghihiwalay at pagkakakilanlan ng mga virus, pati na rin sa paghahanda ng mga paghahanda ng bakuna, ang paraan ng tissue at cell culture ay malawakang ginagamit. Ginagamit ang pangunahin, pangalawa, matatag na tuluy-tuloy at diploid na mga kultura ng cell. Ang mga pangunahing kultura ay nakuha sa pamamagitan ng dispersing tissue na may proteolytic enzymes (trypsin, collagenase). Ang pinagmulan ng mga selula ay maaaring mga tisyu at organo (mas madalas na bato) ng mga embryo ng tao at hayop. Ang isang suspensyon ng mga cell sa isang nutrient medium ay inilalagay sa tinatawag na mattresses, bote o Petri dishes, kung saan, pagkatapos ng paglakip sa ibabaw ng sisidlan, ang mga cell ay nagsisimulang dumami. Para sa impeksyon sa virus, karaniwang ginagamit ang isang cell monolayer. Ang nutrient na likido ay pinatuyo, ang viral suspension ay ipinakilala sa ilang mga dilution, at pagkatapos makipag-ugnay sa mga cell, ang sariwang nutrient medium ay idinagdag, kadalasang walang suwero.

Ang mga cell mula sa karamihan sa mga pangunahing kultura ay maaaring i-subculture at tinutukoy bilang pangalawang kultura. Sa karagdagang pagpasa ng mga selula, isang populasyon ng mga selulang tulad ng fibroblast ay nabuo, na may kakayahang mabilis na pagpaparami, karamihan sa mga ito ay nagpapanatili ng orihinal na hanay ng mga kromosom. Ito ang mga tinatawag na diploid cells. Sa serial cultivation ng mga cell, ang matatag na tuluy-tuloy na mga kultura ng cell ay nakuha. Sa panahon ng mga sipi, lumilitaw ang mabilis na paghahati ng mga homogenous na selula na may heteroploid na hanay ng mga chromosome. Ang mga matatag na linya ng cell ay maaaring monolayer at suspensyon. Ang mga kultura ng monolayer ay lumalaki sa anyo ng isang tuluy-tuloy na layer sa ibabaw ng salamin, ang mga kultura ng suspensyon ay lumalaki sa anyo ng mga suspensyon sa iba't ibang mga sisidlan gamit ang mga agitator. Mayroong higit sa 400 mga linya ng cell na nagmula sa 40 iba't ibang uri mga hayop (kabilang ang mula sa mga primata, ibon, reptilya, amphibian, isda, insekto) at mga tao.

Maaaring linangin ang mga piraso sa artipisyal na nutrient media mga indibidwal na katawan at mga tisyu (mga kultura ng organ). Ang mga uri ng kulturang ito ay nagpapanatili ng istraktura ng tissue, na lalong mahalaga para sa paghihiwalay at pagpasa ng mga virus na hindi dumarami sa mga hindi nakikilalang tissue culture (halimbawa, mga coronavirus).

Sa mga nahawaang cell culture, ang mga virus ay maaaring matukoy sa pamamagitan ng pagbabago sa cell morphology, cytopathic action, na maaaring tiyak, ang hitsura ng mga inklusyon, sa pamamagitan ng pagtukoy ng mga viral antigens sa cell at sa culture fluid; pagpapasiya ng mga biological na katangian ng viral progeny sa culture fluid at titration ng mga virus sa tissue culture, chick embryo o sensitibong hayop; sa pamamagitan ng pagtuklas ng mga indibidwal na viral nucleic acid sa mga cell sa pamamagitan ng molecular hybridization o mga kumpol ng nucleic acid sa pamamagitan ng cytochemical method gamit ang fluorescent microscopy.

Ang paghihiwalay ng mga virus ay isang matrabaho at mahabang proseso. Isinasagawa ito upang matukoy ang uri o variant ng virus na umiikot sa populasyon (halimbawa, upang matukoy ang serovariant ng influenza virus, ligaw o bakuna na strain ng polio virus, atbp.); sa mga kaso kung saan kinakailangan na magsagawa ng mga kagyat na hakbang sa epidemiological; kapag lumitaw ang mga bagong uri o variant ng mga virus; kung kinakailangan, kumpirmahin ang paunang pagsusuri; upang ipahiwatig ang mga virus sa mga bagay kapaligiran. Kapag naghihiwalay ng mga virus, ang posibilidad ng kanilang pagtitiyaga sa katawan ng tao, pati na rin ang paglitaw ng magkahalong impeksiyon na dulot ng dalawa o higit pang mga virus, ay isinasaalang-alang. Ang isang genetically homogenous na populasyon ng isang virus na nakuha mula sa isang solong virion ay tinatawag na isang viral clone, at ang proseso ng pagkuha nito ay tinatawag na cloning.

Upang ihiwalay ang mga virus, impeksyon ng madaling kapitan ng mga hayop sa laboratoryo, ginagamit ang mga embryo ng manok, ngunit ang tissue culture ay kadalasang ginagamit. Ang pagkakaroon ng isang virus ay karaniwang tinutukoy ng tiyak na pagkabulok ng cell (cytopathic effect), ang pagbuo ng mga symplast at syncytia, ang pagtuklas ng mga intracellular inclusions, pati na rin ang isang tiyak na antigen na nakita gamit ang immunofluorescence, hemadsorption, hemagglutination (sa hemagglutinating virus), atbp. . Ang mga palatandaang ito ay makikita lamang pagkatapos ng 2-3 mga sipi ng virus.

Para sa paghihiwalay ng isang bilang ng mga virus, tulad ng mga virus ng trangkaso, ginagamit ang mga embryo ng manok, para sa paghihiwalay ng ilang mga virus ng Coxsackie at isang bilang ng mga arbovirus, ginagamit ang mga bagong panganak na daga. Ang pagkilala sa mga nakahiwalay na virus ay isinasagawa gamit ang serological reaksyon at iba pang pamamaraan.

Kapag nagtatrabaho sa mga virus, tinutukoy ang kanilang titer. Ang titration ng mga virus ay kadalasang isinasagawa sa tissue culture, na tinutukoy ang pinakamataas na pagbabanto ng fluid na naglalaman ng virus, kung saan nangyayari ang pagkabulok ng tissue, ang mga inklusyon at mga antigen na partikular sa virus ay nabuo. Ang paraan ng plake ay maaaring gamitin upang titrate ang isang bilang ng mga virus. Ang mga plaque, o mga negatibong kolonya ng mga virus, ay foci ng mga cell na nasira ng virus ng isang solong layer na tissue culture sa ilalim ng agar coating. Ang pagbilang ng kolonya ay nagbibigay-daan sa isang quantitative analysis ng nakakahawang aktibidad ng mga virus sa batayan na ang isang nakakahawang partikulo ng virus ay bumubuo ng isang plaka. Nakikilala ang mga plake sa pamamagitan ng paglamlam sa kultura ng mahahalagang tina, kadalasang neutral na pula; ang mga plake ay hindi sumisipsip sa pangulay at samakatuwid ay nakikita bilang mga light spot laban sa background ng mga stained live na cell. Ang titer ng virus ay ipinahayag bilang ang bilang ng mga yunit na bumubuo ng plaka sa 1 ml.

Ang paglilinis at konsentrasyon ng mga virus ay karaniwang isinasagawa sa pamamagitan ng differential ultracentrifugation na sinusundan ng centrifugation sa concentration o density gradients. Upang linisin ang mga virus, ginagamit ang mga immunological na pamamaraan, ion-exchange chromatography, immunosorbents, atbp.

Kasama sa pagsusuri sa laboratoryo ng mga impeksyon sa viral ang pagtuklas ng pathogen o mga bahagi nito sa klinikal na materyal; paghihiwalay ng virus mula sa materyal na ito; serodiagnosis. Ang pagpili ng pamamaraan ng diagnostic ng laboratoryo sa bawat indibidwal na kaso ay depende sa likas na katangian ng sakit, ang panahon ng sakit at ang mga kakayahan ng laboratoryo. Mga modernong diagnostic Ang mga impeksyon sa viral ay batay sa mga paraan ng pagpapahayag na nagbibigay-daan sa iyong makakuha ng sagot ilang oras pagkatapos kumuha ng klinikal na materyal maagang mga petsa pagkatapos ng sakit, Kabilang dito ang electron at immune electron microscopy, pati na rin ang immunofluorescence, ang paraan ng molecular hybridization, ang pagtuklas ng mga antibodies ng lgM class, atbp.

Ang electron microscopy ng mga negatibong batik na mga virus ay nagbibigay-daan sa pagkita ng kaibahan ng mga virus at pagtukoy ng kanilang konsentrasyon. Ang paggamit ng electron microscopy sa diagnosis ng mga impeksyon sa viral ay limitado sa mga kaso kung saan ang konsentrasyon ng mga viral particle sa klinikal na materyal ay sapat na mataas (10 5 sa 1 ml at mas mataas). Ang kawalan ng pamamaraan ay ang kawalan ng kakayahang makilala sa pagitan ng mga virus na kabilang sa parehong pangkat ng taxonomic. Ang kawalan na ito ay inalis sa pamamagitan ng paggamit ng immune electron microscopy. Ang pamamaraan ay batay sa pagbuo ng mga immune complex kapag ang tiyak na suwero ay idinagdag sa mga particle ng viral, habang ang sabay-sabay na konsentrasyon ng mga particle ng viral ay nangyayari, na ginagawang posible na makilala ang mga ito. Ang pamamaraan ay ginagamit din upang makita ang mga antibodies. Para sa layunin ng mga express diagnostic, ang isang electron microscopic na pagsusuri ng mga extract ng tissue, feces, likido mula sa mga vesicle, at mga lihim mula sa nasopharynx ay isinasagawa. mikroskopya ng elektron malawakang ginagamit upang pag-aralan ang morphogenesis ng virus, ang mga kakayahan nito ay pinalawak sa paggamit ng mga may label na antibodies.

Ang paraan ng molecular hybridization, batay sa pagtuklas ng mga nucleic acid na partikular sa virus, ay ginagawang posible na makita ang mga solong kopya ng mga gene at walang katumbas sa mga tuntunin ng sensitivity. Ang reaksyon ay batay sa hybridization ng mga pantulong na strands ng DNA o RNA (probes) at ang pagbuo ng mga double-stranded na istruktura. Ang pinakamurang probe ay cloned recombinant DNA. Ang probe ay may label na radioactive precursors (karaniwan ay radioactive phosphorus). Ang paggamit ng mga reaksyong colorimetric ay maaasahan. Mayroong ilang mga variant ng molecular hybridization: point hybridization, blot hybridization, sandwich hybridization, in situ hybridization, atbp.

Ang mga antibodies ng class lgM ay lumalabas nang mas maaga kaysa sa class G antibodies (sa ika-3-5 araw ng pagkakasakit) at nawawala pagkatapos ng ilang linggo, kaya ang kanilang pagtuklas ay nagpapahiwatig ng isang kamakailang impeksiyon. Ang mga antibodies ng klase ng IgM ay nakita ng immunofluorescence o enzyme immunoassay gamit ang anti-m antisera (anti-IgM heavy chain sera).

Ang mga pamamaraan ng serological sa virology ay batay sa mga klasikal na reaksyon ng immunological (tingnan. Mga pamamaraan ng immunological na pananaliksik ): complement fixation reactions, hemagglutination inhibition, biological neutralization, immunodiffusion, hindi direktang hematglutination, radial hemolysis, immunofluorescence, enzyme immunoassay, radioimmunoassay. Ang mga micromethod para sa maraming mga reaksyon ay binuo, at ang kanilang mga diskarte ay patuloy na pinagbubuti. Ang mga pamamaraan na ito ay ginagamit upang makilala ang mga virus gamit ang isang hanay ng kilalang sera at para sa serodiagnosis upang matukoy ang pagtaas ng mga antibodies sa pangalawang serum kumpara sa una (ang unang serum ay kinuha sa mga unang araw pagkatapos ng sakit, ang pangalawa - pagkatapos 2-3 linggo). Ang halaga ng diagnostic ay hindi bababa sa apat na beses na pagtaas ng mga antibodies sa pangalawang serum. Kung ang pagtuklas ng mga antibodies ng klase ng lgM ay nagpapahiwatig ng isang kamakailang impeksyon, kung gayon ang mga antibodies ng klase ng lgC ay nagpapatuloy ng ilang taon, at kung minsan ay habang-buhay.

Upang matukoy ang mga indibidwal na antigen ng mga virus at antibodies sa kanila sa mga kumplikadong paghahalo nang walang paunang paglilinis ng protina, ginagamit ang immunoblotting. Pinagsasama ng pamamaraan ang fractionation ng protina gamit ang polyacrylamide gel electrophoresis na may kasunod na immunoassay ng mga protina sa pamamagitan ng enzyme immunoassay. Ang paghihiwalay ng mga protina ay binabawasan ang mga kinakailangan para sa kemikal na kadalisayan antigen at nagbibigay-daan sa iyong makilala ang mga indibidwal na pares ng antigen-antibody. Ang gawaing ito ay may kaugnayan, halimbawa, sa serodiagnosis ng impeksyon sa HIV, kung saan ang maling-positibong enzyme immunoassay reaksyon ay dahil sa pagkakaroon ng mga antibodies sa mga antigen ng cell, na naroroon bilang isang resulta ng hindi sapat na paglilinis ng mga viral protein. Ang pagkakakilanlan ng mga antibodies sa sera ng mga pasyente sa panloob at panlabas na mga antigen ng viral ay ginagawang posible upang matukoy ang yugto ng sakit, at sa pagsusuri ng mga populasyon, ang pagkakaiba-iba ng mga protina ng viral. Ang immunoblotting sa HIV infection ay ginagamit bilang confirmatory test para makita ang mga indibidwal na viral antigens at antibodies sa kanila. Kapag sinusuri ang mga populasyon, ang pamamaraan ay ginagamit upang matukoy ang pagkakaiba-iba ng mga viral protein. Ang malaking halaga ng pamamaraan ay namamalagi sa posibilidad ng pag-aaral ng mga antigens na synthesize gamit ang recombinant DNA technology, na nagtatatag ng kanilang laki at ang pagkakaroon ng mga antigenic determinants.

Ang virological research ay kinabibilangan ng dalawang pangunahing yugto: paghihiwalay ng mga virus at ang kanilang pagkakakilanlan. Ang materyal para sa virological research ay maaaring dugo, iba pang biological at pathological fluid, biopsy ng mga organo at tisyu.

Ang virological blood testing ay kadalasang ginagawa upang masuri ang mga impeksyon sa arbovirus. Ang rabies virus ay matatagpuan sa laway, beke, herpes simplex, Ang mga nasopharyngeal swab ay ginagamit upang ihiwalay ang mga pathogen ng trangkaso at iba pang acute respiratory viral infection, tigdas. Sa mga paghuhugas mula sa conjunctiva, ang mga adenovirus ay matatagpuan. Ang iba't ibang entero-, adsno-, pso-, nora- at rotavirus ay nakahiwalay sa mga dumi.

Ginagamit ang mga cell culture, mga embryo ng manok, at kung minsan ang mga hayop sa laboratoryo upang ihiwalay ang mga virus.

Karamihan sa mga pathogenic na virus ay tiyak sa tissue at uri, halimbawa, ang poliovirus ay nagpaparami lamang sa mga primate cell, kaya isang naaangkop na tissue culture ang ginagamit upang ihiwalay ang isang partikular na virus. Upang ihiwalay ang isang hindi kilalang pathogen, ipinapayong sabay-sabay na makahawa sa 3-4 na mga kultura ng cell, sa pag-aakalang ang isa sa mga ito ay maaaring sensitibo. Ang pagkakaroon ng virus sa mga nahawaang kultura ng cell ay tinutukoy ng pag-unlad ng tiyak na pagkabulok ng cell, i.e. cytopathogenic effect, pagtuklas ng mga intracellular inclusions, pati na rin sa batayan ng pagtuklas ng isang tiyak na antigen sa pamamagitan ng immunofluorescence, positibong hemadsorption at hemagglutination reaksyon.

Ang mga embryo ng ibon na may hindi gaanong pagkakaiba-iba ng mga tisyu ay angkop para sa paglilinang ng maraming mga virus. Makipag-chat lamang gumamit ng mga embryo ng manok. Kapag dumarami sa mga embryo, ang mga virus ay maaaring maging sanhi ng kanilang kamatayan (arboviruses), ang paglitaw ng mga pagbabago sa chorion-allantoic membrane (pox virus) o sa katawan ng embryo, ang akumulasyon ng mag glutinin sa mga embryonic fluid sa mga embryonic fluid (mga influenza virus , beke) at ang pandagdag ng nagbubuklod na viral antigen .

Ang pagkilala sa mga virus ay isinasagawa gamit ang mga immunological na pamamaraan: hemagglutination inhibition reaction, complement fixation, neutralization, gel precipitation, immunofluorescence.

Higit pa sa paksang Virological method:

1. Pagsusuri ng pangunahing anthropometric data sa pamamagitan ng parametric method (sigma method)
2. Conditional Extinction Treatment at Forced Training Method
3. 2. Comparative legal na pamamaraan - pribadong siyentipikong pamamaraan ng legal na agham
4. MGA MODERNONG PARAAN NG DIAGNOSIS AT ANG PAGPILI NG PARAAN NG PAGGAgamot ng SUBMUCOUS UTERINE MYOMA
5. 5.4. Ang konsepto at istraktura ng pangkalahatang pamamaraan ng pagsisiyasat bilang isang paraan ng praktikal na aktibidad
6. Paksa 8. MICROBIOLOGICAL METHODS PARA SA PAG-AARAL NG VARIABILITY AT MEKANISMO NG PAGLIPAT NG HEREDITARY INFORMATION. APPLICATION OF GENETIC METHODS UPANG MAKALIKHA NG MGA BAGONG DROGA
7. Paksa 15. PATHOGENICITY AT VIRULENCE NG MICROORGANISMS. VIRULENCE FACTORS. MGA PARAAN NG IMPEKSIYON NG MGA HAYOP SA LABORATORY. ANTIGENS, PARAAN NG KANILANG PAGKUKUHA. ANTIBODIYA. IMMUNE REACTIONS AT ANG KANILANG PRAKTIKAL NA PAGGAMIT. PHAGOCYTOSIS

Mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological- mga pamamaraan para sa pag-aaral ng biology ng mga virus at ang kanilang pagkakakilanlan. Sa virology, ang mga pamamaraan ng molecular biology ay malawakang ginagamit, sa tulong kung saan posible na maitatag ang molekular na istraktura ng mga particle ng viral, kung paano sila tumagos sa cell at ang mga tampok ng pagpaparami ng mga virus, ang pangunahing istraktura ng mga viral nucleic acid. at mga protina. Ang mga pamamaraan para sa pagtukoy ng pagkakasunud-sunod ng mga bumubuo ng mga elemento ng viral nucleic acid at protina amino acids ay binuo. Nagiging posible na maiugnay ang mga pag-andar ng mga nucleic acid at ang mga protina na naka-encode ng mga ito sa pagkakasunud-sunod ng nucleotide at upang maitaguyod ang mga sanhi ng mga proseso ng intracellular na gumaganap ng isang mahalagang papel sa pathogenesis ng isang impeksyon sa viral.

Ang mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological ay batay din sa mga proseso ng immunological (pakikipag-ugnayan ng antigen sa mga antibodies), mga biological na katangian ng virus (kakayahang mag-hemagglutinate, hemolysis, aktibidad ng enzymatic), mga tampok ng pakikipag-ugnayan ng virus sa host cell (ang likas na katangian ng cytopathic epekto, ang pagbuo ng intracellular inclusions, atbp.) .

Sa pagsusuri ng mga impeksyon sa viral, sa paglilinang, paghihiwalay at pagkakakilanlan ng mga virus, pati na rin sa paghahanda ng mga paghahanda ng bakuna, ang paraan ng tissue at cell culture ay malawakang ginagamit. Ginagamit ang pangunahin, pangalawa, matatag na tuluy-tuloy at diploid na mga kultura ng cell. Ang mga pangunahing kultura ay nakuha sa pamamagitan ng dispersing tissue na may proteolytic enzymes (trypsin, collagenase). Ang pinagmulan ng mga selula ay maaaring mga tisyu at organo (mas madalas na bato) ng mga embryo ng tao at hayop. Ang isang suspensyon ng mga cell sa isang nutrient medium ay inilalagay sa tinatawag na mattresses, bote o Petri dishes, kung saan, pagkatapos ng paglakip sa ibabaw ng sisidlan, ang mga cell ay nagsisimulang dumami. Para sa impeksyon sa virus, karaniwang ginagamit ang isang cell monolayer. Ang nutrient na likido ay pinatuyo, ang viral suspension ay ipinakilala sa ilang mga dilution, at pagkatapos makipag-ugnay sa mga cell, ang sariwang nutrient medium ay idinagdag, kadalasang walang suwero.

Ang mga cell mula sa karamihan sa mga pangunahing kultura ay maaaring i-subculture at tinutukoy bilang pangalawang kultura. Sa karagdagang pagpasa ng mga selula, isang populasyon ng mga selulang tulad ng fibroblast ay nabuo, na may kakayahang mabilis na pagpaparami, karamihan sa mga ito ay nagpapanatili ng orihinal na hanay ng mga kromosom. Ito ang mga tinatawag na diploid cells. Sa serial cultivation ng mga cell, ang matatag na tuluy-tuloy na mga kultura ng cell ay nakuha. Sa panahon ng mga sipi, lumilitaw ang mabilis na paghahati ng mga homogenous na selula na may heteroploid na hanay ng mga chromosome. Ang mga matatag na linya ng cell ay maaaring monolayer at suspensyon. Ang mga kultura ng monolayer ay lumalaki sa anyo ng isang tuluy-tuloy na layer sa ibabaw ng salamin, ang mga kultura ng suspensyon ay lumalaki sa anyo ng mga suspensyon sa iba't ibang mga sisidlan gamit ang mga agitator. Mayroong higit sa 400 mga linya ng cell na nagmula sa 40 iba't ibang uri ng hayop (kabilang ang mga primata, ibon, reptilya, amphibian, isda, insekto) at mga tao.

Ang mga piraso ng mga indibidwal na organo at tisyu (mga kultura ng organ) ay maaaring linangin sa artipisyal na nutrient media. Ang mga uri ng kulturang ito ay nagpapanatili ng istraktura ng tissue, na lalong mahalaga para sa paghihiwalay at pagpasa ng mga virus na hindi dumarami sa mga hindi nakikilalang tissue culture (halimbawa, mga coronavirus).

Sa mga nahawaang cell culture, ang mga virus ay maaaring matukoy sa pamamagitan ng pagbabago sa cell morphology, cytopathic action, na maaaring tiyak, ang hitsura ng mga inklusyon, sa pamamagitan ng pagtukoy ng mga viral antigens sa cell at sa culture fluid; pagpapasiya ng mga biological na katangian ng viral progeny sa culture fluid at titration ng mga virus sa tissue culture, chick embryo o sensitibong hayop; sa pamamagitan ng pagtuklas ng mga indibidwal na viral nucleic acid sa mga cell sa pamamagitan ng molecular hybridization o mga kumpol ng nucleic acid sa pamamagitan ng cytochemical method gamit ang fluorescent microscopy.

Ang paghihiwalay ng mga virus ay isang matrabaho at mahabang proseso. Isinasagawa ito upang matukoy ang uri o variant ng virus na umiikot sa populasyon (halimbawa, upang matukoy ang serovariant ng influenza virus, ligaw o bakuna na strain ng polio virus, atbp.); sa mga kaso kung saan kinakailangan na magsagawa ng mga kagyat na hakbang sa epidemiological; kapag lumitaw ang mga bagong uri o variant ng mga virus; kung kinakailangan, kumpirmahin ang paunang pagsusuri; para sa indikasyon ng mga virus sa mga bagay sa kapaligiran. Kapag naghihiwalay ng mga virus, ang posibilidad ng kanilang pagtitiyaga sa katawan ng tao, pati na rin ang paglitaw ng magkahalong impeksiyon na dulot ng dalawa o higit pang mga virus, ay isinasaalang-alang. Ang isang genetically homogenous na populasyon ng isang virus na nakuha mula sa isang solong virion ay tinatawag na isang viral clone, at ang proseso ng pagkuha nito ay tinatawag na cloning.

Upang ihiwalay ang mga virus, impeksyon ng madaling kapitan ng mga hayop sa laboratoryo, ginagamit ang mga embryo ng manok, ngunit ang tissue culture ay kadalasang ginagamit. Ang pagkakaroon ng isang virus ay karaniwang tinutukoy ng tiyak na pagkabulok ng cell (cytopathic effect), ang pagbuo ng mga symplast at syncytia, ang pagtuklas ng mga intracellular inclusions, pati na rin ang isang tiyak na antigen na nakita gamit ang immunofluorescence, hemadsorption, hemagglutination (sa hemagglutinating virus), atbp. . Ang mga palatandaang ito ay makikita lamang pagkatapos ng 2-3 mga sipi ng virus.

Para sa paghihiwalay ng isang bilang ng mga virus, tulad ng mga virus ng trangkaso, ginagamit ang mga embryo ng manok, para sa paghihiwalay ng ilang mga virus ng Coxsackie at isang bilang ng mga arbovirus, ginagamit ang mga bagong panganak na daga. Ang pagkilala sa mga nakahiwalay na virus ay isinasagawa gamit ang mga serological test at iba pang mga pamamaraan.

Kapag nagtatrabaho sa mga virus, tinutukoy ang kanilang titer. Ang titration ng mga virus ay kadalasang isinasagawa sa tissue culture, na tinutukoy ang pinakamataas na pagbabanto ng fluid na naglalaman ng virus, kung saan nangyayari ang pagkabulok ng tissue, ang mga inklusyon at mga antigen na partikular sa virus ay nabuo. Ang paraan ng plake ay maaaring gamitin upang titrate ang isang bilang ng mga virus. Ang mga plaque, o mga negatibong kolonya ng mga virus, ay foci ng mga cell na nasira ng virus ng isang solong layer na tissue culture sa ilalim ng agar coating. Ang pagbilang ng kolonya ay nagbibigay-daan sa isang quantitative analysis ng nakakahawang aktibidad ng mga virus sa batayan na ang isang nakakahawang partikulo ng virus ay bumubuo ng isang plaka. Nakikilala ang mga plake sa pamamagitan ng paglamlam sa kultura ng mahahalagang tina, kadalasang neutral na pula; ang mga plake ay hindi sumisipsip sa pangulay at samakatuwid ay nakikita bilang mga light spot laban sa background ng mga stained live na cell. Ang titer ng virus ay ipinahayag bilang ang bilang ng mga yunit na bumubuo ng plaka sa 1 ml.

Ang paglilinis at konsentrasyon ng mga virus ay karaniwang isinasagawa sa pamamagitan ng differential ultracentrifugation na sinusundan ng centrifugation sa concentration o density gradients. Upang linisin ang mga virus, ginagamit ang mga immunological na pamamaraan, ion-exchange chromatography, immunosorbents, atbp.

Kasama sa pagsusuri sa laboratoryo ng mga impeksyon sa viral ang pagtuklas ng pathogen o mga bahagi nito sa klinikal na materyal; paghihiwalay ng virus mula sa materyal na ito; serodiagnosis. Ang pagpili ng pamamaraan ng diagnostic ng laboratoryo sa bawat indibidwal na kaso ay depende sa likas na katangian ng sakit, ang panahon ng sakit at ang mga kakayahan ng laboratoryo. Ang mga modernong diagnostic ng mga impeksyon sa viral ay batay sa mga express na pamamaraan na nagbibigay-daan sa pagkuha ng tugon ng ilang oras pagkatapos kumuha ng klinikal na materyal sa mga unang yugto pagkatapos ng sakit. Kabilang dito ang electron at immune electron microscopy, pati na rin ang immunofluorescence, ang paraan ng molecular hybridization, ang pagtuklas ng mga antibodies ng klase ng lgM, atbp.

Ang electron microscopy ng mga negatibong batik na mga virus ay nagbibigay-daan sa pagkita ng kaibahan ng mga virus at pagtukoy ng kanilang konsentrasyon. Ang paggamit ng electron microscopy sa diagnosis ng mga impeksyon sa viral ay limitado sa mga kaso kung saan ang konsentrasyon ng mga viral particle sa klinikal na materyal ay sapat na mataas (10 5 sa 1 ml at mas mataas). Ang kawalan ng pamamaraan ay ang kawalan ng kakayahang makilala sa pagitan ng mga virus na kabilang sa parehong pangkat ng taxonomic. Ang kawalan na ito ay inalis sa pamamagitan ng paggamit ng immune electron microscopy. Ang pamamaraan ay batay sa pagbuo ng mga immune complex kapag ang tiyak na suwero ay idinagdag sa mga particle ng viral, habang ang sabay-sabay na konsentrasyon ng mga particle ng viral ay nangyayari, na ginagawang posible na makilala ang mga ito. Ang pamamaraan ay ginagamit din upang makita ang mga antibodies. Para sa layunin ng mga express diagnostic, ang isang electron microscopic na pagsusuri ng mga extract ng tissue, feces, likido mula sa mga vesicle, at mga lihim mula sa nasopharynx ay isinasagawa. Ang electron microscopy ay malawakang ginagamit upang pag-aralan ang morphogenesis ng virus; ang mga kakayahan nito ay pinalawak sa paggamit ng mga may label na antibodies.

Ang paraan ng molecular hybridization, batay sa pagtuklas ng mga nucleic acid na partikular sa virus, ay ginagawang posible na makita ang mga solong kopya ng mga gene at walang katumbas sa mga tuntunin ng sensitivity. Ang reaksyon ay batay sa hybridization ng mga pantulong na strands ng DNA o RNA (probes) at ang pagbuo ng mga double-stranded na istruktura. Ang pinakamurang probe ay cloned recombinant DNA. Ang probe ay may label na radioactive precursors (karaniwan ay radioactive phosphorus). Ang paggamit ng mga reaksyong colorimetric ay maaasahan. Mayroong ilang mga variant ng molecular hybridization: point hybridization, blot hybridization, sandwich hybridization, in situ hybridization, atbp.

Ang mga antibodies ng klase ng lgM ay lumalabas nang mas maaga kaysa sa mga antibodies ng klase G (sa ika-3-5 araw ng pagkakasakit) at nawawala pagkatapos ng ilang linggo, kaya ang kanilang pagtuklas ay nagpapahiwatig ng isang kamakailang impeksiyon. Ang mga antibodies ng klase ng IgM ay nakita ng immunofluorescence o enzyme immunoassay gamit ang anti-m antisera (anti-IgM heavy chain sera).

Ang mga pamamaraan ng serological sa virology ay batay sa mga klasikal na reaksyon ng immunological (tingnan. Mga pamamaraan ng immunological na pananaliksik ): complement fixation reactions, hemagglutination inhibition, biological neutralization, immunodiffusion, indirect hemagglutination, radial hemolysis, immunofluorescence, enzyme immunoassay, radioimmunoassay. Ang mga micromethod para sa maraming mga reaksyon ay binuo, at ang kanilang mga diskarte ay patuloy na pinagbubuti. Ang mga pamamaraan na ito ay ginagamit upang makilala ang mga virus gamit ang isang hanay ng kilalang sera at para sa serodiagnosis upang matukoy ang pagtaas ng mga antibodies sa pangalawang serum kumpara sa una (ang unang serum ay kinuha sa mga unang araw pagkatapos ng sakit, ang pangalawa - pagkatapos 2-3 linggo). Ang halaga ng diagnostic ay hindi bababa sa apat na beses na pagtaas ng mga antibodies sa pangalawang serum. Kung ang pagtuklas ng mga antibodies ng klase ng lgM ay nagpapahiwatig ng isang kamakailang impeksyon, kung gayon ang mga antibodies ng klase ng lgC ay nagpapatuloy ng ilang taon, at kung minsan ay habang-buhay.

Upang matukoy ang mga indibidwal na antigen ng mga virus at antibodies sa kanila sa mga kumplikadong paghahalo nang walang paunang paglilinis ng protina, ginagamit ang immunoblotting. Pinagsasama ng pamamaraan ang fractionation ng protina gamit ang polyacrylamide gel electrophoresis na may kasunod na immunoassay ng mga protina sa pamamagitan ng enzyme immunoassay. Ang paghihiwalay ng mga protina ay binabawasan ang mga kinakailangan para sa kemikal na kadalisayan ng antigen at ginagawang posible na makilala ang mga indibidwal na pares ng antigen-antibody. Ang gawaing ito ay may kaugnayan, halimbawa, sa serodiagnosis ng impeksyon sa HIV, kung saan ang maling-positibong enzyme immunoassay reaksyon ay dahil sa pagkakaroon ng mga antibodies sa mga antigen ng cell, na naroroon bilang isang resulta ng hindi sapat na paglilinis ng mga viral protein. Ang pagkakakilanlan ng mga antibodies sa sera ng mga pasyente sa panloob at panlabas na mga antigen ng viral ay ginagawang posible upang matukoy ang yugto ng sakit, at sa pagsusuri ng mga populasyon - ang pagkakaiba-iba ng mga protina ng viral. Ang immunoblotting sa HIV infection ay ginagamit bilang confirmatory test para makita ang mga indibidwal na viral antigens at antibodies sa kanila. Kapag sinusuri ang mga populasyon, ang pamamaraan ay ginagamit upang matukoy ang pagkakaiba-iba ng mga viral protein. Ang malaking halaga ng pamamaraan ay namamalagi sa posibilidad ng pag-aaral ng mga antigens na synthesize gamit ang recombinant DNA technology, na nagtatatag ng kanilang laki at ang pagkakaroon ng mga antigenic determinants.

Bibliograpiya: Bukrinskaya A.G. Virology, M., 1986; Virology, Methods, ed. B. Meikhi, trans. mula sa English, M., 1988; Handbook ng microbiological at virological research method, ed. M.O. Birger, M., 1982.