Če skupaj pri. IF analiza krvi. ELISA za sifilis: tehnika analize, interpretacija, vzroki lažno pozitivnih rezultatov

Samoilikov Pavel Vladimirovič pripravnik Oddelka za klinično laboratorijsko diagnostiko

Ruska državna medicinska univerza

Imunske metode so široko vključene v zdravniška praksa. Na vseh področjih sodobna medicina rabljeno imunski test, predvsem za diagnostične in analitične namene. Posebej pomembno je, da omogočajo identifikacijo bioloških komponent (hormonov, encimov, nevropeptidov, produktov imunskega sistema, antigenov itd.) pri nizkih in zelo nizkih koncentracijah. S temi metodami se odkrijejo vsi produkti, proti katerim je mogoče pridobiti protitelesa.

Imunska analiza temelji na interakciji antigena (AG) in protitelesa (AT) z uporabo različnih možnosti označevanja ene od komponent (encim, radionuklid, fluorescentno barvilo in drugo). Vrednotenje reakcije poteka samodejno na posebni opremi, kar omogoča standardizacijo teh metod.

Glede na vrsto uporabljene oznake in pogoje za postavitev testa imenujemo imunski test encimski imunski test (ELISA), radioimunski test (RIA), imunofluorescentni in drugi. Če so reakcije uprizorjene v eni ali več stopnjah, so označene kot neposredne ali posredne. Pomemben je medij, v katerem poteka reakcija. Če se reakcija izvaja z reagenti, pritrjenimi na površini, je test označen kot test trdne faze, na primer ELISA (encimski imunosorbentni test).

V tem prispevku bo obravnavan le encimski imunski test - metoda, ki se pogosto uporablja v biologiji in medicini, tako praktična kot temeljna.

ELISA se je pojavila sredi 60-ih in je bila prvotno razvita kot metoda za identifikacijo antigena v histološki pripravek, kot tudi za vizualizacijo precipitacijskih linij pri testu imunodifuzije in imunoelektroforeze, nato pa se je začela uporabljati za kvantitativno določanje antigenov in protiteles pri biološke tekočine. Pri razvoju metode sta sodelovala E. Engvall in R. Pelman ter neodvisno od njiju W. Van Veeman in R. Schurs.

Slika 1. Osnovni princip ELISA.

1) Za odkrivanje antigenov. 2) Za odkrivanje protiteles.

Metoda temelji na specifični vezavi protitelesa na antigen, medtem ko je ena od komponent konjugirana z encimom; kot posledica reakcije z ustreznim kromogenim substratom nastane obarvan produkt, katerega količina se lahko določeno spektrofotometrično (slika 1).

Odkritje možnosti imobilizacije antigenov in protiteles na različne nosilce ob ohranjanju njihove vezavne aktivnosti je omogočilo razširitev uporabe ELISA na različnih področjih biologije in medicine.

Pojav monoklonskih protiteles je služil kot nadaljnji razvoj ELISA, kar je omogočilo povečanje njegove občutljivosti, specifičnosti in ponovljivosti rezultatov.

Teoretično ELISA temelji na podatkih sodobne imunokemije in kemijske encimologije, poznavanju fizikalno-kemijskih zakonitosti reakcije antigen-protitelo, pa tudi na glavnih načelih analitske kemije. Občutljivost ELISA in njegovo trajanje določa več glavnih dejavnikov: kinetične in termodinamične značilnosti reakcije antigen-protitelo, razmerje reagentov, aktivnost encimov in ločljivost njegovih metod odkrivanja. AT splošni pogled Reakcijo antigen-protitelo lahko opišemo na preprost način:

+[AG]↔[ATAG]

Različni predmeti raziskovanja od spojin z nizko molekulsko maso do virusov in bakterij ter nenavadno širok spekter nalog, povezanih z različnimi pogoji za uporabo ELISA, določajo razvoj izjemno veliko število različice te metode.

Vsaka različica ELISA vsebuje 3 obvezne stopnje:

1. stopnja prepoznave testne spojine s protitelesom, specifičnim zanjo, kar povzroči nastanek imunskega kompleksa;

2. stopnja nastajanja povezave konjugata z imunskim kompleksom ali prostimi veznimi mesti;

3. stopnja pretvorbe encimske oznake v registriran signal.

Razvrstitev metod ELISA temelji na več pristopih:

1. Glede na vrsto reagentov, prisotnih na prvi stopnji ELISA, ločimo kompetitivne in nekompetitivne metode.

A) Pri kompetitivni ELISA na prvi stopnji sistem vsebuje analizirano spojino in njen analog, označen z encimom in z njim tekmujeta za specifična vezavna mesta.

B) Za nekonkurenčne metode je značilna prisotnost v sistemu na prvi stopnji samo analizirane spojine in zanjo specifičnih vezavnih centrov.

2. Vse metode ELISA so razdeljene na homogene in heterogene.

Če se vse tri stopnje ELISA izvajajo v raztopini in med glavnimi stopnjami ni dodatnih stopenj ločevanja nastalih imunskih kompleksov od nereagiranih komponent, metoda spada v skupino homogenih.

Osnova homogenega testa ELISA, ki se običajno uporablja za določanje snovi z nizko molekulsko maso, je zaviranje aktivnosti encima v kombinaciji z antigenom ali protitelesom. Encimska aktivnost se obnovi kot posledica reakcije antigen-protitelo.

Ko se protitelo veže na antigen, ki vsebuje encimsko oznako, je aktivnost encima inhibirana za 95 % glede na substrat z visoko molekulsko maso, kar je posledica sterične izključitve substrata iz aktivnega centra encima. Ko se koncentracija antigena poveča, se veže več protiteles in ohrani se več prostih konjugatov antigen-encim, ki lahko hidrolizirajo substrat z visoko molekulsko maso. Analiza poteka zelo hitro, za eno določitev je potrebna 1 minuta. Občutljivost metode je precej visoka. Z njim lahko določite snov na ravni pikomolov.

Za heterogene metode je značilno, da se analiza izvaja v dvofaznem sistemu s sodelovanjem trdne faze - nosilca in obvezno stopnjo ločevanja imunskih kompleksov od nezreagiranih komponent (pranje), ki so v različne faze(nastali imunski kompleksi so v trdni fazi, neizreagirani kompleksi pa v raztopini). Heterogene metode, pri katerih tvorba imunskih kompleksov na prvi stopnji poteka na trdni fazi, se imenujejo metode trdne faze.

Metode so razvrščene kot homogeno-heterogene, če se 1. stopnja - tvorba specifičnih kompleksov pojavi v raztopini, nato pa se za ločevanje komponent uporabi trdna faza z imobiliziranim reagentom.

3. Po principu določanja preskusne snovi:

A) Neposredno določanje koncentracije snovi (antigena ali protitelesa) s številom vezavnih centrov, ki sodelujejo z njo. V tem primeru bo encimska oznaka v nastalem specifičnem kompleksu AG-AT. Koncentracija analita bo neposredno sorazmerna z registriranim signalom.

B) Določanje koncentracije snovi z razliko skupno število vezna mesta in preostala prosta vezna mesta. V tem primeru se bo koncentracija analita povečala, zabeleženi signal pa zmanjšal, zato v tem primeru obstaja obratna odvisnost od velikosti posnetega signala.

Encimi.

Encimske oznake imajo izjemno močan katalitični učinek, ena encimska molekula lahko reagira z velikim številom substratnih molekul. Tako lahko encim, ki je prisoten v zanemarljivih količinah, zaznamo in kvantificiramo s tvorbo produktov, reakcijo, ki jo katalizira. Druga prednost uporabe encimov kot označevalcev je posledica prisotnosti v molekuli številnih funkcionalnih skupin (sulfhidrilnih, karboksilnih, tirazinskih ostankov itd.), preko katerih se lahko kovalentno vežejo molekule liganda.

Encimski označevalci, uporabljeni v testu ELISA, morajo imeti naslednje lastnosti:

– visoka aktivnost in stabilnost encima v pogojih analize, med modifikacijo in v konjugatu s protitelesi ali drugimi proteini;

– prisotnost občutljivih substratov in enostavnost metode za določanje produktov ali substratov encimske reakcije;

– možnost prilagajanja substratnih sistemov nadaljnjemu utrjevanju;

- odsotnost encima in njegovih inhibitorjev v proučevani biološki tekočini.

ELISA lahko uporablja vsaj 15 različnih encimov. Največja uporaba, v skladu z zgornjimi zahtevami, našli hrenovo peroksidazo (HRP), alkalno fosfatazo (AP) in β-D-galaktozidazo (tabela 1). Vsi trije so stabilni in katalizirajo zelo občutljive reakcije. Poleg tega je mogoče produkte, dobljene kot rezultat reakcij, ki jih katalizirajo ti encimi, odvisno od uporabljenega substrata, zaznati ne samo s kolorimetričnimi metodami, ampak tudi fluorescenčne metode. Drugi encimi se uporabljajo veliko redkeje. To je razloženo z njihovo manjšo specifično aktivnostjo v primerjavi s HRP in AP.

Podlage.

Izbira substrata je odvisna predvsem od encima, ki se uporablja kot oznaka, saj je reakcija encim-substrat zelo specifična.

Osnovne zahteve za podlago:

– zagotavljanje visoke občutljivosti metode pri detekciji encima v konjugatu;

– tvorba dobro definiranih (na primer obarvanih) produktov reakcije encim-substrat;

– substrat mora biti varen, poceni, dostopen in udoben za uporabo.

Tabela 1.

V testu ELISA se najpogosteje uporabljajo encimi in njihovi substrati.

Pogosteje se uporabljajo kromogeni substrati, ki ob uničenju tvorijo barvno snov. Obetavna je uporaba visokoenergijskih substratov - fluorescentnih, kemiluminiscenčnih. Uporaba takih substratov teoretično omogoča povečanje občutljivosti ELISA za dva reda velikosti.

Antigeni in protitelesa.

AG in AT, uporabljena v testu ELISA, morata biti visoko prečiščena in zelo aktivna. Poleg tega mora imeti AG visoko antigenost, optimalno gostoto in število antigenskih determinant, tujek in homogenost. Mnogi sintetični in rekombinantni antigeni virusov in bakterij so se dobro izkazali pri uporabi v ELISA. To je znatno povečalo specifičnost in ponovljivost metode z zmanjšanjem navzkrižnih reakcij.

Eden najpomembnejših reagentov v testu ELISA so protitelesa. Občutljivost ELISA je odvisna od koncentracije, aktivnosti in specifičnosti uporabljenih protiteles. Uporabljena protitelesa so lahko poli- ali monoklinska, različnih razredov (IgG ali IgM) in podrazredov (IgGl, IgG2), antialotipska ali antiidiotipska. Pri nizki afiniteti za AT povzroči razpad kompleksa AG-AT do odstranitve vezanega AG iz sistema. Občutljivost in specifičnost metode povečamo z uporabo monoklonskih protiteles. V tem primeru postane mogoče zaznati nizke koncentracije AG (AT) v testnih vzorcih.

Tvorba konjugata

Konjugat je antigen ali protitelo, označeno z encimsko oznako. Tvorba konjugata je eden od pomembnih korakov v testu ELISA.

Pri tvorbi konjugata, kot npr najboljša metoda uvedbo encimske oznake, tako da obe komponenti konjugata ohranita svojo biološko aktivnost: encim - sposobnost interakcije s substratom in antigen ali protitelo - antigenost oziroma aktivnost vezave antigena. Prisotnost označenega, visoko prečiščenega antigena omogoča uporabo konkurenčnih metod. V tem primeru lahko aktivnost konjugata, ki ni vezan na imobilizirana protitelesa, izmerimo v končni fazi, s čimer se izognemo postopku pranja in naredimo analizo bolj priročno. Vendar pa so antigeni raznoliki po svojih fizikalno-kemijskih lastnostih in strukturi, kar pomeni, da jih ni mogoče razviti univerzalne metode da dobimo konjugat z antigenom. V tem primeru je pridobivanje konjugata antigen-encim poseben izziv. Priprava označenih protiteles za ELISA je metodično bolj dostopna.

Konjugacija encima z imunokemično aktivnimi proteini poteka z različnimi metodami: kemično zamreženjem, kovalentno vezavo encimske molekule na AG ali AT in tvorbo spojin preko nekovalentnih vezi, na primer, ko je povezava med encima in AG ali AT poteka imunološko, z interakcijo antigen-protitelo.

Najbolj razširjene kovalentne metode za pripravo konjugatov. Izbira vezavne reakcije je odvisna od vrste funkcionalnih skupin, ki so na voljo v teh proteinskih molekulah. Kot reagenti za vnos encima v molekule antigena in protiteles se uporabljajo glutaraldehid, natrijev perjodat itd.

Obstajajo enostopenjske in dvostopenjske metode za pridobivanje konjugatov z uporabo glutaraldehida. Lahko nastanejo konjugati različnih velikosti z zmanjšano encimsko aktivnostjo (15 - 60 % prostega encima). Nastali konjugat velike velikosti lahko sterično ovira določanje preskusne snovi. Konjugati z relativno nizko molekulsko maso so sestavljeni iz Fab fragmenta in ene encimske molekule.

Kot rezultat dvostopenjske sinteze, ki obsega postopno pripravo encima, najprej modificiranega z zamreževalnim sredstvom, njegovo izolacijo in nato njegovo kasnejšo interakcijo z antigenom (protitelesom), se molekule Nastane homogena sestava, ki vsebuje 1-2 encimski molekuli na molekulo imunoglobulina in ohranja visoko encimsko in imunološko aktivnost. Vendar je količina nastalih konjugatov majhna (za hrenovo peroksidazo je 5–10 %).

Metoda pridobivanja konjugatov imunoperoksidaze, ki temelji na oksidaciji ogljikohidratne komponente encima z natrijevim perjodatom (vezava peroksidaze na konjugat doseže 70-90% začetne količine encima), je našla največjo praktično uporabo.

Zanesljiv konjugat mora imeti naslednje lastnosti:

Visoka koncentracija protiteles in visoka afiniteta za antigen, tako da se lahko uporablja v visoki razredčitvi in tako zmanjša nespecifično vezavo;

Zadostna specifičnost v delovni vzreji;

Prevlada monomernih oblik nad polimernimi, ker polimerne oblike se ponavadi nespecifično oprimejo plastike, kar ima za posledico visoko stopnjo reakcije v ozadju;

Optimalno molsko razmerje med encimom in protitelesi (optimalno razmerje je približno 1:1);

Zadostna encimska aktivnost konjugata. To lastnost določajo predvsem pogoji konjugacije in razmerje med molekulami encima in protiteles v konjugatu.

trdna faza

Kot trdno fazo za ELISA lahko uporabimo različne materiale: polistiren, polivinilklorid, polipropilen in druge snovi. Trdna faza so lahko stene epruvete, plošče s 96 jamicami in druge plošče, kroglice, kroglice, pa tudi nitrocelulozne in druge membrane, ki aktivno absorbirajo beljakovine.

Imobilizacija antigena ali protiteles na trdni fazi je mogoča na tri načine:

– pasivna adsorpcija, ki temelji na močnih hidrofobnih interakcijah med proteini in sintetično površino;

– kovalentna vezava na trdno fazo;

– imunokemijsko itd. (nekovalentna in neadsorpcijska vezava).

Pasivna adsorpcija beljakovin se pogosto uporablja pri izvajanju ELISA na titracijskih ploščah na nitroceluloznih membranah. Pasivna adsorpcija sledi principu nasičenosti in je v korelaciji z molekulsko maso adsorbirane snovi. Adsorpcijska površina membran različnih vrst (nitroceluloza, najlon itd.) Je 100-1000-krat višja od površine plastike.

Polisaharidi in visoko glikozilirani proteini imajo pogosto nizko afiniteto za polistiren. Za njihovo imobilizacijo so potrebne druge metode, kot je kovalentna pritrditev z glutaraldehidom. Kovalentna vezava je učinkovita, če se kot trdna faza uporabljajo hidrofilne kroglice (agaroza) in polistirenske kroglice.

Imunokemične metode temeljijo na uporabi predhodno adsorbiranih "pasti" protiteles za imobilizacijo antigena ali protiteles. Imunokemično imobiliziran antigen je 10-krat bolj aktiven od pasivno adsorbiranega antigena. Lahko se uporabljajo lektini ali proteini bakterij, ki vežejo imunoglobuline, ki se zlahka adsorbirajo na plastičnih ali drugih hidrofobnih površinah, kot je konkanavalin A (Con A) ali stafilokokni protein A. Con A lahko imobilizira protein gp 120 virusa HIV.

Prosta mesta na površini trdne faze, ki se niso vezala na sorbirano sredstvo, lahko med testom pritrdijo druge molekule, vključno s konjugati, kar vodi do povečanja signala ozadja. Da preprečimo nespecifično vezavo po imobilizaciji na trdni fazi osnovnega materiala, obdelavo izvedemo s snovmi, ki so za test nevtralne. Najbolj priljubljeni blokatorji so goveji serumski albumin (BSA), kazein itd. Izbira blokirnika in pogoji za to stopnjo so odvisni od vrste trdne faze, občutljivosti sistema.

Trenutno se uporablja ogromno število različnih sort in modifikacij ELISA. Različne različice encimsko vezanega imunskega testa (ELISA) so postale razširjene.

ELISA v trdni fazi je bila predlagana leta 1971. Osnovna načela testa ELISA v trdni fazi, ne glede na modifikacijo, so naslednja:

1. Na 1. stopnji reakcije se antigeni ali protitelesa adsorbirajo na trdni fazi. V tem primeru se reagenti, ki niso vezani na trdno fazo, zlahka odstranijo z izpiranjem.

2. Testni vzorec se inkubira v senzibiliziranih vdolbinicah. Vdolbinice pozitivne kontrole vsebujejo standardne reagente. V tem primeru se na površini trdne faze tvorijo imunski kompleksi. Nevezane komponente odstranimo s pranjem.

3. Pri dodajanju konjugata protitelo-encim ali antigen-encim in njegovi vezavi na imobiliziran imunski kompleks ostane aktivno mesto encima na voljo za kasnejšo interakcijo s substratom. Inkubacija substrata v jamicah z imobiliziranim konjugatom povzroči razvoj barvne reakcije. To reakcijo lahko ustavite na želeni stopnji, resnost obarvanja lahko ocenite vizualno ali z optično gostoto.

Pomemben korak v kateri koli različici trdnofazne analize je postopek izpiranja nevezanih reagentov. Pomembno je ne le izpiranje komponent, ki so fiksirane na trdni fazi, temveč odstranitev reagentov iz celotne globine plasti. To so najbolj zamudne in delovno intenzivne faze analize. Vzorci se lahko sperejo samodejno s posebno napravo - podložko ali ročno, z večkanalno pipeto. Za izvedbo ELISA potrebujete:

– uporabljena polistirenska tableta ali druge trdne faze;

- raztopina za pranje;

– konjugat (encimsko označeni antigeni ali protitelesa);

– mešanica uporabljenih substratov;

- raztopina za zaustavitev (Stop reagent - raztopina za zaustavitev reakcije);

- vzorcev, uporabljenih za pozitivno in/ali negativno kontrolo;

– standardni antigen (za izdelavo umeritvene krivulje);

– eno- in večkanalne pipete;

– podložka (podložka);

– optično napravo za določanje optične gostote testne raztopine (ELISA čitalnik, čitalnik, ki zaporedno fotometrira vse vdolbinice);

- 5-100 µl preučevanega biološkega materiala.

Neposredna ELISA

1. Antigeni ali protitelesa (testni material) se adsorbirajo v vdolbinicah plošč. Zgoraj je bilo ugotovljeno, da se antigeni bistveno razlikujejo po svoji sposobnosti adsorpcije na različne vrste plastike, odvisno od tega, kateremu razredu snovi (beljakovine, ogljikovi hidrati ali lipoproteini) pripadajo. Pogosto so pri neposredni ELISA antigen, imobiliziran na trdni fazi, celice in drugi antigeni v delcih.

Nadzor. Kot kontrolo uporabimo vdolbinice z adsorbiranim vzorcem pozitivne kontrole, ki nujno vsebuje želeni antigen, in vzorec negativne kontrole, ki očitno ne vsebuje testnega antigena. V prisotnosti očiščenega standardnega antigena se izvede reakcija v več razredčitvah, tako da je mogoče sestaviti umeritveno krivuljo.

2. »Blokirajte prosta vezavna mesta, ki ostanejo na trdni fazi, s kazeinom BSA itd. (da preprečite nespecifično sorpcijo konjugata na trdni fazi).

3. Z encimi označena protitelesa ali antigeni (konjugat) se dodajo v jamice in inkubirajo. Do vezave konjugata na trdno fazo bo prišlo le, če sta obe komponenti sistema komplementarni. Po inkubaciji s konjugatom vdolbinice speremo in tako odstranimo nevezani del konjugata.

4. Substrat, specifičen za uporabljeni encim, se nato doda v jamice in inkubira. Ob dosegu optimalno raven obarvanje v jamicah pozitivne kontrole, se encimska reakcija ustavi.

5. Upoštevanje reakcije. Najprej se vizualno upoštevajo rezultati reakcije. Za natančnejši prikaz rezultatov intenzivnost obarvanja ovrednotimo na ELISA čitalniku z ustreznim svetlobnim filtrom. Glede na rezultate analize se izriše graf odvisnosti optične gostote od koncentracije (slika 2).

Slika 2. Neposredna ELISA.

a) za odkrivanje antigena; b) za odkrivanje protiteles.

Ta različica ELISA se običajno uporablja za odkrivanje specifičnih protiteles. Standardni antigen se adsorbira v vdolbinicah plošč in inkubira z vzorci seruma ali drugega biološkega materiala, pridobljenega od bolnika (cerebrospinalna tekočina, slina itd.). Specifična protitelesa, vezana na antigen na trdni fazi, se odkrijejo z antiglobulinskim konjugatom. Glede na namen analize se uporabljajo različni antiglobulinski reagenti, ki zaznavajo protitelesa vseh izotipov ali specifična za posamezne razrede in podrazrede imunoglobulinov. Glavna prednost metode je univerzalnost konjugata. Isti konjugat se lahko uporablja za odkrivanje človeških protiteles proti širokemu spektru antigenov v katerem koli vzorcu. Reakcija je metodično preprosta.

Glavne faze indirektnega testa ELISA za odkrivanje protiteles:

1. Antigen se adsorbira na trdni fazi, nato se spere z nevezanih komponent.

2. Blokirajte brezplačna zavezujoča mesta. Oprano.

3. Testni material dodamo v jamice, inkubiramo in nato speremo. Vzporedno se dajo vzorci s pozitivno in negativno kontrolo.

4. Dodajte antiglobulinski konjugat v delovni razredčini, inkubirajte, sperite nevezane komponente.

5. Substrat se vnese, inkubira. Ko dosežemo optimalno stopnjo obarvanja v vdolbinicah s pozitivno kontrolo, reakcijo ustavimo z dodajanjem stop raztopine.

6. Izmerite količino reakcijskega produkta na čitalniku ELISA (slika 3).

V optimalnih pogojih analize je metoda zelo specifična in občutljiva. Omogoča odkrivanje nanogramskih količin protiteles v serumih preiskovanih bolnikov. Za pridobitev zadovoljivih rezultatov je potrebna standardizacija reagentov in metodologij. Ta različica ELISA se lahko uporablja tudi za testiranje monoklonskih protiteles.

Antigeni, odkriti z to možnost ELISA mora imeti več epitopov, ki lahko vežejo protitelesa, ali imeti ponavljajoče se, prostorsko ločene epitope iste specifičnosti.

Pri izvajanju te različice ELISA se visoko specifična poli- ali monoklonska protitelesa, adsorbirana na trdni fazi, inkubirajo s testnim vzorcem. Po postopku izpiranja v vdolbinice dodamo z encimi označena protitelesa (konjugat) proti istemu antigenu, nato pa izvedemo vse ostale faze reakcije. Učinkovitost tvorbe specifičnega kompleksa na vsaki stopnji analize je odvisna od vezavne konstante reakcije antigen-protitelo.

Glavne faze analize:

1. Monoklonska protitelesa ali afinitetno prečiščena poliklonska protitelesa so imobilizirana na trdni fazi.

2. Testni vzorec se vnese v vdolbinice plošč, pozitivni kontrolni vzorec in negativni kontrolni vzorec se postavita vzporedno v različnih razredčitvah. Inkubirano in oprano.

3. V vdolbinice vnesemo z encimi označena monoklonska ali poliklonska protitelesa (konjugat). Po inkubaciji se izvede izpiranje.

4. Substrat se vnese, inkubira. Reakcija se prekine, ko je doseženo optimalno obarvanje v vdolbinicah pozitivne kontrole.

5. Obračunavanje rezultatov na čitalniku ELISA.

Glavna prednost metode je njena visoka občutljivost, ki presega zmožnosti drugih shem ELISA (slika 4).

Slika 3. Indirektni test ELISA za odkrivanje protiteles.

Ta možnost analize temelji na tekmovanju označenih (konjugiranih) in neoznačenih (testnih) protiteles za vezavo na antigen, adsorbiran na trdni fazi. Količina encima, vezanega na trdno fazo, se bo zmanjšala sorazmerno z vsebnostjo prostih protiteles v mešanici. Za določanje antigena se uporabi ista možnost, le da v tem primeru želeni antigen tekmuje z označenim, standardnim antigenom za vezavo na protitelesa, imobilizirana na površini trdne faze.

Konkurenčna metoda zahteva minimalno število operacij, nizko porabo reagentov in jo je mogoče enostavno avtomatizirati. Pri izvajanju konkurenčne ELISA za odkrivanje protiteles je bolje uporabiti označena monoklinska protitelesa, potem pride do konkurence konjugata s testnim vzorcem za en epitop antigena, adsorbiranega na trdni fazi. Ta različica ELISA se uporablja za določanje različnih spojin, kot so humani imunoglobulini, rakavo-embrionalni antigen, inzulin itd. Omogoča odkrivanje protiteles proti diagnostično pomembnim epitopom povzročiteljev okužb.

Glavne faze analize za odkrivanje antigena (slika 5):

1. Monoklonska protitelesa, specifična za antigen, ki ga je treba zaznati, so imobilizirana na trdni fazi.

2. Dodajte z encimom označen antigen in testni vzorec v znani koncentraciji v vdolbinice plošč. Izvedite inkubacijo in pranje. Vzporedno se pozitivne in negativne kontrole namestijo v sosednje vdolbinice. Za izdelavo kalibracije z uporabo standardnega neoznačenega antigena v različnih razredčinah.

3. Dodajte substrat, inkubirajte in ustavite reakcijo, ko se v vdolbinicah pozitivne kontrole razvije optimalno obarvanje.

4. Upoštevanje reakcije na čitalniku ELISA.

V tem primeru je količina antigena v testnem vzorcu obratno sorazmerna z encimsko aktivnostjo na trdni fazi.

Pri tej različici ELISA se antigen, prisoten v testnem vzorcu, veže na z encimi označena monoklonska protitelesa in zavira njihovo interakcijo s standardnim antigenom, imobiliziranim na trdni fazi. Prisotnost v vzorcu celo sledov antigena, specifičnega za konjugat, bo zavirala vezavo označenih protiteles na imobilizirani antigen. Stopnja inhibicije je neposredno sorazmerna z vsebnostjo antigena v raztopini. Za kvantitativno analizo se umeritvena krivulja zgradi z uporabo serijskih razredčin standardnega antigena. Glavne faze inhibitorne ELISA za odkrivanje antigena (slika 6).

1. Adsorbirajte standardni antigen v vdolbinice plošč. S titracijo izberite delovno razredčino označenih protiteles.

Slika 4. "Sendvič" - varianta ELISA.

2. Konjugat se predhodno inkubira pri delovni razredčitvi z razredčinami testnega vzorca, standardnega antigena in vzorcev pozitivne kontrole.

3. Mešanica se prenese v vdolbinice plošč. Za nadzor 100-odstotne vezave se v več vdolbinic dodajo samo označena protitelesa brez inhibitornega antigena. Plošče se inkubirajo in nato sperejo.

4. Dodajte substrat.

5. Zabeležite rezultate.

Koncentracija antigena, ki se določi v preskusnem vzorcu, je obratno sorazmerna z encimsko aktivnostjo na trdni fazi.

ELISA se lahko uporablja ne samo za določanje topnega antigena ali protitelesa, ampak tudi celic, ki proizvajajo različne beljakovine.

Leta 1983 je bila tehnologija ELISA prilagojena za odkrivanje limfoidnih celic, ki izločajo protitelesa ali antigene (npr. citokine) in vitro. Metoda se imenuje ELISPOT (encimski imunotest ali spot metoda). Glavno načelo metode:

1. Na površini polistirenske vdolbinice (z uporabo plošč celične kulture s 24 vdolbinicami) se adsorbirajo antigeni ali protitelesa, ki služijo kot "lovilni" reagenti.

2. Dodamo proučevane limfoidne celice, ki jih gojimo nekaj ur pri 37 °C, kar jim daje možnost, da zasedejo določeno mesto in opravljajo sekretorno funkcijo. Protitelesa ali antigene, ki jih izločajo takšne celice, ujamejo reagenti, adsorbirani na trdni fazi.

3. Celice se odstranijo s pralno raztopino z detergentom za lizo celic.

4. Mesta kopičenja sekretornih produktov prikažemo z dodajanjem protiteles, povezanih z encimom (antiglobulinski reagent).

5. Doda se mešanica substrata in agaroze (uporabljeni substrati se morajo raztopiti v agarozi in tvoriti netopne reakcijske produkte), na površini trdne faze se oblikujejo rjave ali modre lise (odvisno od uporabljenih encimov in substratov), ki razkrijejo področja, kjer so celice nahajali.

Nastale lise se preštejejo pod mikroskopom, to bo število celic, ki izločajo.

Nitrocelulozno membrano lahko uporabimo kot trdno fazo.V tem primeru obstaja vrsta prednosti: zaradi visoke adsorpcijske sposobnosti NCM je potrebna bistveno manjša količina antigena, ki se uporablja kot "lovilni" reagent, poleg tega v substrat ni treba vključiti agaroze.

S hkratnim določanjem števila izločajočih celic in skupne količine izločenega antigena ali protitelesa v vdolbinici, kar je možno ob uporabi drugega substrata, je možno določiti količino izločene snovi po posamezni celici.

Ta metoda je našla široko uporabo za oceno števila celic, ki izločajo antigen, ki ga ujamejo adsorbirana protitelesa, uporablja se za določanje števila celic, ki izločajo citokine (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-y, TNF-a).

Pri uporabi protiteles z visoko afiniteto je občutljivost posameznih različic testa ELISA zelo visoka in teoretično omogoča detekcijo posameznih molekul antigena, v praksi pa je občutljivost omejena s številnimi dejavniki: aktivnostjo encimov, intenziteto signala in metodami obračunavanja signala. . Sistemi za ojačanje signala omogočajo povečanje občutljivosti različnih variant ELISA. Razmislite o nekaterih od teh sistemov:

Na podlagi interakcije avidin-biotin.

Molekule biotinskega koencima (m.m. 244 Da) so konjugirane s protitelesi z uporabo biotinil-N-hidroksisukcimida. Majhno molekulo biotina je lažje pritrditi na imunoglobulin ali drug protein, ne da bi pri tem kršili njegove imunske ali encimske lastnosti. Encim se v tem primeru veže na glikoprotein Beljak avidin. Afiniteta vezave avidina na biotin je zelo visoka (disociacijska konstanta kompleksa je 10-15 mol), konjugat avidin-encim je trdno fiksiran na kompleks antigen-protitelo-biotin. Po dodajanju ustreznega substrata reakcijski produkt določimo spektrofotometrično ali z intenziteto luminiscence.

Ena molekula avidina je sestavljena iz štirih enakih podenot, je sposobna interakcije s štirimi molekulami biotina, kar omogoča, da se uporablja kot povezovalna molekula med dvema spojinama, ki vsebujeta biotin. V tem primeru je encim tudi biotiniliran, avidin pa deluje kot most, ki povezuje dve molekuli, ki vsebujeta ostanke biotina. Nastalemu kompleksu antigen-protitelo-biotin se doda prosti avidin, ki mu sledi biotinilirani encim. Posnemite reakcijo.

Protein avidin se lahko nespecifično sorbira na druge molekule, zato se vse pogosteje uporablja drug protein, ki veže biotin, streptavidin, ki ga najdemo v bakteriji Streptomyces avidinii. Streptavidin prav tako tvori močan kompleks z biotinom in je sestavljen iz štirih enakih podenot.

Uporaba kompleksa avidin-biotin omogoča znatno povečanje občutljivosti ELISA, saj se med sintezo konjugata na eno molekulo AT lahko veže več deset molekul biotina. Pridobivanje konjugatov (protiteles in encimov z biotinom) je precej enostavno in ga spremljajo minimalne spremembe njihove imunološke in encimske aktivnosti. Konjugate encimov z biotinom lahko uporabimo kot univerzalne reagente.

Uporaba kemiluminiscenčnih reakcij.

Za pridobitev signala v ELISA lahko uporabimo kemiluminiscenčne reakcije, hkrati pa povečamo občutljivost metode in skrajšamo čas analize. Hrenova peroksidaza se pogosto uporablja kot označevalec v testu ELISA, za odkrivanje pa je mogoče uporabiti tudi različne kemiluminiscenčne reakcije. Kemiluminiscenčne reakcije temeljijo na sposobnosti luminola, da sveti, ko je oksidiran z vodikovim peroksidom. Pri neposredni analizi encimska reakcija proizvaja vodikov peroksid in oksidira luminol; to reakcijo katalizira hrenova peroksidaza. Za izboljšanje signala se uporabljajo različne spojine, na primer luciferin, fenoli, v tem primeru se intenzivnost luminiscence poveča za 10-100-krat, v nekaterih primerih za 500-krat (izboljšana kemiluminiscenčna analiza). Luminescentni signal je zelo stabilen, njegova raven doseže maksimum v 30 s (za primerjavo: barvna reakcija z OPD kot indikatorjem se v celoti razvije šele v 30 min).

Pri posredni analizi z luminolom ali njegovimi derivati protitelo označimo. Takšna oznaka v svobodna država lahko oksidira z vodikovim peroksidom s sproščanjem svetlobe. Če je tvoril kompleks, izgubi sposobnost oksidacije.

Temelji na kaskadnih sistemih.

Za povečanje občutljivosti ELISA lahko uporabimo kaskadne encimske sisteme. V tem primeru prvi encim, vezan na protitelesa, povzroči redukcijski substrat za drugi encimski sistem. Drugi encimski sistem je lahko substratno-cikličen ali redoksicikličen. V tem primeru lahko fosfo-glukoizomeraza, aldolaza, alkalna fosfataza služijo kot encimske oznake. Končni produkt reakcije določimo vizualno ali spektrofotometrično.

Sistemi za pomnoževanje ELISA dosegajo visoko občutljivost. Takšni sistemi ELISA se uporabljajo za določanje ravni hormonov (ščitnice, progesterona itd.).

ELISA je našla široko uporabo na različnih področjih medicine in biologije zaradi relativne preprostosti in visoke občutljivosti metode. ELISA se uspešno uporablja za:

Masivna diagnostika nalezljivih bolezni (odkrivanje različnih specifičnih antigenov ali protiteles proti njim);

Odkrivanje in določanje ravni hormonov in zdravila v bioloških vzorcih;

Določanje izotipov (IgG, IgM in drugi) protiteles proti specifičnemu antigenu;

Odkrivanje imunskih kompleksov;

Odkrivanje tumorskih markerjev;

Določanje beljakovin v krvnem serumu (feritin, fibronektin itd.);

Določanje skupnih IgE in specifičnih IgE protiteles;

Presejanje mioklonskih protiteles;

Definicije citokinov v bioloških tekočinah.

Občutljivost metode

ELISA je nadomestila široko uporabljeno prej v klinična praksa metode aglutinacije, precipitacije in RIA. V primerjavi z zgornjimi metodami je ELISA manj naporna in manj zamudna, priročna za izvedbo veliko število podobne analize.

ELISA združuje edinstveno specifičnost imunskega testa z visoka občutljivost določitev encimske oznake. Določi se občutljivost metode (pod občutljivostjo je mišljena najmanjša zaznavna količina protiteles ali antigena). naslednje dejavnike: afiniteta protiteles, prednostna je uporaba monoklonskih protiteles; specifična aktivnost encima; intenzivnost signala; občutljivost signala. Različne različice ELISA se razlikujejo po svoji občutljivosti. Ločene različice testa ELISA v trdni fazi omogočajo odkrivanje posameznih molekul v vzorcu. Povprečna občutljivost ELISA je 10-9 - 10-12 mol.

Galaktionov V.G. Imunologija. Moskovska univerzitetna založba, 1998

Kiškun A.A. Imunološke študije in metode za diagnosticiranje nalezljivih bolezni v klinični praksi. Medicinska novinska agencija, 2009

Kondratieva I.A. Delavnica o imunologiji. Vadnica za univerze. Akademija, 2004

Lefkovits I., Pernis B. Imunološke raziskovalne metode. Mir, 1988

Roit A, Brostoff D, Meil D. Imunologija. Mir, 2000

Sokolov E.I. Klinična imunologija. Medicina, 1998

Frimel G. Imunološke metode. Medicina, 1987

Khaitov R. M. Imunologija. Medicina, 2000

Shigina Yu.V. Imunologija: Učbenik. Založba RIOR, 2007

Yarilin A.A. Osnove imunologije. Medicina, 1999

Od časa do časa zdravniki predpisujejo teste ELISA, ne vedo vsi, kaj je to. Dekodiranje ELISA ima naslednje - encimski imunski test. Takšen krvni test pomaga razumeti, kako se telo bori proti boleznim nalezljivega spektra in pokaže fazo bolezni. Encimski imunski test pomaga pri ocenjevanju zaščitne aktivnosti krvi, ugotavljanju imunske pomanjkljivosti pri patologijah, povezanih z okužbami, hormonske težave in tako naprej.

Krvni test ELISA deluje z materialom, vzetim iz vene. Poleg tega je vsebina na voljo za raziskovanje steklasto telo, tekočina iz hrbtenjača, brisi iz sečnice oz kanal materničnega vratu. Za encimski imunski test lahko ELISA pri nosečnicah vzame tekočino, ki obdaja plod.

V tem primeru lahko kri neposredno testiramo za ELISA z uporabo različnih tehnik. Obstaja naravnost posreden način, konkurenca in blokiranje. Ko je telo okuženo z nekim patogenom, ki se imenuje antigen, začne imunski sistem proizvajati specifična protitelesa, na primer za hepatitis. Ta protitelesa so namenjena "obravnavanju" tujih povzročiteljev. Kaj so protitelesa? To so posebne beljakovine, ki se lahko vežejo na antigene in tvorijo imunološko usmerjene komplekse, ki jih imenujemo antigen-protitelo. Za odkrivanje teh kompleksov je odgovorna diagnostika ELISA. Za odkrivanje antigena dobljenemu vzorcu krvi dodamo protitelesa ali pa izvedemo obratni postopek.

Pozitiven rezultat ELISA temelji na reakciji imunosti in encimov. Pod delovanjem prvega se povzročitelji okužbe in celični elementi vežejo, drugi pomaga vizualizirati rezultat prvega. Imunski odziv vključuje protitelo in antigenski ligament. Kot rezultat tega procesa nastane imunsko usmerjen kompleks. Vse celice imajo na svoji površini antigen. imunska celica sumljivega se zajame, antigen, ki je fiksiran na površini, pa opravi primerjavo z informacijami, ki se »naložijo« v spomin. Če obstaja ujemanje opisa, se celica vrne domov, če ne, pa pride do povezave, za ustvarjanje katere je odgovorno protitelo, ki se pritrdi na površino.

Encimska reakcija medtem omogoča pretvorbo snovi v nove. Material je izpostavljen encimu. V tem primeru encimsko razliko zagotavljajo različni substrati. Produkt, ki nastane pri tej reakciji, se pošlje na določanje količine patogena, katerega določitev temelji na gostoti barve raztopine.

Značilnosti metode

Encimski imunski test je predpisan, kadar je potrebno diagnosticirati alergije, bolezni, ki so virusnega izvora. Obstaja tudi test ELISA za sifilis in številne druge okužbe, katerih prenos poteka z nezaščitenim spolnim stikom. Takšna diagnostika postaja vse bolj priljubljena v primerjavi s PCR. Dejstvo je, da PCR vključuje delo z brisi. Za razliko od PCR je mogoče rezultate ELISA dobiti iz krvnih preiskav.

Poleg tega se lahko predpiše krvni test ELISA, kadar je treba ugotoviti prisotnost imunske pomanjkljivosti, diagnosticirati onkologijo, oceniti učinkovitost zdravljenja, določiti hormonsko raven in opraviti predoperativni pregled v kombinaciji.

Če primerjamo študije z ELISA, na primer, s PCR, lahko najdemo številne prednosti. Glavna je možnost popolna diagnoza tudi v najzgodnejših fazah razvoja. Poleg tega rezultati ELISA pomagajo pri določanju specifične stopnje bolezni, na kateri stopnji je njen razvoj.

Analiza ELISA v primerjavi s PCR ima večjo učinkovitost, poleg tega pa jo je mogoče vzeti med nosečnostjo za odkrivanje spolno prenosljivih bolezni. Vsakdo, ki je opravil ta test, lahko ugotovi koncentracijo TSH v krvnem serumu. To je zelo pomembno za preverjanje reakcije ščitnice, ali obstajajo motnje v njenem delovanju.

Dodatne prednosti pa je tudi polimeraza verižna reakcija, je hitrost študije in s tem hiter prejem rezultatov. Zdravniki cenijo točnost rezultatov. Če govorimo o spolno prenosljivih boleznih, potem raven doseže 98 odstotkov, kot velja za koncentracijo TSH.

Seveda pa ni brez pomanjkljivosti. Vendar v tem primeru govorimo o posrednih značilnostih testa. Zlasti govorimo o tem, da je nemogoče izključiti morebitne napake pri opredelitvi norm. Včasih lahko analiza, ki jo je opravilo popolnoma zdravo dekle, pokaže lažno pozitiven rezultat ali negativen v nasprotnem primeru. Vendar pa klasifikacija psiholoških raziskovalnih metod v večini primerov povezuje takšne pomanjkljivosti z nepravilno pripravo ali kršitvijo tehnike, s katero je bil material odvzet.

Značilnosti izvedbe

Z analizo ELISA se v večini primerov daruje kri. Pred darovanjem krvi je pomembno vzdrževati vsaj osem ur posta, izključiti uporabo številnih zdravil, ki vplivajo na rezultat analize. To so antihistaminiki in hormonski pripravki ki vplivajo na delovanje ščitnice. Poleg tega je treba vsaj en dan prej izključiti alkohol. Vsaj eno uro pred krvodajalstvom se prepričajte, da ne kadite. Izkrivljanje rezultata je možno tudi pri jemanju zdravil.

Preden nadaljujemo z dešifriranjem, je vredno omeniti, katere merilne metode se uporabljajo za tak test. Kot rezultat analize bodo navedena protitelesa ali Ig imunoglobulini. Z njimi so mišljene zelo specifične beljakovine, o katerih smo prej govorili. B-limfociti so odgovorni za njihovo proizvodnjo takoj, ko virusi, bakterije ali glive vstopijo v telo. Ločimo pet vrst imunoglobulinov, označenih z latinično abecedo.

Njihove razlike so povezane z različno molekularno obliko in maso. Imajo različne razpolovne dobe, na različne načine so vključeni ali ne sodelujejo v infekcijskih procesih. Različen je tudi časovni okvir, v katerem jih je mogoče odkriti od trenutka okužbe.

Če so imunoglobulini razvrščeni na osnovi molekulske mase, potem ima IgM največjo stopnjo. Značilnost te vrste imunoglobulinov je nezmožnost prehoda skozi placentno pregrado. Če se v analizi odkrije IgM pri novorojenčku, govorimo o prisotnosti okužbe pri plodu.

Velika večina človeške krvi vsebuje imunoglobuline IgG, najmanj IgE. Ko govorimo o delu v okviru infekcijskih procesov, je treba posebno pozornost nameniti možnostim A, M, G. IgE deluje kot marker alergijske reakcije. IgD najdemo samo v tkivih bezgavk in mandljev. To je pomembno z vidika ustvarjanja imunosti na lokalni ravni.

Poleg tega se v analizi določijo antigeni. Razumemo jih kot visokomolekularne snovi, ki so znane po svojem organskem izvoru. Zlasti govorimo o povzročiteljih nalezljivih in drugih bolezni spektra. Poleg tega mislimo tudi na snovi, ki signalizirajo različne celične spremembe, ki so neizogibne pri številnih boleznih. Naveden je tudi imunski kompleks, ki prikazuje kompleks antigen-protitelo, ki je vpleten v imunski proces.

Običajno je čas izdelave odvisen od specifičnega laboratorija, pri katerem ste se prijavili. Številni laboratoriji lahko zagotovijo rezultate v dnevu ali dveh, drugi potrebujejo teden dni. Zamude so lahko posledica potrebe po kopičenju določene količine seruma.

Vpliv na rezultate in interpretacijo

Kljub temu, da ELISA velja za enega najbolj natančne metode preverjanje, se napake še vedno pojavljajo. Postopek odvzema materiala, njegov nepravilni prevoz in shranjevanje materiala lahko vplivajo na pravilnost rezultatov. Jemanje zdravil, kot je navedeno zgoraj, prisotnost skritih bolezni. Presnovne motnje ali imunska pomanjkljivost vam tudi ne bodo omogočile, da bi dobili prave kazalnike. V obdobju življenja do enega leta novorojenčki morda tudi nimajo povsem pravilnih kazalcev. To je posledica dejstva, da so v telesu prisotna materina protitelesa.

Če govorimo o dekodiranju, se v analiznih obrazcih uporablja pozitiven ali negativen predznak, ki označuje rezultate izračuna za vsakega od razredov imunoglobulinov. Možne možnosti so naslednje.

Odsotnost odkritih IgG, IgA in IgM kaže na popolno okrevanje. Negativen rezultat za komponente, kot so IgM, IgA, IgG, je pomanjkanje imunosti na okužbo.

Kombinacija pozitivnega in negativnega rezultata IgG, IgA v kombinaciji s pozitivnim IgM kaže na prisotnost okužbe v telesu. akutna oblika. Pozitivni rezultat IgG v kombinaciji z negativnimi vrednostmi IgA in IgM ustreza obdobju po cepljenju ali pridobitvi imunosti kot posledice okužbe.

Kombinacija pozitivnega ali negativnega izvida IgG, IgA in negativnega izvida IgM kaže na prisotnost okužbe v kroničnem poteku. Pozitiven rezultat za tri komponente: IgG, IgM, IgA kaže na poslabšanje okužbe, ki je bila v kronična oblika puščanje. Poleg neposredne razjasnitve razredov protiteles zdravnik v okviru dekodiranja analize ELISA prejme informacije o njihovih kvantitativnih kazalnikih. Pomembno je poudariti, da mora biti za dekodiranje odgovoren lečeči zdravnik. Dejstvo je, da ga lahko kombinacija nekaterih komponent pripelje do ideje o napačnem rezultatu, kar bo vodilo do ponovne predaje. Samodešifriranje je v tem primeru neuporabno.

Laboratorijski testi pomagajo zdravnikom ne samo prepoznati bolezen, temveč tudi določiti sposobnost telesa, da se upre okužbam. Poleg tega nekateri omogočajo nastavitev stopnje patologije. Primer takšne študije je ELISA, ki se pogosto uporablja v diagnostiki.

Metoda ELISA - kaj je to?

Encimski imunski test (ELISA) je laboratorijska študija, katere namen je identificirati specifična protitelesa beljakovinske narave proti določenim antigenom v vzorcu krvi. Med številnimi protitelesi so najpomembnejši imunoglobulini, ki lahko obstajajo kot del imunokompleksov. V telesu se sintetizirajo kot posledica nevrohumoralnih reakcij imunskega sistema po vnosu patogena v telo.

Za vsako vrsto patogenih celic nastanejo lastna protitelesa – kot odgovor. Njihova podrobna diagnostika in analiza pomagata neposredno določiti vrsto patologije, ki je lahko prisotna v človeškem telesu, ne da bi se manifestirala. Encimski imunosorbentni test razkrije latentno, počasno patološki procesi, določa njihovo stopnjo.

Kaj pokaže analiza ELISA?

Ko smo se ukvarjali s tem, kaj pomeni izraz ELISA analiza, kaj je, je treba opozoriti na glavno diagnostično vrednost študije. S to metodo ugotavljamo prisotnost v vzorcu krvi antigenov povzročitelja in protiteles, ki so posledica aktivacije imunskega sistema. Med pomembnimi razredi protiteles je treba razlikovati IgA, IgM, IgG.

Če je potrebna diferencialna diagnoza, je predpisan encimski imunosorbentni test, postavljena je končna diagnoza. Zdravnikom pomaga prepoznati skrite patologije. Poleg tega se lahko za oceno ravni predpiše tudi ELISA imunski odziv po cepljenju dan prej. V večini primerov je analiza ELISA (kaj je, opisano zgoraj) predpisana, če sumite na naslednje vrste patologij:

hepatitis;
norice;
helminthiases;
rdečke;
otroška paraliza;
herpes;

Poleg tega se lahko ELISA za nekatere vrste imunoglobulinov izvaja tudi z:

revmatoidni artritis;
sepsa;
kronični gnojni otitis;
pljučnica;
meningitis;
vnetje sinusov;

Kako poteka encimski imunski test?

Encimski imunski test ELISA se izvaja s pregledom vzorca odvzete krvi. Majhna količina krvnega seruma in očiščenega antigena se namesti na površino vnaprej pripravljene posebne tablete. Če jih povežete, opazujte izvor reakcije pod mikroskopom. Antigen in protitelo iste vrste tvorita kompleks. Za diagnosticiranje njegovega nastanka se izvede dodatno barvanje. Na podlagi intenzivnosti nastalega obarvanja se sklepa o koncentraciji imunoglobulinov v vzorcu bolnikovega krvnega seruma.

Analiza ELISA (kaj je, že veste) je občutljiva tudi na majhno količino imunoglobulinov, ima visoko specifičnost. Posledično ga lahko zdravniki uporabljajo za natančno razlikovanje bolezni od podobnih klinična slika. Sam postopek analize ne traja dolgo, zato je rezultat študije mogoče izvedeti še isti dan. Če potrebujete nujno diagnozo, lahko dobite odgovor po 2-3 urah od trenutka odvzema krvi.

Krvni test ELISA - priprava

Metoda encimskega imunskega testa zahteva nekaj priprave bolnika pred izvedbo. Venska kri služi kot material za testiranje. Njena ograja se izvaja izključno zjutraj, na prazen želodec. Pred posegom se mora pacient izogibati čustvenim preobremenitvam, stresne situacije, izključite telesno aktivnost. Za pridobitev objektivnih rezultatov študije, preden opravite test ELISA za klamidijo in druge okužbe, morate:

Dan pred analizo je iz prehrane izključena mastna hrana, prekajeno meso in alkohol.
Pred študijo ne kadite.
Zadnji obrok mora biti na predvečer analize z intervalom najmanj 8 ur pred pričakovanim časom študije.

Encimski imunski test - odvzem materiala

Analiza ELISA vključuje vzorčenje venske krvi kot biomaterial za raziskave. Postopek se izvaja v laboratoriju. Vzorec krvi 5–10 ml se vzame iz kubitalne vene z brizgo za enkratno uporabo. Pogosto se uporabljajo posebne vakuumske epruvete, po priključitvi igle, na katero kri sama napolni posodo. Prejeti vzorec ustrezno označimo in pošljemo v nadaljnjo preiskavo. Pogosteje je rezultat študije znan naslednji dan.

Krvni test ELISA - prepis

Dekodiranje analize ELISA izvaja izključno specialist. To upošteva rezultate drugih študij, izvedenih dan prej. Treba je opozoriti, da ima ELISA dve modifikaciji - kvalitativno in kvantitativno oceno. Pozitiven rezultat kvalitativne ocene ELISA kaže na prisotnost protiteles proti določeni vrsti patogena v telesu. V prihodnosti je dodeljena kvantitativna ocena, katere namen je ugotoviti stopnjo bolezni, stopnjo. Z negativno analizo govorijo o odsotnosti patogenov v otrokovem telesu.

Analiza ELISA je negativna

Negativen rezultat testa ne kaže vedno na odsotnost patologije. Torej je test ELISA za sifilis lahko negativen v remisiji, ko je patogen v telesu po poteku terapije v nizki koncentraciji. Glede na to možnost zdravniki čez nekaj časa opravijo dodatno študijo. Poleg tega lahko negativen rezultat opazimo tudi po nedavni okužbi, ko telo še ni razvilo protiteles v diagnostični koncentraciji.

Krvni test ELISA pozitiven

S pozitivnim rezultatom analize se določi titer protiteles, njihov razred. V večini primerov se za diagnozo nalezljivih procesov določi koncentracija IgG in IgM. Nastajajo ob različnih časih.

Vsebina

Za oceno sposobnosti telesa za upor nalezljive bolezni ali se krvni test uporablja za določitev faze patologije. Metoda ELISA zavzema pomembno mesto med laboratorijskimi študijami, pomaga celovito preučiti aktivnost zaščitna funkcija kri, določitev imunske pomanjkljivosti pri nalezljivih boleznih, krvnih boleznih, hormonskih, avtoimunskih procesih.

Kaj je encimski imunski test

Ta metoda velja za laboratorijske raziskave, določa prisotnost zaščitnih krvnih faktorjev beljakovinske narave (protiteles) proti določenim patogenom (antigenom). Imunoencimska analiza krvi določa imunoglobuline, ki jih lahko zaznamo v obliki imunokompleksov. Pojavijo se, ko se pojavijo kompleksne nevrohumoralne reakcije. imunska zaščitačloveške, ki postanejo odziv na vnos tujih antigenov.

Proti vsaki vrsti patogena se v telesu proizvajajo specifična protitelesa. Nadalje pride do vezave patološkega mikroorganizma ali antigena, nastane kompleksna spojina "antigen-protitelo". Nato se nevtralizira, pride do encimske lize, reakcije fagocitoze in proces se konča z odvzemom iz telesa. Prisotnost specifičnih kompleksov, določenih z ELISA, kaže na vrsto patogena, škodljive snovi pri bolniku.

Razredi imunoglobulinov

Znanstveniki so odkrili in preučevali 5 vrst imunoglobulinov: IgE, IgD, IgG, IgM, IgA. Obstajajo še drugi razredi, vendar so še v fazi raziskovanja in njihova vloga še ni povsem pojasnjena. V praktični medicini so pomembni A, M, G. Informativnost, natančnost določanja temelji na časovnih intervalih, za katere se pojavijo, dosežejo maksimum in izginejo.

Indikacije za preiskavo krvi z ELISA

S pomočjo te analize je mogoče oceniti učinkovitost zdravljenja, opraviti celovito študijo pred presaditvenimi operacijami, določiti stanje imunske pomanjkljivosti in protitelesa proti več kot 600 vrstam alergenov. Krvni test z ELISA se uporablja kot dodatna metoda za odkrivanje rakavih celic. Analiza je predpisana, če je potrebno odkriti protitelesa proti mikrobom, ki povzročajo venerične patologije:

trihomonijaza;
sifilis;
toksoplazmoza;
mikoplazmoza;
ureaplazmoza.

Pri helmintski invaziji v analizi ELISA opazimo povečanje števila imunoglobulinov. Za potrditev prisotnosti bolnika se izvajajo raziskave:

virus Epstein-Barr;
herpetične okužbe;
citomegalovirus;
skupine virusnih hepatitisov.

Encimski imunski test ni edina možnost za določanje imunoglobulinov. Včasih je za to študijo izdelana ograja. cerebrospinalna tekočina, tkivo steklastega telesa, amnijska tekočina. Pri uporabi krvi jo odvzamemo iz kubitalne vene z injekcijsko iglo. Analizo je treba opraviti na prazen želodec, ni priporočljivo jemati pred ELISA medicinski pripravki kar lahko vpliva na rezultat. Pred darovanjem biomateriala se morate odreči alkoholu, kajenju, uživanju drog. Možnosti rezultatov testa:

Z negativnimi ocenami IgG imunoglobulini, IgM, IgA, zdravniki pravijo, da ni patologije oz začetni fazi. Enak rezultat (negativen) bo po popolnem okrevanju po dolgem obdobju.
Če je IgG pozitiven, IgM in IgA pa nista odkrita, to kaže na nastanek imunosti po cepljenju ali nalezljivi bolezni.
Z visokimi titri IgM in negativnimi IgA, IgG se diagnosticira akutna nalezljiva bolezen.
S pozitivnim indikatorjem IgG, IgM, IgA zdravniki govorijo o akutni fazi ponovitve obstoječe kronične bolezni.
Pri kronični okužbi, ki je v fazi umirjanja (remisije), analiza ELISA kaže negativne titre IgM, IgA in IgG pa bosta pozitivna.

Prednosti in slabosti ELISA analize

Glavna negativna točka te študije je možnost pridobitve lažno pozitivnih ali lažno negativnih rezultatov. Razlog za nezanesljivost je vnos zdravil, tehnične pomanjkljivosti laboratorija. Proces presnovnih motenj v telesu lahko ponaredi analizo. Glavne prednosti analize ELISA so:

natančnost, diagnostična specifičnost;
nizki stroški analize;
hitrost pridobivanja rezultatov;
možnost dinamičnega nadzora stopnje patologije, učinkovitosti zdravljenja;
enostavnost raziskovanja;
sposobnost opravljanja množičnih pregledov žarišč okužbe;
nebolečnost, varnost za bolnika;
uporaba v procesiranju informacijske tehnologije.

Video

Encimski imunosorbentni test je diagnostična metoda, ki se uporablja za odkrivanje helmintov pri otrocih in odraslih.

Indikacija za izvedbo

Zdravniki predpisujejo ELISA za invazijo v naslednjih primerih:

število levkocitov pri bolniku znatno presega normo v odsotnosti simptomov drugih patologij;
zaskrbljeni zaradi pogostih vrtoglavic ali glavobolov brez očitnega razloga;
pojavijo se alergijske reakcije;
premagati bolečine v mišicah, izgubo moči;
kašelj se dolgo časa ne pozdravi;
včasih je vročinsko stanje;
pri hišnih ljubljenčkih se odkrije prisotnost črvov;
epidemiološka situacija se poslabša v regiji stalnega prebivališča;
pacientov poklic je povezan z velikim tveganjem okužbe s črvi (izvaja se načrtovana diagnostika).

prebavne motnje s spremembo blata in njegove pogostosti;
bolečina v trebuhu;
kolike v jetrih;
slabost, ki se spremeni v bruhanje;
znaki poškodb osrednjega živčni sistem: nespečnost, povečana živčnost, ostri padci razpoloženja.

Vrste ELISA

Encimska reakcija omogoča preučevanje vrst helmintov, ki jih določijo laboratorijski pomočniki z vizualnim merjenjem podatkov o njih.

V laboratorijih se izvajajo različne vrste ELISA:

Kako jemati

Da bi bili rezultati študije čim bolj zanesljivi, je treba strogo upoštevati vse laboratorijske zahteve. Potrebno:

3 dni pred darovanjem krvi prenehajte jemati vsa zdravila, razen vitalnih;
prekinite fizioterapevtske postopke za 2 dni;
opustite alkohol in kavo za 1 dan;
ne bo izpostavljen dan prej telesna aktivnost in čustveni stres
večerjajte najkasneje 19-20 ur (zjutraj lahko popijete malo vode).

Dešifriranje

Možnost številka 1. IgM-, IgA+, IgG-: primarna bolezen (2 tedna po okužbi).

Možnost številka 2. IgM+, IgA+, IgG-: primarna bolezen (2,5-3 tedne od okužbe).

Možnost številka 3. IgM+, IgA+, IgG+: Primarna okužba (3-4 tedne po okužbi).

Možnost številka 4. IgM-, IgA+, IgG+: poslabšanje kronične bolezni(2 tedna od začetka poslabšanja).

Možnost številka 5. IgM-, IgA+/-, IgG+: kronična faza.

Možnost številka 6. IgM-, IgA-, IgG+: ozdravljena (pretekla) okužba, prisotnost imunosti.

Možnost številka 7. IgM-, IgA, IgG niso odkriti (ali zmanjšanje titra za 2-4 krat na koncu zdravljenja, za 5-8 krat po 1-1,5 mesecih po zdravljenju): okrevanje.

Možnost številka 8. IgM-, IgA-, IgG-: pomanjkanje imunosti na okužbo.

Prednosti in slabosti

Zelo redko je, da test daje lažno pozitivne ali lažno negativne rezultate. Vzroki za to pomanjkljivost so lahko tehnične napake. Takšni rezultati so možni pri revmatoidnem faktorju, pri presnovnih motnjah in drugih kronične bolezni, zaradi katerega nastajajo zaščitna protitelesa, pa tudi pri jemanju nekaterih zdravil, kot je insulin.

Metoda ELISA določa:

trakulje (svinjske trakulje);
okrogli črvi (okrogli črvi, pinworms, toksokara, strongiloiditis);
ploščati črvi (cestodi, metljaji, nematode);
trihinela;
okroglim črvom - 935 rubljev;
na toksoplazmo - 715-1000 rubljev.