Metoda hibridizacije in situ. Metoda fluorescentne in situ hibridizacije (FISH) u dijagnostici hromozomskih bolesti. Modul za obuku. Cell Biology
FISH - tehnika fluorescentne in situ hibridizacije razvijena je sredinom 1980-ih i koristi se za otkrivanje prisustva ili odsustva specifičnih sekvenci DNK na hromozomima, kao i alfa satelitske DNK locirane na centromeri hromozoma 6, CEP6(6p11. 1-q11. 1).
Ovo je napravilo značajnu razliku u dijagnostici. onkološke bolesti melanocitna geneza dogodila se u vezi s otkrićem tumorskih antigena. Na malignoj pozadini utvrđuje se mutacija u tri antigena: CDK2NA (9p21), CDK4 (12q14) i CMM1(1p). U tom smislu, mogućnost objektivnog diferencijalna dijagnoza, na osnovu utvrđivanja genetskih karakteristika melanocitnih tumora kože, od velikog je značaja u rana dijagnoza melanom i njegovi prekursori.U jezgru sa normalnim skupom proučavanih gena i hromozomom 6 uočena su dva gena RREB1, obojena crvenom bojom, dva MYB gena obojena žutom bojom, dva gena CCND1, istaknuta zeleno, i dva centromera hromozoma 6, označena plava. Fluorescentni testovi se koriste u dijagnostičke svrhe.
Evaluacija rezultata reakcije: broji se količina crvenih, žutih, zelenih i plavih signala u 30 jezgara svakog uzorka, identificiraju se četiri parametra razne opcije genetski poremećaji kod kojih je uzorak genetski konzistentan s melanomom. Na primjer, uzorak je konzistentan s melanomom ako je prosječan broj CCND1 gena po jezgru ≥2,5. Broj kopija drugih gena se procjenjuje po istom principu. Lijek se smatra FISH pozitivnim ako je ispunjen barem jedan od četiri uslova. Uzorci u kojima su sva četiri parametra ispod graničnih vrijednosti smatraju se FISH negativnim.
Određivanje specifičnih sekvenci DNK na hromozomima vrši se na rezovima biopsija ili hirurškog materijala. U praktičnoj implementaciji, FISH reakcija izgleda ovako: proučavani materijal, koji sadrži DNK u jezgri melanocita, obrađuje se kako bi se djelimično uništio njegov molekul kako bi se razbila dvolančana struktura i time olakšao pristup željenom području melanocita. gen. Uzorci se klasificiraju prema tome gdje su vezani za molekul DNK. Materijal za FISH reakciju u kliničku praksu Koriste se parafinski preseci tkiva, razmazi i otisci.
FISH reakcija vam omogućava da otkrijete promjene koje su se dogodile u molekuli DNK kao rezultat povećanja broja kopija gena, gubitka gena, promjena u broju kromosoma i kvalitativnih promjena - pomicanja genskih lokusa oba u istom hromozoma i između dva hromozoma.
Za obradu podataka dobivenih korištenjem FISH reakcije i proučavanje odnosa između broja kopija gena tri studijske grupe, koristi se Spearmanov koeficijent korelacije.
Melanom je karakteriziran povećanjem broja kopija u odnosu na nevus i displastični nevus.
Jednostavan nevus, u poređenju sa displastičnim nevusom, ima manje abnormalnosti u broju kopija (tj. normalniji broj kopija).
Konstruirati pravila odlučivanja koja omogućavaju predviđanje da li uzorak pripada određenoj klasi (diferencijalna dijagnostika jednostavnih i displastični nevusi), koristi se matematički aparat „drveta odlučivanja“. Ovaj pristup se dobro pokazao u praksi, a rezultati korištenja ove metode (za razliku od mnogih drugih metoda, kao što su neuronske mreže) mogu se jasno protumačiti za konstruiranje pravila odlučivanja za razlikovanje jednostavnih, displastičnih nevusa i melanoma. Početni podaci u svim slučajevima bili su brojevi kopija četiri gena.
Zadatak konstruiranja pravila odlučivanja za diferencijalnu dijagnozu podijeljen je u nekoliko faza. U prvoj fazi se razlikuju melanom i nevus, bez uzimanja u obzir vrste nevusa. U sljedećoj fazi, konstruira se pravilo odluke za razdvajanje jednostavnih i displastičnih nevusa. Konačno, u posljednjoj fazi, moguće je konstruirati "stablo odluke" za određivanje stepena displazije displastičnog nevusa.
Ova podjela zadatka razvrstavanja nevusa u podzadatke omogućava postizanje visoke tačnosti predviđanja u svakoj fazi. Ulazni podaci za konstruisanje „drveta odluka” su podaci o broju kopija četiri gena za pacijente sa dijagnozom melanoma i pacijente sa dijagnozom nemelanoma (pacijente sa razne vrste nevus - jednostavan i displastičan). Za svakog pacijenta postoje podaci o broju kopija gena za 30 ćelija.
Dakle, podjela problema predviđanja dijagnoze u nekoliko faza omogućava izgradnju visoke preciznosti odlučujuća pravila ne samo za razlikovanje melanoma i nevusa, već i za određivanje vrste nevusa i predviđanje stepena displazije za displastični nevus. Konstruirana „stabla odlučivanja“ vizualni su način predviđanja dijagnoze na osnovu informacija o broju kopija gena i mogu se lako koristiti u kliničkoj praksi za razlikovanje benignih, predmalignih i malignih melanocitnih neoplazmi kože. Predloženo dodatna metoda diferencijalna dijagnoza je posebno važna kod ekscizije džinovskih kongenitalnih pigmentiranih nevusa i displastičnih nevusa kod pacijenata djetinjstvo, od kada takvi pacijenti kontaktiraju medicinske ustanove primetio visok procenat dijagnostičke greške. Rezultati primjene opisane metode su visoko učinkoviti, preporučljivo je koristiti je u dijagnostici pigmentiranih tumora kože, posebno kod pacijenata sa FAMM sindromom.
Rak dojke ne treba potcenjivati. Može uticati na apsolutno sve – mlade i stare, žene i muškarce. Izuzetna složenost liječenja, visok mortalitet i rastuća dinamika morbiditeta razlog su povećane pažnje medicine ovom problemu.
Do danas ne postoji metoda liječenja koja 100% garantuje pozitivan ishod bolesti. Postojeće metode su radno intenzivni, skupi i mogu uzrokovati veliku kolateralnu štetu tijelu.
Ovo je jedna od onih bolesti za koje možemo reći da je najbolji tretman uklanjanje faktora rizika i pravovremena dijagnoza.
Predispozicija za rak dojke
Uprkos činjenici da je rak prvi put opisan još u 15. veku pre nove ere i da naučnici imaju ogromnu količinu informacija, još uvek nije dovoljno da se puni opis etiologija raka dojke.
Faktori nisu pronađeni sa dovoljno pouzdanosti spoljašnje okruženje koji utiču na pojavu ili razvoj raka. Odabrane studije, što ukazuje na određeni karcinogen, ne dobijaju puno priznanje od strane cijele medicinske zajednice. Međutim, postoji određena korelacija između raka dojke i sljedećeg:
Jedan od najvažnijih gore navedenih faktora je starost: tokom godina, vjerovatnoća razvoja raka dojke raste za redove veličine. Općenito, složenost pitanja etiologije raka dojke je posljedica njegove genetske prirode. Nepoznato je zašto iznenada dolazi do kvara i tkivo dojke počinje nekontrolirano da se dijeli, zahvaćajući susjedna tkiva i dovodeći do metastaza u cijelom tijelu.
Ali naučnici se slažu oko jedne stvari: savremeni život mnogo pogodnije za bolesti raka nego ranije.
Da, naznačeno je na velike doze elektromagnetno zračenje, loša ekologija, smanjen sadržaj kiseonika u gradovima, fizičke neaktivnosti, stresa itd. Nemoguće je ne uzeti u obzir značajno povećanu životnu dob, jer je rak bolest koja obično dolazi u odrasloj dobi.
Neophodni testovi
Mogućnost pozitivnog ishoda karcinoma direktno je povezana sa vremenom početka liječenja, pa bi odnos prema dijagnozi trebao biti najozbiljniji.
Potrebne su sljedeće dijagnostičke metode:
- mjesečno samoprovjera(palpacijski test);
- jednom kvartalno provjeriti kod ljekara;
- Ultrazvuk svakih šest mjeseci;
- MRI svake godine.
mamografija ( rendgenski pregled) se ne preporučuje mlađima od 30 godina, jer u mladosti izlaganje radijaciji je najbolje izbegavati. Ako sumnjate na rak dojke, morat ćete se podvrgnuti sljedećim pretragama:
Metoda istraživanja FISH
FISH studija (FISH analiza) je citogenetska metoda koja se koristi za proučavanje membranskog proteina HER2 (Human Estrogen Receptor2). Prilikom provođenja FISH studije koriste se DNK sonde označene fluorescentnom bojom. Ove sonde se ubacuju u željene DNK regione i mogu kvantifikovati stepen amplifikacije HER2. Budući da se studija provodi tokom vremena i da geni nastavljaju da se dijele, moguće je procijeniti omjer broja kopija HER2 gena i broja kopija regije koja se normalno dijeli. Ako je veći ili jednak 2, rezultat se smatra HER2 pozitivnim.
FISH analiza igra vitalnu ulogu u prognozi raka i izboru principa liječenja. Dakle, pojačanje ili povećana aktivnost Ovaj protein se nalazi u 30% slučajeva raka i zahtijeva posebne tretmane usmjerene na inhibiciju njegove funkcije. U normalnim uslovima, HER2 kontroliše rast, deobu i samopopravljanje ćelija. U slučaju raka, ovaj protein proizvodi previše membranskih receptora i upućuje ćelije da se nekontrolirano dijele. Ovako se ćelija pretvara u rak.
At pozitivan rezultat FISH test propisuje liječenje usmjereno na suzbijanje HER2. Glavni lijek danas je Herceptin. Ako se ovaj test ne izvrši ili se njegovi rezultati zanemare, izbor metode liječenja će biti netačan i rak će napredovati u terminalni stepen. Osim toga, takav rak je agresivniji u razvoju od HER2-negativnog karcinoma.
Imunohistohemijska analiza se radi zajedno sa FISH analizom. Ovo je takođe genska metoda za proučavanje HER2 proteina, ali u slučaju imunohistohemijske analize količina HER2 proteina se ne detektuje u ćeliji, već u specifičnom uzorku.
Razlikuje se od metode ribe po cijeni, ali rezultat daje manje informativne rezultate, koji zavise od istraživača, laboratorije i korištenih kriterija. Količina HER2 proteina određena je bojom uzorka za testiranje i boduje se na skali od nula do tri. Zajedno, ove dvije metode su zlatni standard za proučavanje pacijentovog HER2 statusa.
Dakle, uprkos svom imidžu, rak dojke je prilično izlječiv uspješno liječenje. Onkolozi u svom arsenalu imaju sva napredna dostignuća medicine. Sva ova sredstva sasvim su dostupna i najobičnijem građaninu.
Glavna stvar u uspješnom ishodu bolesti je pravovremeno testiranje na rak dojke, odabir prave metode liječenja i početak ranije. Ne očajavajte ako nema rezultata, jer i pozitivna emocionalna pozadina značajno utiče na tok bolesti.
Metoda bojenja FISH (fluorescentna in situ hibridizacija) razvijena je u Livermore National Laboratory (SAD) 1986. godine. nova metoda proučavanje hromozoma – metoda fluorescentne detekcije DNK in situ hibridizacijom sa specifičnim molekularnim sondama. Metoda se zasniva na sposobnosti hromozomske DNK da se veže, pod određenim uslovima, za DNK fragmente (DNK sonde), koji uključuju nukleotidne sekvence komplementarne hromozomskoj DNK. DNK sonde su prethodno označene posebnim supstancama (na primjer, biotin ili digoksigenin). Obilježene DNK sonde se primjenjuju na citogenetičke preparate metafaznih hromozoma pripremljenih za hibridizaciju. Nakon izvršene hibridizacije, preparati se tretiraju posebnim fluorescentnim bojama konjugiranim sa supstancama koje se mogu selektivno vezati za biotin ili digoksigenin. Svaki hromozom ima specifičnu boju. Hibridizacija se takođe može izvesti sa radioaktivno obeleženim sondama. Citogenetska analiza se provodi pod fluorescentnim mikroskopom pod ultraljubičastim svjetlom.
FISH metoda se koristi za otkrivanje malih delecija i translokacija. Hromozomske razmjene (translokacije i dicentrične) između različito obojenih kromosoma lako se definiraju kao višebojne strukture.
Kraj rada -
Ova tema pripada sekciji:
Modul za obuku. Cell Biology
Više stručno obrazovanje.. Baškir država medicinski univerzitet.. Ministarstvo zdravlja i socijalnog razvoja..
Ako trebaš dodatni materijal na ovu temu, ili niste pronašli ono što ste tražili, preporučujemo da koristite pretragu u našoj bazi radova:
Šta ćemo sa primljenim materijalom:
Ako vam je ovaj materijal bio koristan, možete ga spremiti na svoju stranicu na društvenim mrežama:
| Tweet |
Sve teme u ovoj sekciji:
Modul za obuku. Osnove opće i medicinske genetike
(metodološka uputstva za studente) Nastavna disciplina Biologija Za smjer pripreme Opća medicina Co.
Pravila za izvođenje laboratorijskih radova
Neophodan element mikroskopskog proučavanja objekta je njegovo skiciranje u albumu. Svrha skice je bolje razumjeti i konsolidirati u pamćenju strukturu objekta, oblik pojedinih struktura
Praktičan rad
1. Priprema privremenog preparata „ćelije filma od luka” Da biste pripremili privremeni preparat sa filmom od luka, uklonite
Struktura citoplazmatskih membrana. Transportna funkcija membrana
2. Obrazovni ciljevi: Poznavati: - strukturu univerzalne biološke membrane - obrasce pasivnog transporta tvari kroz membrane
Struktura eukariotskih ćelija. Citoplazma i njene komponente
2. Ciljevi učenja: Znati: - osobine organizacije eukariotskih ćelija - strukturu i funkciju citoplazmatskih organela
Organele uključene u sintezu supstanci
U svakoj ćeliji dolazi do sinteze za nju karakterističnih tvari, koje su ili građevinski materijali za novonastale strukture koje zamjenjuju dotrajale, ili enzimi uključeni u biokemijske reakcije.
Organele sa zaštitnim i probavnim funkcijama
Lizozomi Ove organele su poznate od 50-ih godina 20. veka, kada je belgijski biohemičar de Duve otkrio male granule koje sadrže hidrolitičke supstance u ćelijama jetre.
Organele uključene u opskrbu ćelije energijom
Velika većina ćelijskih funkcija uključuje potrošnju energije. Živa ćelija ga formira kao rezultat stalno nastalih redoks procesa koji čine
Organele uključene u diobu i kretanje stanica
To uključuje ćelijski centar i njegove derivate - cilije i flagele. Ćelijski centar Ćelijski centar se nalazi u životinjskim ćelijama iu nekima
Praktični rad br.1
1. Mikroskopska analiza trajnog preparata “Golgijev kompleks u ćelijama kičmenog ganglija” O preparatu nervne celije njima
Ribosomi
Identificirano korištenjem elektronska mikroskopija u ćelijama svih pro- i eukariotskih organizama, njihova veličina je 8-35 nm, uz vanjsku membranu endoplazmatskog retikuluma. Na ribosomima se provodi s
Granularni endoplazmatski retikulum
Razmotrite submikroskopsku strukturu grubog endoplazmatskog retikuluma na elektronskom mikrosnimku. Identificirana su tri područja acinarnih ćelija izgladnjele pankreasa bat. Prije
Citoplazmatske mikrotubule
Citoplazmatske cijevi se nalaze u stanicama svih životinjskih i biljnih organizama. To su cilindrične formacije nalik na niti dužine 20-30 mikrona, 1
Mitotička aktivnost u tkivima i ćelijama
Trenutno su proučavani mitotički ciklusi i način mitotičke aktivnosti mnogih životinjskih i biljnih tkiva. Pokazalo se da svako tkivo ima određeni nivo mitotičke aktivnosti. Oh m
Mitoza (indirektna podjela) u stanicama korijena luka
Koristeći mikroskop malog povećanja, pronađite zonu reprodukcije vrha luka, postavite u centar vidnog polja područje s jasno vidljivim ćelijama koje se aktivno dijele. Zatim postavite pripremu na veliku snagu
Amitoza (direktna podjela) u ćelijama jetre miša
Pregledajte ćelije jetre miša pri velikom povećanju pod mikroskopom. U preparatu ćelije imaju višestruki oblik. U ćelijama koje se ne dijele, jezgro je okruglo sa jezgrom. U ćelijama koje se dijele koje su počele
Synkaryon jajna ćelija okruglog crva
Koristeći mikroskop malog povećanja, pronađite dio materice okruglog crva ispunjen folikulima koji sadrže jaja. Pregledajte uzorak pri velikom povećanju. Citoplazma u jajima se skuplja i ljušti
Struktura i funkcije DNK i RNK. Struktura gena i regulacija ekspresije gena kod pro- i eukariota. Faze biosinteze proteina
2. Ciljevi učenja: Znati: - hemijski sastav i karakteristike organizacije nukleinskih kiselina; - razlike između DNK i RNK;
Obrasci nasljeđivanja osobina kod monohibridnog ukrštanja. Vrste interakcije alelnih gena
2. Obrazovni ciljevi: Poznavati: - obrasce monohibridnog ukrštanja; - I i II Mendelovi zakoni; - vrste interakcija
Zakon nezavisnog nasljeđivanja osobina. Vrste interakcija nealelnih gena
2. Obrazovni ciljevi: Poznavati: - obrasce di- i polihibridnog ukrštanja; - Mendelov III zakon; - vrste interakcija
Promjenljivost kao svojstvo živih bića, njegov oblik. Fenotipska (modifikujuća ili nenasledna) varijabilnost. Genotipska varijabilnost
2. Ciljevi učenja: Poznavati: - glavne oblike varijabilnosti; - steknu ideje o prodornosti i ekspresivnosti prepoznavanja
Samostalan rad učenika pod nadzorom nastavnika
Praktični rad Određivanje stepena varijabilnosti osobine i koeficijenta varijacije u zavisnosti od uslova sredine.
Analiza pedigrea
Nisu sve genetske metode primjenjive na analizu nasljeđivanja određenih osobina kod ljudi. Međutim, proučavanjem fenotipova nekoliko generacija srodnika moguće je utvrditi prirodu nasljeđivanja.
Dvostruka metoda za proučavanje ljudske genetike
Metoda blizanaca nam omogućava da procijenimo relativnu ulogu genetskih i okolišnih faktora u razvoju određene osobine ili bolesti. Blizanci mogu biti monozigotni (identični) ili dizigotni (isti
Dermatoglifska metoda za proučavanje ljudske genetike
Dermatoglifska analiza je proučavanje papilarnih uzoraka prstiju, dlanova i stopala. Ova područja kože imaju velike dermalne papile, a epidermis koji ih pokriva formira g
Citogenetska metoda u proučavanju ljudske genetike
Među mnogim metodama učenja nasljedna patologija Humana citogenetička metoda zauzima značajno mjesto. Citogenetskom metodom moguće je analizirati materijalnu osnovu nasljednosti
Proučavanje hromozomskog seta
Može se izvesti na dva načina: 1) direktna metoda - proučavanje metafaznih hromozoma u ćelijama koje se dele, npr. koštana srž(od
Praktičan rad
1. Razgledanje demonstracionog preparata “Human Karyotype” u citogenetskoj laboratoriji.Na X90 uvećanju vidljivi su leukociti u vidnom polju
Analiza kariotipa kod pacijenata sa hromozomskim bolestima (sa fotografija)
br. 1. trisomija na hromozomu 13 (Patau sindrom). Kariotip 47, +13. br. 2. trisomija na hromozomu 18 (Edwardsov sindrom). Kariotip 47, +18. br. 3. trisomija 21 (Daunova bolest).
Sprovođenje analize otiska prsta
Za izradu vlastitih otisaka prstiju potrebna vam je sljedeća oprema: fotografski valjak, staklo površine 20x20 cm2, komad pjenaste gume, tiskarska boja (ili slično
Citogenetska analiza kariotipa (na osnovu mikrofotografija metafaznih ploča)
1. Nacrtajte metafaznu ploču. 2. Izbrojite ukupan broj hromozoma. 3. Identifikujte hromozome grupe A (3 para velikih metacentričnih hromozoma), B (dva para velikih
Ekspresna metoda za proučavanje X-spolnog kromatina u jezgri epitela oralne sluznice
Prije uzimanja struganja, od pacijenta se traži da zubima ugrize sluzokožu obraza i unutrašnja površina Obrišite obraze krpom od gaze. Ova procedura je neophodna za uklanjanje uništenih ćelija, g
Statistička metoda stanovništva
Populacija je skup jedinki iste vrste, koje dugo vremena naseljavaju jednu teritoriju, relativno izolovane od drugih grupa jedinki ove vrste, koje se slobodno križaju i proizvode
Biohemijska metoda
Biohemijske metode se zasnivaju na proučavanju aktivnosti enzimskih sistema (bilo na osnovu aktivnosti samog enzima, ili na osnovu broja konačnih proizvoda reakcije koju ovaj enzim katalizira). Biohemije
Molekularno genetska metoda
Sve molekularne genetičke metode zasnivaju se na proučavanju strukture DNK. Faze DNK analize: 1. Izolacija DNK iz ćelija koje sadrže jezgre (krv
Lančana reakcija sinteze DNK polimerazom
Polimeraza lančana reakcija(PCR) je metoda amplifikacije (reprodukcije) DNK in vitro, uz pomoć koje u roku od nekoliko sati možete identificirati i reproducirati DNK fragment od interesa veličine od 80
Br. Puni naziv Genotip Ivanov AA Petrov Aa
Uočeni genotip i učestalost alela
Genotipovi, aleli Broj slučajeva Učestalost (u frakcijama) AA 1 / 5 = 0,2 Aa
Uočene i očekivane učestalosti genotipova i alela
Uočeni broj slučajeva Uočena učestalost Očekivana učestalost AA (p2)
Uočeni genotip i učestalost alela
Ne. Sposobnost umotavanja jezika u cijev Genotipovi Mogu (da) A_
Tradicionalna citogenetika kada se proučava kariotip, on je uvijek bio ograničen na nivo rezolucije pojasa. Čak i kada smo koristili metode visoke rezolucije za diferencijalno bojenje hromozoma, samo smo detektirali više traka na hromozomu, ali nismo bili sigurni da dolazimo do molekularne razine rezolucije. Nedavni napredak u DNK tehnologiji i citogenetici omogućio je korištenje FISH metoda za analizu promjena u hromozomskoj DNK na molekularnom nivou. Molekularna citogenetika omogućila je revolucionarni proboj u citogenetici, omogućavajući:
Analizirati strukturu DNK hromozoma u rasponu od 10-100 kilobaza;
dijagnosticiraju ćelije interfaze koje se ne dijele, što je imalo ogroman utjecaj na prenatalnu dijagnozu i preimplantacijsku genetsku dijagnozu (PGD).
FISH tehnologija koristi DNK sondu koja veže ili žari specifične sekvence DNK unutar hromozoma. Denaturirana sonda se inkubira sa nativnom DNK ćelije, također denaturiranom u jednolančano stanje. Sonda zamjenjuje biotin deoksiuridin trifosfat ili digoksigenin uridin trifosfat timidinom. Nakon renaturacije nativne DNK sondom, kompleks probe-DNK može se otkriti dodatkom fluorohrom-obilježenog biotin-vezujućeg avidina ili fluorohrom-obilježenog anti-digoksigenina. Dodatno poboljšanje signala može se postići dodavanjem antiavidina i proučavanjem nastalog kompleksa pomoću fluorescentne mikroskopije. Označavanjem različitih DNK sondi s nekoliko različitih fluorohroma, moguće je istovremeno vizualizirati više hromozoma ili kromosomskih segmenata unutar jedne ćelije kao višebojne signale.
Mogućnost definicije specifične genske segmente, prisutni ili odsutni na hromozomima, omogućili su dijagnosticiranje sindroma sekvence gena na nivou DNK, kao i translokacije u interfaznim jezgrama, često u pojedinačnim ćelijama.
Materijal za RIBA može poslužiti ili metafazni hromozomi jezgre dobijene iz ćelija koje se dele, ili interfazne jezgre iz ćelija koje nisu u fazi deobe. Sekcije su prethodno tretirane RNazom i proteinazom kako bi se uklonila RNK koja se može unakrsno hibridizirati sa sondom i hromatinom. Zatim se zagrijavaju u foramidu da denaturiraju DNK i fiksiraju ledeno hladnim alkoholom. Sonda se zatim priprema za hibridizaciju zagrijavanjem. Sonda i preparat hromozoma su zatim pomešani i zapečaćeni pokrovnim staklom na 37°C radi hibridizacije. Promjenom temperature inkubacije ili sastava soli otopine za hibridizaciju, može se povećati specifičnost vezivanja i smanjiti pozadinsko obilježavanje.
Primjena fluorescentne in situ hibridizacije - FISH tehnologija
Efikasnost FISH tehnologije je prvi put pokazano lokalizacijom gena na . Sa uvođenjem fluorescentnog označavanja, in situ hibridizacija se pokazala neophodnom za dijagnosticiranje hromozomskih abnormalnosti koje se ne mogu otkriti tradicionalne metode banding. FISH je također odigrao ključnu ulogu u postizanju jednog od najvećih neobična otkrića moderna genetika - genomski otisak.
Njegova tehnologija razvoja RIBA primljena u tri oblika. Centromere, ili alfa satelitske, sonde karakterizira relativna kromosomska specifičnost i najčešće se koriste u genetici interfaznih stanica. Ove sonde stvaraju donekle difuzne signale adekvatne jačine u regionu centromera, ali se ne hibridizuju sa hromozomima koji imaju slične sekvence centromera. Trenutno su razvijene sonde sa jednom kopijom koje daju diskretni signal iz specifične hromozomske trake i izbegavaju fenomen unakrsne hibridizacije. Ove sonde se takođe mogu koristiti za određivanje broja kopija i specifičnih regiona hromozoma za koje se sumnja da su povezani sa određenim sindromom. Za prenatalnu dijagnozu koriste se sonde sa jednom kopijom i centromere dizajnirane za hromozome 13, 18, 21, X i Y.
Također je moguće "obojiti" cijele hromozome pomoću RIBA. Zahvaljujući tehnologiji spektralne kariotipizacije, koja koristi mješavinu različitih fluorohroma, sada je moguće kreirati jedinstveni fluorescentni uzorak za svaki pojedinačni hromozom sa 24 odvojene boje. Ova tehnologija omogućava otkrivanje složenih kromosomskih preuređivanja koji nisu vidljivi upotrebom tradicionalnih citogenetskih tehnika.
Metoda RIBA u prenatalnoj dijagnostici. Za starije žene reproduktivno doba Trudnoća može biti razlog ne toliko za radost koliko za zabrinutost. Starost žene povezana je s rizikom od razvoja fetalnih hromozomskih abnormalnosti. Amniocenteza, urađena u 16. sedmici trudnoće, praćena analizom kariotipa traje 10-14 dana. Upotreba FISH-a u preliminarnom pregledu može ubrzati dijagnozu i smanjiti vrijeme čekanja. Većina genetičara i laboratorija je mišljenja da FISH ne treba koristiti izolovano za donošenje odluka o daljem vođenju trudnoće. FISH metoda mora biti dopunjena kariotipskom analizom, a njeni rezultati moraju barem korelirati s patološkom slikom ultrazvučni pregled(ultrazvuk) ili biohemijski skrining korišćenjem krvi majke.
Genski sindromi sekvence također poznati kao sindromi mikrodelecije ili segmentna aneusomija. To su delecije susjednih fragmenata hromozoma, koje obično uključuju mnogo gena. Sindromi genske sekvence prvi put su opisani 1986. godine upotrebom klasičnih citogenetskih tehnika. Sada, zahvaljujući FISH-u, moguće je identificirati submikroskopske delecije na nivou DNK, što je omogućilo identifikaciju najmanjeg izbrisanog područja povezanog s razvojem određenog sindroma, nazvanog kritična regija. Jednom kada se identifikuje kritična regija za sindrom, često je moguće identifikovati specifične gene čije se odsustvo prepoznaje kao povezano sa sindromom. Nedavni priručnik o sindromima genske sekvence navodi 18 sindroma delecije i mikrodelecije povezanih sa 14 hromozoma. Neki od najčešćih sindroma genske sekvence i njihovi kliničke manifestacije date su u tabeli. 5-2.
Telomere- formacije koje pokrivaju krajeve dugih i kratkih krakova hromozoma. Sastoje se od ponavljajućih sekvenci TTAGGG i sprečavaju fuziju krajeva hromozoma jedan s drugim. Sonde telomera igraju važnu ulogu u prepoznavanju složenih translokacija koje se ne mogu odrediti tradicionalnim citogenetskim metodama. Osim toga, jedno od otkrića projekta Human Genome bila je činjenica da su regije hromozoma pored telomera bogate genima. Sada je pokazano da su submikroskopske subtelomerne delecije odgovorne za pojavu mnogih genetski uvjetovanih bolesti.
RIBA je jedno od najneverovatnijih "alata" molekularne biologije 21. veka. U preimplantacijskoj dijagnostici, FISH istraživačka tehnika se koristi za otkrivanje hromozomskih abnormalnosti ili poremećaja uparivanja hromozoma u ćelijama embrija koji je tek dobijen in vitro oplodnjom (IVF). Ako se ne otkriju anomalije ili znaci aneuploidije (poremećaj uparivanja, nedostatak parova hromozoma), onda se „umjetni” embrij smatra održivim. Može se ugraditi u matericu buduće majke.
RIBA također omogućava praćenje seksualnih karakteristika u hromozomskom setu embrija. To omogućava određivanje spola nerođenog djeteta i prije samog početka trudnoće (ako smatramo da počinje implantacijom vantjelesnog začeta embrija u matericu).
Šta je RIBA?
Skraćenica je skraćenica za: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, ili fluorescentna in-situ hibridizacija. Transkript, najvjerovatnije, neukom čitaocu ništa ne govori. Stoga ćemo analizirati složeni koncept u dijelovima, ostavljajući nedovoljno prevedeno “in-situ” za kraj.
Hibridizacija
U molekularnoj biologiji, ovaj izraz ima vrlo posebno značenje koje nema nikakve veze sa ukrštanjem vrsta u „običnoj“ biologiji.
Hibridizacija je molekularna genetska tehnika koja se koristi za procjenu stanja DNK i RNK stanica koje se proučavaju. Zasniva se na povezivanju pojedinačnih lanaca nukleinskih kiselina u jednu molekulu. Na ovaj način se provjerava komplementarnost (međusobna korespondencija) molekula ili njihovih fragmenata međusobno. Uz potpunu komplementarnost, lanci se lako i brzo spajaju u zajedničku molekulu. Sporo ujedinjenje ukazuje na nedovoljnu komplementarnost. Nekomplementarnost lanaca je upravo zbog hromozomskih abnormalnosti (kršenja redosleda hromozoma u određenim područjima), nesparenih hromozoma ili odsustva nekih parova.
„Alat“ za mjerenje komplementarnosti je temperatura na kojoj se lanci DNK hibridiziraju u zajednički molekul. Da biste to učinili, prvo morate zagrijati preparat nukleinske kiseline, a zatim ga, nakon što ga pomiješate sa drugim zagrijanim preparatom, ohladiti. Kada se zagrije, vodikove veze između DNK ili RNK lanaca nestaju i formiraju se jednolančani fragmenti molekula. Pomešani preparati dve DNK ili RNK (ili DNK - RNK) se hlade. Kada se ohlade, vodonične veze između komplementarnih baza se brzo obnavljaju i formira se jedan, hibridni molekul DNK (RNA ili DNK - RNA). Uz nedostatak komplementarnosti, proces traje duže, nekomplementarni fragmenti ostaju nepovezani. Posljedično, što je viša temperatura hibridizacije, to je hromozomska struktura stanica harmoničnija i ispravnija. Što je temperatura niža, to je više abnormalnosti u hromozomima. Na osnovu analize nekomplementarnih ostataka mogu se identifikovati specifične anomalije ili područja aneuploidije.
Fluorescentno označavanje
Za analizu komplementarnosti hibridizirajućeg molekula DNK (ili RNK) koriste se posebne genetske sonde (ili DNK sonde), koje, naravno, također nemaju mnogo zajedničkog sa svojim imenjacima koji se koriste, na primjer, u hirurgiji.
Genetske sonde su sintetizirane i posebno označene jednolančane DNK (rjeđe RNA) sa unaprijed određenim svojstvima komplementarnosti. Kada se hibridiziraju, spajaju se s određenim genetskim fragmentima, čime se potvrđuje njihova komplementarnost. Položaj sondi u hibridiziranoj molekuli ukazuje na normalnu ili defektnu strukturu originalnog kromosomskog materijala od kojeg je sastavljena ova "vještačka struktura".
Genetske sonde su posebno označene svetlećim (fluorescentnim) supstancama, što ih čini vidljivim pod sočivom posebnog fluorescentnog mikroskopa.
Upotreba različitih boja za nekoliko sondi omogućava istovremenu analizu različitih genetskih struktura, na primjer, da se identifikuju regioni hromozoma sa dva gena koji se nalaze jedan na drugom i druge anomalije.
Trenutno, u jednoj analizi, genetske sonde su označene sa pet do šest različitih boja, ponekad čak i sa sedam.
In-situ znači "kod kuće"
Originalna tehnika hibridizacije bila je glomazna. Ekstrahirana DNK je denaturirana u posebnim termalnim puferima i pomiješana u centrifugi s drugim denaturiranim fragmentima. Hibridizacija je takođe sprovedena u laboratoriji, „u hemijskoj posudi“.
Moderna tehnologija omogućava izvođenje analiza in situ, odnosno „na licu mjesta“, „kod kuće“, u originalnim genetskim strukturama, a ne u laboratorijski napravljenim preparatima. Predmet istraživanja bila su sama jezgra ćelija (izvučena tokom biopsije polarnih tela, blastomera i površinskih ćelija blastociste).
Posmatranje genetskog materijala direktno u jezgri ćelije ubrzava proces, čineći ga „čišćim“, slobodnim od vanjskih utjecaja i oštećenja, što nije isključeno u proizvodnji laboratorijskih lijekova.
Međutim, postoje problemi koji ukazuju na nepremostiva ograničenja ove metode. Jedna hibridizacija ne može "pokriti" cijeli skup hromozoma u ćelijama. Obično su potrebne dvije ili tri uzastopne hibridizacije, što omogućava proučavanje 12-15 parova hromozoma (a kod ljudi ih ima 23). Sposobnost dalje hibridizacije DNK lanaca postepeno se smanjuje nakon svake rehibridizacije. Ovo ne dozvoljava da se hibridizacija izvede "koliko puta se želi" za iscrpnu analizu istog genetskog materijala.