Ifa total at. Ispitivanje krvi metodom Ifa. ELISA za sifilis: metoda analize, interpretacija, razlozi lažno pozitivnih rezultata

Samoilikov Pavel Vladimirovič pripravnik Odeljenja za kliničku laboratorijsku dijagnostiku

Ruski državni medicinski univerzitet

Metode imunotestiranja se široko koriste u medicinska praksa. U svim oblastima savremena medicina korišteno imunotest, uglavnom u dijagnostičke i analitičke svrhe. Posebno je važno što omogućavaju identifikaciju bioloških komponenti (hormoni, enzimi, neuropeptidi, proizvodi imunog sistema, antigeni itd.) u niskim i vrlo niskim koncentracijama. Ovim metodama otkrivaju se svi proizvodi protiv kojih se mogu dobiti antitijela.

Imunološki test se zasniva na interakciji antigena (AG) i antitela (AT) koristeći različite opcije za obeležavanje jedne od komponenti (enzim, radionuklid, fluorescentna boja, itd.). Reakcija se procjenjuje automatski pomoću posebne opreme, što omogućava standardizaciju ovih metoda.

U zavisnosti od vrste oznake koja se koristi i uslova ispitivanja, imunotest se označava kao enzimski imunosorbentni test (ELISA), radioimuno test (RIA), imunofluorescentni i drugi. Kada se reakcije odvijaju u jednoj ili više faza, one se označavaju kao direktne ili indirektne. Važna je okolina u kojoj se reakcija odvija. Ako se reakcija provodi s reagensima fiksiranim na površini, tada se test označava kao čvrsta faza, na primjer ELISA (enzimski imunosorbentni test).

U ovom radu će se razmatrati samo enzimski imunotest – metoda koja se široko koristi u biologiji i medicini, kako praktična tako i fundamentalna.

ELISA se pojavila sredinom 60-ih i prvobitno je razvijena kao metoda za identifikaciju antigena u histološki uzorak, kao i za vizualizaciju precipitacijskih linija u imunodifuzijskom testu i imunoelektroforezi, a zatim se počeo koristiti za kvantitativno određivanje antigena i antitijela u biološke tečnosti. U razvoju metode su učestvovali E. Engvall i R. Pählman, kao i, nezavisno, W. Van Weeman i R. Schurs.

Slika 1. Osnovni princip ELISA.

1) Za identifikaciju antigena. 2) Za otkrivanje antitela.

Metoda se zasniva na specifičnom vezivanju antitela za antigen, pri čemu je jedna od komponenti konjugovana sa enzimom; kao rezultat reakcije sa odgovarajućim hromogenim supstratom nastaje obojeni proizvod čija se količina može odrediti spektrofotometrijski (slika 1).

Otkriće mogućnosti imobilizacije antigena i antitijela na različitim nosačima uz održavanje njihove aktivnosti vezivanja omogućilo je proširenje primjene ELISA-e u različitim poljima biologije i medicine.

Pojava monoklonskih antitijela doprinijela je daljem razvoju ELISA testa, što je omogućilo povećanje njegove osjetljivosti, specifičnosti i ponovljivosti rezultata.

Teoretski, ELISA se zasniva na podacima iz savremene imunohemije i hemijske enzimologije, poznavanju fizičko-hemijskih zakona reakcije antigen-antitelo, kao i na glavnim principima analitičke hemije. Osetljivost ELISA testa i vreme koje je potrebno određuju nekoliko glavnih faktora: kinetičke i termodinamičke karakteristike reakcije antigen-antitelo, odnos reagensa, aktivnost enzima i razrešenje metoda njegove detekcije. IN opšti pogled Reakcija antigen-antitijelo može se opisati jednostavnom shemom:

+[AG]↔[ATAG]

Raznolikost istraživačkih objekata od niskomolekularnih jedinjenja do virusa i bakterija, kao i neobično širok spektar zadataka povezanih sa različitim uslovima za korišćenje ELISA, određuju razvoj izuzetno velika količina varijante ove metode.

Bilo koja verzija ELISA-e sadrži 3 obavezne faze:

1. faza prepoznavanja ispitivanog jedinjenja od strane antitela koje je specifično za njega, što dovodi do stvaranja imunog kompleksa;

2. faza formiranja veze konjugata sa imunim kompleksom ili sa slobodnim mestima vezivanja;

3. faza pretvaranja enzimske oznake u snimljeni signal.

Klasifikacija ELISA metoda zasniva se na nekoliko pristupa:

1. Na osnovu vrste reagensa prisutnih u prvoj fazi ELISA, razlikuju se kompetitivne i nekonkurentne metode.

A) U kompetitivnoj ELISA testu, u prvoj fazi, sistem sadrži i analizirano jedinjenje i njegov analog, obeležen enzimom i takmiči se za specifična mesta vezivanja sa njim.

B) Nekonkurentne metode karakteriše prisustvo u sistemu u prvoj fazi samo analiziranog jedinjenja i za njega specifičnih centara vezivanja.

2. Sve ELISA metode se dijele na homogene i heterogene.

Ako se sva tri etapa ELISA odvijaju u rastvoru i između glavnih faza nema dodatnih koraka za odvajanje formiranih imunih kompleksa od neizreagovanih komponenti, metoda spada u grupu homogenih.

Osnova homogene ELISA, koja se po pravilu koristi za određivanje niskomolekularnih supstanci, je inhibicija aktivnosti enzima kada se kombinuje sa antigenom ili antitijelom. Aktivnost enzima se obnavlja kao rezultat reakcije antigen-antitijelo.

Kada se antitijelo veže za antigen koji sadrži enzimsku oznaku, aktivnost enzima je inhibirana za 95% u odnosu na supstrat visoke molekularne težine, što je posljedica sterične isključenosti supstrata iz aktivnog centra enzima. Kako se koncentracija antigena povećava, veže se više antitijela i ostaje više slobodnih konjugata antigen-enzim, sposobnih za hidrolizu supstrata visoke molekularne težine. Analiza se izvodi vrlo brzo, za jedno određivanje potrebno je 1 minut. Osetljivost metode je prilično visoka. Može se koristiti za određivanje supstance na nivou pikomola.

Heterogene metode karakteriše analiza u dvofaznom sistemu uz učešće čvrste noseće faze i obavezna faza odvajanja imunih kompleksa od neizreagovanih komponenti (ispiranje), koje se nalaze u različite faze(formirani imuni kompleksi su u čvrstoj fazi, a neizreagovani kompleksi su u rastvoru). Heterogene metode u kojima se formiranje imunoloških kompleksa u prvoj fazi događa na čvrstoj fazi nazivaju se metode čvrstog stanja.

Metode se klasifikuju kao homogeno-heterogene ako se u 1. fazi - formiranje specifičnih kompleksa javlja u rastvoru, a zatim se za razdvajanje komponenti koristi čvrsta faza sa imobilisanim reagensom.

3. Prema principu određivanja ispitivane supstance:

A) Direktno određivanje koncentracije supstance (antigena ili antitijela) prema broju veznih mjesta koja s njom djeluju. U ovom slučaju, oznaka enzima će se nalaziti u formiranom specifičnom AG-AT kompleksu. Koncentracija analita će biti direktno proporcionalna snimljenom signalu.

B) Određivanje koncentracije supstance razlikom ukupan broj vezna mjesta i preostala slobodna vezna mjesta. U tom slučaju će se koncentracija analita povećati, a snimljeni signal smanjiti, pa u ovom slučaju postoji inverzna ovisnost o veličini snimljenog signala.

Enzimi.

Enzimske oznake imaju izuzetno snažan katalitički učinak; jedna molekula enzima može reagirati s velikim brojem molekula supstrata. Stoga se enzim prisutan u malim količinama može identificirati i kvantificirati stvaranjem proizvoda i reakcijom koju katalizira. Još jedna prednost korištenja enzima kao oznaka je zbog prisutnosti u molekuli brojnih funkcionalnih grupa (sulfhidril, karboksil, tirazinski ostaci, itd.), preko kojih se molekuli liganda mogu kovalentno vezati.

Enzimski markeri koji se koriste u ELISA testu moraju imati sljedeća svojstva:

– visoka aktivnost i stabilnost enzima u analitičkim uslovima, kada je modifikovan iu konjugaciji sa antitelima ili drugim proteinima;

– prisutnost osjetljivih supstrata i jednostavnost metode za određivanje produkata ili supstrata enzimske reakcije;

– sposobnost prilagođavanja sistema supstrata daljem jačanju;

– odsustvo enzima i njegovih inhibitora u ispitivanoj biološkoj tečnosti.

Najmanje 15 različitih enzima se može koristiti u ELISA testu. Većina aplikacija, u skladu sa navedenim zahtjevima, pronašli smo peroksidazu hrena (HRP), alkalnu fosfatazu (ALP) i β-D-galaktozidazu (tabela 1). Sva tri su stabilna i katalizuju vrlo osjetljive reakcije. Osim toga, proizvodi koji nastaju reakcijama koje kataliziraju ovi enzimi, ovisno o korištenom supstratu, mogu se otkriti ne samo kolorimetrijskim metodama, već i fluorescentne metode. Drugi enzimi se koriste mnogo rjeđe. Ovo se objašnjava njihovom nižom specifičnom aktivnošću u odnosu na PC i AP.

Podloge.

Izbor supstrata prvenstveno je određen enzimom koji se koristi kao oznaka, budući da je reakcija enzim-supstrat vrlo specifična.

Osnovni zahtjevi za podlogu:

– obezbeđivanje visoke osetljivosti metode u detekciji enzima u konjugatu;

– formiranje dobro prepoznatljivih (na primjer, obojenih) proizvoda reakcije enzim-supstrat;

– podloga mora biti sigurna, jeftina, pristupačna i pogodna za upotrebu.

Tabela 1.

Enzimi i njihovi supstrati se najčešće koriste u ELISA testu.

Češće se koriste kromogeni supstrati, koji, kada se unište, formiraju obojenu tvar. Obećavajuće je korištenje visokoenergetskih supstrata – fluorescentnih, hemiluminiscentnih. Upotreba takvih supstrata omogućava teoretski povećanje osjetljivosti ELISA-e za dva reda veličine.

Antigeni i antitela.

AG i AT koji se koriste u ELISA-i moraju biti visoko pročišćeni i visoko aktivni. Osim toga, antigeni moraju imati visoku antigenost, optimalnu gustinu i broj antigenskih determinanti, stranost i homogenost. Mnogi sintetički i rekombinantni antigeni virusa i bakterija su se dobro pokazali kada se koriste u ELISA testu. Ovo je značajno povećalo specifičnost i reproduktivnost metode minimizirajući unakrsne reakcije.

Jedan od najvažnijih reagensa u ELISA testu su antitela. Osjetljivost ELISA-e ovisi o koncentraciji, aktivnosti i specifičnosti korištenih antitijela. Korištena antitijela mogu biti poli- ili monoklonska, različitih klasa (IgG ili IgM) i podklasa (IgGl, IgG2), antialotipska ili antiidiotipska. Kod niskog AT afiniteta, raspad AG-AT kompleksa dovodi do uklanjanja vezanog AG iz sistema. Osjetljivost i specifičnost metode se povećava kada se koriste monoklonska antitijela. U tom slučaju postaje moguće detektovati niske koncentracije AG (AT) u ispitivanim uzorcima.

Formiranje konjugata

Konjugat je antigen ili antitijelo označeno enzimskom oznakom. Formiranje konjugata je jedna od važnih faza ELISA.

Kada formirate konjugat, odaberite takav optimalna metoda uvođenje enzimske oznake tako da obje komponente konjugata zadrže svoju biološku aktivnost: enzim - sposobnost interakcije sa supstratom, i antigen ili antitijelo - antigenost i aktivnost vezanja antigena, respektivno. Prisustvo obilježenog, visoko pročišćenog antigena omogućava korištenje kompetitivnih metoda. U ovom slučaju, u završnoj fazi moguće je izmjeriti aktivnost konjugata koji nije povezan s imobiliziranim antitijelima, čime se izbjegava postupak ispiranja i analiza čini praktičnijom. Međutim, antigeni su različiti po svojim fizičko-hemijskim svojstvima i strukturi, što znači da ih je nemoguće razviti univerzalne tehnike da se dobije konjugat sa antigenom. U ovom slučaju, dobijanje konjugata antigen-enzim predstavlja poseban složen zadatak. Priprema obilježenih antitijela za ELISA metodički je pristupačnija.

Konjugacija enzima sa imunohemijski aktivnim proteinima vrši se različitim metodama: hemijskim umrežavanjem, kovalentnim vezivanjem molekula enzima za Ag ili AT i stvaranjem jedinjenja preko nekovalentnih veza, na primer, kada je veza između enzima a Ag ili AT se odvija imunološki, kroz interakciju antigen-antitijelo.

Najrasprostranjenije su kovalentne metode za pripremu konjugata. Izbor reakcije vezivanja određen je tipom funkcionalnih grupa dostupnih u datim proteinskim molekulima. Glutaraldehid, natrijum perjodat, itd. se koriste kao reagensi koji se koriste za uvođenje enzima u molekule antigena i antitela.

Postoje metode u jednom i dva koraka za dobijanje konjugata pomoću glutaraldehida. Mogu se formirati konjugati različitih veličina sa smanjenom enzimskom aktivnošću (15 - 60% slobodnog enzima). Dobijeni konjugat velike veličine može sterički ometati određivanje ispitivane tvari. Konjugati s relativno malom molekulskom težinom sastoje se od Fab fragmenta i jednog molekula enzima.

Kao rezultat dvostepene sinteze, koja se sastoji od postupne proizvodnje enzima prvo modificiranog agensom za umrežavanje, njegovog izolovanja, a zatim njegove naknadne interakcije s antigenom (antitijelom), molekule formiraju se homogeni sastavi koji sadrže 1-2 molekula enzima po molekuli imunoglobulina i održavaju visoku enzimsku i imunološku aktivnost. Međutim, broj takvih konjugata je mali (za peroksidazu hrena iznosi 5-10%).

Najveća praktična primena nađena je u metodi dobijanja konjugata imunoperoksidaze, zasnovanoj na oksidaciji ugljenohidratne komponente enzima natrijum perjodatom (vezivanje peroksidaze u konjugat dostiže 70-90% početne količine enzima).

Pouzdan konjugat mora imati sljedeća svojstva:

Visoka snaga antitijela i visok afinitet za antigen tako da se može koristiti u visokom razrjeđenju i na taj način smanjiti nespecifično vezivanje;

Dovoljna specifičnost u radnom razrjeđivanju;

Prevladavanje monomernih oblika nad polimernim, jer polimerni oblici imaju tendenciju da se nespecifično prianjaju na plastiku, što rezultira visokim pozadinskim nivoom reakcije;

Optimalni molarni omjer između enzima i antitijela (optimalni omjer je oko 1:1);

Dovoljna enzimska aktivnost konjugata. Ovo svojstvo je određeno uglavnom uslovima konjugacije i omjerom molekula enzima i antitijela u konjugatu.

Čvrsta faza

Kao čvrsta faza za ELISA test mogu se koristiti različiti materijali: polistiren, polivinil hlorid, polipropilen i druge supstance. Čvrsta faza mogu biti zidovi epruvete, 96 jažica i druge ploče, kuglice, perle, kao i nitroceluloza i druge membrane koje aktivno apsorbuju proteine.

Imobilizacija antigena ili antitijela na čvrstoj fazi moguća je na tri načina:

– pasivna adsorpcija, zasnovana na jakim hidrofobnim interakcijama između proteina i sintetičke površine;

– kovalentna vezanost za čvrstu fazu;

– imunohemijski, itd. (nekovalentno i neadsorpciono dodavanje).

Pasivna proteinska adsorpcija se široko koristi pri izvođenju ELISA na titracionim pločama i nitroceluloznim membranama. Pasivna adsorpcija slijedi princip zasićenja i korelira s molekulskom težinom adsorbirane tvari. Adsorpciona površina membrana različitih tipova (nitroceluloza, najlon, itd.) je 100-1000 puta veća od plastike.

Polisaharidi i visoko glikozilirani proteini često imaju nizak afinitet za polistiren. Za njihovu imobilizaciju potrebne su druge metode, kao što je kovalentno vezivanje pomoću glutaraldehida. Kovalentno vezivanje je efikasno kada se kao čvrsta faza koriste hidrofilne kuglice (agaroza) i polistiren.

Imunohemijske metode se zasnivaju na korišćenju prethodno adsorbovanih "zamki" antitela za imobilizaciju antigena ili antitela. Imunohemijski imobilisani antigen je 10 puta aktivniji od pasivno adsorbovanog antigena. Mogu se koristiti lektini ili proteini koji vežu imunoglobulin iz bakterija koji se lako adsorbiraju na plastiku ili druge hidrofobne površine, kao što je konkanavalin A (Con A) ili stafilokokni protein A. Con A je u stanju da imobilizira gp 120, protein HIV virusa.

Slobodna mjesta na površini čvrste faze koja nisu vezana za sorbirani agens mogu fiksirati druge molekule, uključujući konjugate, tokom testa, što dovodi do povećanja pozadinskog signala. Da bi se spriječilo nespecifično vezivanje, nakon imobilizacije, čvrsta faza osnovnog materijala se tretira supstancama koje su neutralne za test. Najpopularniji blokatori su goveđi serumski albumin (BSA), kazein itd. Izbor blokade i uslovi za ovu fazu zavise od vrste čvrste faze i osetljivosti sistema.

Trenutno se koristi veliki broj različitih sorti i modifikacija ELISA-e. Različite varijante enzim-vezanog imunosorbentnog testa (ELISA) postale su široko rasprostranjene.

ELISA u čvrstoj fazi je predložena 1971. Osnovni principi čvrste faze ELISA, bez obzira na modifikacije, su sljedeći:

1. U fazi 1 reakcije, antigeni ili antitela se adsorbuju na čvrstu fazu. U ovom slučaju, reagensi koji nisu vezani za čvrstu fazu lako se uklanjaju ispiranjem.

2. Test uzorak se inkubira u senzibiliziranim jažicama. Pozitivne kontrolne jažice sadrže standardne reagense. U tom slučaju na površini čvrste faze nastaju imuni kompleksi. Nevezane komponente se uklanjaju pranjem.

3. Kada se doda antitijelo-enzim ili konjugat antigen-enzim i veže za imobilizirani imuni kompleks, aktivno mjesto enzima ostaje dostupno za naknadnu interakciju sa supstratom. Inkubacija supstrata u jažice sa imobilisanim konjugatom dovodi do razvoja reakcije boje. Ova reakcija se može zaustaviti u željenoj fazi, težina bojenja se može procijeniti vizualno ili optičkom gustoćom.

Važna faza svake varijante analize čvrste faze je postupak ispiranja od nevezanih reagensa. Važno je ne samo isprati komponente fiksirane u čvrstoj fazi, već ukloniti reagense iz cijele dubine sloja. Ovo su faze analize koje zahtijevaju najviše vremena i rada. Uzorci se mogu isprati automatski pomoću posebnog uređaja - perača ili ručno pomoću višekanalne pipete. Za provođenje ELISA potrebno je:

– koriste se polistirenske tablete ili druge opcije čvrste faze;

– rastvor za pranje;

– konjugat (antigeni ili antitela obeleženi enzimima);

– mješavina korištenih supstrata;

– otopina za zaustavljanje (Stop reagens – otopina za zaustavljanje reakcije);

– uzorke koji se koriste za pozitivnu i/ili negativnu kontrolu;

– standardni antigen (za konstruisanje kalibracione krive);

– jednokanalne i višekanalne pipete;

– podloška (podloška);

– optički uređaj za određivanje optičke gustine test rastvora (ELISA čitač, čitač koji sekvencijalno fotometrira sve jažice);

– 5-100 µl biološkog materijala koji se proučava.

Direktna ELISA

1. Antigeni ili antitela (test materijal) se adsorbuju u jažice panela. Gore je navedeno da se antigeni značajno razlikuju po svojoj sposobnosti da se adsorbiraju na različitim vrstama plastike, ovisno o tome kojoj klasi tvari (proteini, ugljikohidrati ili lipoproteini) pripadaju. Često u direktnoj ELISA-i, antigen imobiliziran na čvrstoj fazi su ćelije i drugi korpuskularni antigeni.

Kontrola. Kao kontrola se koriste jažice sa adsorbovanim uzorkom pozitivne kontrole, koji obavezno sadrži željeni antigen, i negativnim kontrolnim uzorkom, koji očigledno ne sadrži antigen koji se proučava. Ako je dostupan pročišćeni standardni antigen, reakcija se izvodi u nekoliko razrjeđenja tako da se može konstruirati kalibracijska kriva.

2. “Blokirajte slobodna mjesta vezivanja koja ostaju na čvrstoj fazi koristeći BSA kazein i druge (da biste spriječili nespecifičnu sorpciju konjugata na čvrstoj fazi).

3. Enzimima obeležena antitela ili antigeni (konjugat) se dodaju u jažice i inkubiraju. Vezivanje konjugata za čvrstu fazu će se desiti samo ako su obe komponente sistema komplementarne. Nakon inkubacije s konjugatom, jažice se isperu, čime se uklanja nevezani dio konjugata.

4. Supstrat specifičan za korišćeni enzim se zatim dodaje u jažice i inkubira. Po dolasku optimalan nivo bojenjem u jažice pozitivne kontrole, enzimska reakcija se zaustavlja.

5. Obračunavanje reakcije. Prvo, rezultati reakcije se uzimaju u obzir vizualno. Za preciznije snimanje rezultata, intenzitet bojenja se procjenjuje pomoću ELISA čitača sa odgovarajućim svjetlosnim filterom. Na osnovu rezultata analize konstruisan je graf zavisnosti optičke gustoće od koncentracije (slika 2).

Slika 2. Direktna ELISA.

a) za identifikaciju antigena; b) za otkrivanje antitela.

Ova verzija ELISA obično se koristi za otkrivanje specifičnih antitijela. Standardni antigen se adsorbuje u jažice panela i inkubira sa uzorcima seruma ili drugog biološkog materijala dobijenog od pacijenta (likvor, pljuvačka, itd.). Specifična antitela vezana za antigen na čvrstoj fazi detektuju se upotrebom antiglobulinskog konjugata. U zavisnosti od svrhe analize, koriste se različiti antiglobulinski reagensi koji otkrivaju antitela svih izotipova, ili specifična za pojedine klase i podklase imunoglobulina. Glavna prednost metode je svestranost konjugata. Isti konjugat se može koristiti za otkrivanje ljudskih antitijela na širok spektar antigena u bilo kojem uzorku. Reakcija je metodološki jednostavna.

Glavne faze indirektne ELISA za određivanje antitijela:

1. Antigen se adsorbuje na čvrstu fazu, a zatim ispere da bi se uklonile nevezane komponente.

2. Blokirajte slobodne vezne stranice. Opran.

3. Ispitni materijal se dodaje u jažice, inkubira, a zatim se sprovodi postupak ispiranja. Paralelno se stavljaju uzorci sa pozitivnim i negativnim kontrolama.

4. Dodajte antiglobulinski konjugat u radnom razblaženju, inkubirajte i isperite nevezane komponente.

5. Supstrat se dodaje i inkubira. Kada se postigne optimalan nivo bojenja u jažicama pozitivne kontrole, reakcija se zaustavlja dodavanjem stop rastvora.

6. Izmjerite količinu produkta reakcije pomoću ELISA čitača (slika 3).

U optimalnim uslovima analize, metoda je vrlo specifična i osjetljiva. Omogućava detekciju nanogramskih količina antitijela u serumu ispitivanih pacijenata. Za postizanje zadovoljavajućih rezultata neophodna je standardizacija reagensa i metodoloških tehnika. Ova verzija ELISA-e se također može koristiti za testiranje monoklonskih antitijela.

Antigeni otkriveni upotrebom ovu opciju ELISA testovi moraju imati više epitopa sposobnih da vežu antitijela, ili moraju imati ponavljajuće, prostorno odvojene epitope iste specifičnosti.

Prilikom izvođenja ove verzije ELISA-e, visoko specifična poli- ili monoklonska antitijela adsorbirana na čvrstoj fazi inkubiraju se sa test uzorkom. Nakon postupka ispiranja, enzimski obilježena antitijela (konjugat) na isti antigen se dodaju u jažice i zatim se provode svi ostali stadiji reakcije. Efikasnost formiranja specifičnog kompleksa u svakoj fazi analize zavisi od konstante vezivanja reakcije antigen-antitelo.

Glavne faze analize:

1. Monoklonska antitijela ili afinitetno pročišćena poliklonska antitijela su imobilizirana na čvrstoj fazi.

2. Test uzorak se dodaje u jažice panela, a uzorak pozitivne kontrole i negativan kontrolni uzorak u različitim razblaženjima se postavljaju paralelno. Inkubirajte i operite.

3. Enzimima obeležena monoklonska ili poliklonska antitela – konjugat – se dodaju u jažice. Nakon inkubacije, vrši se pranje.

4. Supstrat se dodaje i inkubira. Reakcija se zaustavlja kada se postigne optimalno bojenje u jažicama pozitivne kontrole.

5. Snimanje rezultata na ELISA čitaču.

Glavna prednost metode je njena visoka osjetljivost, koja prevazilazi mogućnosti drugih ELISA shema (slika 4).

Slika 3. Indirektna ELISA za detekciju antitijela.

Ovaj test se zasniva na nadmetanju obeleženih (konjugat) i neobeleženih (test) antitela za vezivanje za antigen adsorbovan na čvrstoj fazi. Količina enzima vezanog za čvrstu fazu smanjit će se proporcionalno sadržaju slobodnih antitijela u smjesi. Za određivanje antigena koristi se ista opcija, ali se u ovom slučaju željeni antigen natječe sa obilježenim, standardnim antigenom za vezivanje za antitijela imobilizirana na površini čvrste faze.

Konkurentska metoda zahtijeva minimalan broj operacija, nisku potrošnju reagensa i može se lako automatizirati. Prilikom izvođenja kompetitivne ELISA za otkrivanje antitijela, bolje je koristiti označena monoklonska antitijela, tada se konjugat takmiči sa test uzorkom za jedan epitop antigena adsorbiran na čvrstoj fazi. Ova verzija ELISA se koristi za određivanje različitih jedinjenja, kao što su humani imunoglobulini, karcinoembrionalni antigen, insulin, itd. Omogućava otkrivanje antitela na dijagnostički značajne epitope infektivnih agenasa.

Glavne faze analize za identifikaciju antigena (slika 5):

1. Monoklonska antitela specifična za antigen koji se detektuju imobilizuju se na čvrstoj fazi.

2. Antigen označen enzimom i test uzorak se dodaju u jažice panela u poznatoj koncentraciji. Izvodi se inkubacija i pranje. Paralelno, pozitivne i negativne kontrole se postavljaju u susjedne jažice. Za konstruiranje kalibracije koristi se standardni neobilježeni antigen u različitim razrjeđenjima.

3. Dodajte supstrat, inkubirajte, zaustavite reakciju kada se razvije optimalno bojenje u jažicama pozitivne kontrole.

4. Obračunavanje reakcije na ELISA čitaču.

U ovom slučaju, količina antigena u uzorku za testiranje je obrnuto proporcionalna enzimskoj aktivnosti na čvrstoj fazi.

U ovoj verziji ELISA-e, antigen prisutan u uzorku za testiranje vezuje se za monoklonska antitijela označena enzimima i inhibira njihovu interakciju sa standardnim antigenom imobiliziranim na čvrstoj fazi. Prisustvo čak i tragova antigena specifičnog za konjugat u uzorku će inhibirati vezivanje obilježenih antitijela za imobilizirani antigen. Stepen inhibicije je direktno proporcionalan sadržaju antigena u rastvoru. Za kvantitativnu analizu, kalibraciona kriva se konstruiše korišćenjem serijskih razblaženja standardnog antigena. Glavne faze inhibitorne ELISA za detekciju antigena (slika 6).

1. Standardni antigen se adsorbuje u jažice panela. Radno razrjeđenje označenih antitijela se bira titracijom.

Slika 4. “Sendvič” verzija ELISA.

2. Predinkubacija konjugata se vrši u razblaženju koje prethodi radnom, sa razblaženjima test uzorka, standardnog antigena i pozitivnih kontrolnih uzoraka.

3. Smjesa se prenosi u otvore panela. Da bi se kontrolisalo 100% vezivanje, samo obeležena antitela se dodaju u nekoliko jažica, bez inhibitornog antigena. Paneli se inkubiraju, a zatim peru.

4. Dodajte supstrat.

5. Zabilježite rezultate.

Koncentracija antigena koji se određuje u uzorku za testiranje obrnuto je proporcionalna enzimskoj aktivnosti na čvrstoj fazi.

ELISA se može koristiti ne samo za određivanje rastvorljivog antigena ili antitijela, već i ćelija koje proizvode različite proteine.

1983. ELISA tehnologija je prilagođena za otkrivanje limfoidnih ćelija koje luče antitela ili antigene (npr. citokine) in vitro. Metoda se zove ELISPOT (enzyme-linked immunospot spot method). Osnovni princip metode:

1. Na površini polistirenske bušotine (za ćelijsku kulturu se koriste paneli sa 24 jažice), antigeni ili antitela se sorbuju, koja služe kao reagensi „zamke“.

2. Limfoidne ćelije koje se proučavaju se dodaju i uzgajaju nekoliko sati na 37°C, dajući im priliku da zauzmu određeno mjesto i vrše sekretornu funkciju. Antitijela ili antigeni koje luče takve ćelije hvataju se reagensima adsorbiranim na čvrstoj fazi.

3. Ćelije se uklanjaju pomoću rastvora za pranje sa deterdžentom koji lizira ćelije.

4. Područja akumulacije sekretornih produkata otkrivaju se dodavanjem enzimski vezanih antitijela (antiglobulinski reagens).

5. Doda se mješavina supstrata i agaroze (korišteni supstrati se moraju otopiti u agarozi i formirati nerastvorljive produkte reakcije), na površini čvrste faze se formiraju smeđe ili plave mrlje (ovisno o korištenim enzimima i supstratima), otkrivajući područja gdje se stanice nalaze bili locirani.

Dobijene mrlje se broje pod mikroskopom, to će biti broj ćelija koje izlučuju.

Nitrocelulozna membrana se može koristiti kao čvrsta faza.U ovom slučaju postoji niz prednosti: zbog visokog adsorpcionog kapaciteta NCM-a potrebna je znatno manja količina antigena koji se koristi kao reagens „zamka“; osim toga , nema potrebe za uključivanjem agaroze u supstrat.

Istovremenim određivanjem broja sekretirajućih ćelija i ukupne količine izlučenog antigena ili antitela u jažici, što je moguće pri upotrebi drugačijeg supstrata, moguće je odrediti količinu izlučene supstance po jednoj ćeliji.

Ova metoda se široko koristi za procjenu broja ćelija koje luče antigen zarobljene adsorbiranim antitijelima; koristi se za određivanje broja ćelija koje luče citokine (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-a) .

Kada se koriste antitijela visokog afiniteta, osjetljivost pojedinačnih varijanti ELISA je vrlo visoka i teoretski omogućava detekciju pojedinačnih molekula antigena, ali je u praksi osjetljivost ograničena brojnim faktorima: aktivnost enzima, intenzitet signala i metode snimanja signala. Sistemi za pojačavanje signala omogućavaju povećanje osjetljivosti različitih ELISA opcija. Pogledajmo neke od ovih sistema:

Zasnovan na interakciji avidin-biotin.

Molekuli biotinskog koenzima (mw 244 Da) konjugiraju se na antitijela pomoću biotinil-N-hidroksisukcimida. Mali molekul biotina se lakše vezuje za imunoglobulin ili drugi protein bez narušavanja njegovih imunoloških ili enzimskih svojstava. Enzim je u ovom slučaju povezan s glikoproteinom bjelance avidin. Afinitet vezivanja avidina za biotin je vrlo visok (konstanta disocijacije kompleksa je 10-15 mol), konjugat avidin-enzim je čvrsto fiksiran za kompleks antigen-antitijelo-biotin. Nakon dodavanja odgovarajućeg supstrata, produkt reakcije se određuje spektrofotometrijski ili intenzitetom luminiscencije.

Jedan molekul avidina sastoji se od četiri identične podjedinice i sposoban je za interakciju sa četiri molekula biotina, što mu omogućava da se koristi kao molekul za povezivanje između dva spoja koja sadrže biotin. U ovom slučaju, enzim je također biotiniliran, a avidin djeluje kao most, povezujući dva molekula koji sadrže ostatke biotina. U nastali kompleks antigen-antitijelo-biotin dodaju se slobodni avidin, a zatim biotinilirani enzim. Reakcija se uzima u obzir.

Protein avidin se može nespecifično adsorbirati na druge molekule, pa se sve više koristi drugi protein koji vezuje biotin, streptavidin, koji se nalazi u bakteriji Streptomyces avidinii. Streptavidin takođe formira jak kompleks sa biotinom i sastoji se od četiri identične podjedinice.

Upotreba avidin-biotin kompleksa može značajno povećati osjetljivost ELISA-e, budući da se pri sintetiziranju konjugata s jednom AT molekulom može vezati na desetine molekula biotina. Dobivanje konjugata (antitijela i enzima s biotinom) je prilično jednostavno i praćeno je minimalnim promjenama njihove imunološke i enzimske aktivnosti. Konjugati enzima sa biotinom mogu se koristiti kao univerzalni reagensi.

Upotreba hemiluminiscentnih reakcija.

Hemiluminiscentne reakcije se mogu koristiti za dobijanje signala u ELISA testu, što povećava osjetljivost metode i skraćuje vrijeme analize. Peroksidaza hrena se široko koristi kao oznaka u ELISA-i; različite hemiluminiscentne reakcije mogu se koristiti za njeno otkrivanje. Hemiluminiscentne reakcije temelje se na sposobnosti luminola da svijetli kada se oksidira vodikovim peroksidom. U direktnoj analizi, enzimska reakcija proizvodi vodikov peroksid i oksidira luminol; ovu reakciju katalizira peroksidaza hrena. Za pojačavanje signala koriste se različita jedinjenja, na primjer, luciferin, fenoli, u ovom slučaju se intenzitet luminiscencije povećava 10-100 puta, u nekim slučajevima i 500 puta (pojačana hemiluminiscentna analiza). Luminiscentni signal je vrlo stabilan, njegov nivo dostiže maksimum za 30 s (za poređenje: reakcija u boji sa OFD kao indikatorom se u potpunosti razvija tek za 30 min).

U indirektnoj analizi, antitijelo je označeno luminolom ili njegovim derivatima. Takva oznaka u slobodna država sposoban da se oksidira vodikovim peroksidom uz oslobađanje svjetlosti. Ako je formirao kompleks, gubi sposobnost oksidacije.

Zasnovan na kaskadnim sistemima.

Enzimski kaskadni sistemi se mogu koristiti za povećanje osjetljivosti ELISA. U ovom slučaju, prvi enzim vezan za antitijela proizvodi supstrat koji se može reducirati za drugi enzimski sistem. Drugi enzimski sistem može biti supstrat-ciklični ili redoksiciklični. U ovom slučaju, fosfo-glukoizomeraza, aldolaza i alkalna fosfataza mogu poslužiti kao oznake enzima. Konačni produkt reakcije se određuje vizualno ili spektrofotometrijski.

ELISA sistemi amplifikacije mogu postići visoku osjetljivost. Ovakvi ELISA sistemi se koriste za određivanje nivoa hormona (tireostimulišućih, progesterona itd.).

ELISA je našla široku primjenu u različitim područjima medicine i biologije zbog relativne jednostavnosti i visoke osjetljivosti metode. ELISA se uspješno koristi za:

Masovna dijagnostika zaraznih bolesti (detekcija različitih specifičnih antigena ili antitijela na njih);

Identifikacija i određivanje nivoa hormona i lijekovi u biološkim uzorcima;

Određivanje izotipova (IgG, IgM i drugih) antitijela protiv specifičnog antigena;

Identifikacija imunoloških kompleksa;

Identifikacija tumorskih markera;

Određivanje serumskih proteina (feritin, fibronektin, itd.);

Određivanje ukupnog IgE i specifičnih IgE antitijela;

Skrining na mioklonska antitijela;

Određivanje citokina u biološkim tekućinama.

Osetljivost metode

ELISA je zamijenila ranije široko korištenu kliničku praksu metode aglutinacije, precipitacije i RIA. U poređenju sa gore navedenim metodama, ELISA je manje radno intenzivna i oduzima manje vremena, a pogodna je za izvođenje veliki broj slični testovi.

ELISA kombinuje jedinstvenu specifičnost imunohemijskog testa sa visoka osjetljivost određivanje oznake enzima. Određuje se osjetljivost metode (osjetljivost označava minimalnu količinu antitijela ili antigena koja se može detektirati) sledeći faktori: afinitet antitijela, poželjna je upotreba monoklonskih antitijela; specifična aktivnost enzima; intenzitet signala; osjetljivost mjerenja signala. Različite opcije ELISA razlikuju se po svojoj osjetljivosti. Određene varijante čvrste faze ELISA omogućavaju detekciju pojedinačnih molekula u uzorku. Prosječna osjetljivost ELISA je 10-9 – 10-12 mol.

Galaktionov V.G. Imunologija. Izdavačka kuća Moskovskog univerziteta, 1998

Kishkun A.A. Imunološke studije i metode dijagnostike zaraznih bolesti u kliničkoj praksi. Medicinsko-informativna agencija, 2009

Kondratyeva I.A. Radionica o imunologiji. Tutorial za univerzitete. Akademija, 2004

Lefkovits I., Pernis B. Imunološke metode istraživanja. Svijet, 1988

Royt A., Brostoff D., Meil D. Imunology. Svijet, 2000

Sokolov E.I. Klinička imunologija. Medicina, 1998

Frimel G. Imunološke metode. Medicina, 1987

Khaitov R. M. Imunology. Medicina, 2000

Shigina Yu.V. Imunologija: Udžbenik. Izdavačka kuća RIOR, 2007

Yarilin A.A. Osnove imunologije. Medicina, 1999

S vremena na vrijeme liječnici propisuju ELISA testove; ne znaju svi šta je to. ELISA ima sljedeće dekodiranje - enzimski imunotest krvi. Takav test krvi pomaže razumjeti kako se tijelo bori protiv zaraznih bolesti i pokazuje fazu bolesti. Enzimski imunotest pomaže u procjeni zaštitne aktivnosti krvi, identifikaciji imunodeficijencije kod patologija povezanih s infekcijama, hormonalni problemi i tako dalje.

ELISA test krvi radi sa materijalom koji se uzima iz vene. Osim toga, sadržaj je dostupan za istraživanje staklasto tijelo, tečnost iz kičmena moždina, bris uretre ili cervikalni kanal. Za enzimski imunotest ELISA, tečnost koja okružuje fetus može se uzeti od trudnica.

U ovom slučaju, krv se može direktno testirati na ELISA pomoću različitih tehnika. Postoji direktan indirektna metoda, konkurencija i blokiranje. Kada se tijelo inficira nekim patogenim agensom, koji se zove antigen, imunološki sistem počinje proizvoditi specifična antitijela, na primjer, na hepatitis. Ova antitijela su usmjerena na "bavljenje" stranim agensima. Šta su antitela? To su posebni proteini koji mogu stupiti u interakciju s antigenima i formirati imunološke komplekse zvane antigen-antitijelo. Za otkrivanje ovih kompleksa odgovorna je ELISA dijagnostika. Da bi se otkrio antigen, u dobiveni uzorak krvi se dodaju antitijela ili se izvodi obrnuti postupak.

Pozitivan ELISA rezultat temelji se na reakciji imunog sistema i enzima. Pod uticajem prvog, infektivni agensi i ćelijski elementi se vezuju, drugi pomaže da se vizualizuje rezultat prvog. Imunološka reakcija uključuje kombinaciju antitijela i antigena. Kao rezultat ovog procesa formira se imuni kompleks. Sve ćelije imaju antigen na svojoj površini. Imunska ćelija sumnjivi se uhvati, a antigen, koji je fiksiran na površini, prolazi proceduru poređenja sa informacijom koja se „učitava“ u memoriju. Ako postoji podudaranje u opisu, tada se ćelija vraća kući, ali ako ne, onda dolazi do veze, za čije je stvaranje odgovorno antitijelo koje se pričvršćuje na površinu.

U međuvremenu, enzimska reakcija omogućava da se supstance transformišu u nove. Materijal je izložen enzimu. U ovom slučaju, enzimsku razliku osiguravaju različiti supstrati. Proizvod koji nastaje ovom reakcijom šalje se na određivanje količine patogena, čije se određivanje zasniva na gustini boje rastvora.

Karakteristike metode

Enzimski imunološki test krvi propisuje se kada je potrebno dijagnosticirati alergije i bolesti virusnog porijekla. Postoji i ELISA test za sifilis i niz drugih infekcija koje se prenose nezaštićenim seksualnim kontaktom. Ova dijagnoza postaje sve popularnija u odnosu na PCR. Činjenica je da PCR uključuje rad sa brisima. Za razliku od PCR-a, rezultati ELISA-e se mogu dobiti iz krvnih testova.

Osim toga, može se propisati analiza krvi metodom ELISA kada je potrebno utvrditi prisutnost imunodeficijencije, dijagnosticirati onkologiju, procijeniti koliko je učinkovito liječenje, odrediti nivo hormona i podvrgnuti preoperativnom pregledu u cjelini.

Ako uporedite ELISA studije, na primjer, s PCR-om, možete pronaći brojne prednosti. Glavna stvar je mogućnost kompletna dijagnostikačak iu najranijim fazama razvoja. Pored toga, rezultati ELISA-e pomažu u određivanju specifičnog stadijuma bolesti i stepena njenog razvoja.

ELISA test ima veću efikasnost u odnosu na PCR; osim toga, može se koristiti tokom trudnoće za otkrivanje spolno prenosivih bolesti. Svako ko je radio ovaj test može saznati koncentraciju TSH u krvnom serumu. Ovo je vrlo važno da se provjeri kakva je reakcija štitne žlijezde, ima li kvarova u njenom radu.

Međutim, polimeraza ima i dodatne prednosti. lančana reakcija, je brzina istraživanja, što znači brze rezultate. Doktori također cijene tačnost rezultata. Ako govorimo o spolno prenosivim bolestima, tada nivo dostiže 98 posto, kao što je slučaj sa koncentracijom TSH.

Naravno, postoje i neki nedostaci. Međutim, u ovom slučaju govorimo o indirektnim karakteristikama testa. Konkretno, govorimo o tome da je nemoguće isključiti moguće greške u određivanju standarda. Ponekad test koji je napravila apsolutno zdrava djevojka može pokazati lažno pozitivan rezultat, ili negativan u suprotnom slučaju. Međutim, klasifikacija psiholoških istraživačkih metoda u većini slučajeva takve nedostatke povezuje s nepravilnom pripremom ili kršenjem tehnike kojom je materijal prikupljen.

Izvršne karakteristike

Za ELISA analizu u većini slučajeva daje se krv. Prije davanja krvi važno je postiti najmanje osam sati i izbjegavati uzimanje niza lijekova koji utiču na rezultat testa. Govorimo o antihistaminicima i hormonalni lekovi utiče na funkcionisanje štitne žlezde. Osim toga, alkohol treba isključiti najmanje 24 sata. Osigurajte da ne pušite najmanje jedan sat prije davanja krvi. Iskrivljavanje rezultata je moguće i kod uzimanja opojnih supstanci.

Prije nego što pređemo na transkript, vrijedi spomenuti koje se metode mjerenja koriste za takav test. Rezultat testa će ukazati na antitijela ili imunoglobuline Ig. Oni misle na vrlo specifične proteine o kojima smo ranije govorili. B-limfociti su odgovorni za njihovu proizvodnju čim virusi, bakterije ili gljivice uđu u tijelo. Postoji pet vrsta imunoglobulina, označenih latiničnim pismom.

Njihove razlike su povezane s različitim molekularnim oblicima i masama. Imaju različite poluživote i uključeni su ili ne uključeni u infektivne procese na različite načine. Vremenski okvir unutar kojeg se mogu otkriti od trenutka nastanka infekcije također varira.

Ako klasificirate imunoglobuline koristeći molekularnu težinu kao osnovu, tada IgM ima najviše pokazatelje. Karakteristika ove vrste imunoglobulina je nemogućnost prolaska kroz placentnu barijeru. Ako se IgM otkrije u testu kod novorođenčeta, govorimo o prisutnosti infekcije u fetusu.

Velika većina ljudske krvi sadrži IgG imunoglobuline, od kojih je najmanje IgE. Govoreći o radu u okviru infektivnih procesa, posebnu pažnju treba obratiti na opcije A, M, G. IgE djeluje kao marker alergijske reakcije. IgD se nalazi samo u tkivima limfnih čvorova i krajnika. Ovo je važno sa stanovišta stvaranja lokalnog imuniteta.

Osim toga, analiza određuje antigene. Pod njima se podrazumijevaju tvari visoke molekularne težine, koje su poznate po svom organskom porijeklu. Posebno je riječ o uzročnicima infektivnih i drugih bolesti spektra. Osim toga, mislimo i na tvari koje signaliziraju različite promjene stanica koje su neizbježne kod brojnih bolesti. Indikovan je i imunološki kompleks, koji pokazuje kompleks antigen-antitijelo koji učestvuje u imunološkom procesu.

Obično vrijeme proizvodnje ovisi o specifičnoj laboratoriji koju ste kontaktirali. Neke laboratorije mogu dati rezultate u roku od dan ili dva, drugima je potrebno tjedan dana. Kašnjenja mogu biti posljedica potrebe da se akumulira određena količina seruma.

Utjecaj na rezultate i interpretaciju

Unatoč činjenici da se ELISA smatra jednom od najpopularnijih preciznim metodama provjere i greške se i dalje javljaju. Postupak uzimanja materijala, nepravilan transport i skladištenje materijala mogu uticati na ispravnost rezultata. Uzimanje lijekova, kao što je gore spomenuto, prisutnost skrivenih bolesti. Metabolički poremećaji ili imunodeficijencija također vam neće omogućiti da dobijete ispravne pokazatelje. U periodu života do godinu dana novorođenčad također može imati netačne pokazatelje. To je zbog činjenice da su majčina antitijela prisutna u tijelu.

Govoreći o dekodiranju, obrasci za analizu koriste pozitivan ili negativan predznak da naznače rezultate proračuna za svaku od klasa imunoglobulina. Sledeće su verovatne opcije.

Odsustvo otkrivenih IgG, IgA i IgM ukazuje na potpuni oporavak. Negativan rezultat za komponente kao što su IgM, IgA, IgG znači nedostatak imuniteta na infekcije.

Kombinacija pozitivnog i negativnog rezultata na IgG, IgA u kombinaciji sa pozitivnim IgM ukazuje na prisustvo infekcije u organizmu u akutni oblik. Pozitivan IgG rezultat u kombinaciji s negativnim pokazateljima za IgA i IgM odgovara periodu nakon vakcinacije ili sticanju imuniteta kao rezultat infekcije.

Kombinacija pozitivnog ili negativnog rezultata na IgG, IgA i negativnog nalaza na IgM ukazuje na prisustvo infekcije u njenom hroničnom toku. Pozitivan rezultat za tri komponente: IgG, IgM, IgA ukazuje na pogoršanje infekcije koja je bila u hronični oblik curenje. Pored direktnog pojašnjavanja klasa antitijela, u sklopu dešifriranja ELISA analize, doktor dobiva informacije o njihovim kvantitativnim pokazateljima. Važno je naglasiti da za dekodiranje treba biti odgovoran ljekar koji prisustvuje. Činjenica je da ga kombinacija nekih komponenti može navesti na razmišljanje o dobijenom lažnom rezultatu, što će dovesti do ponovnog polaganja testa. Nezavisno dešifriranje u ovom slučaju je beskorisno.

Laboratorijski testovi pomažu doktorima ne samo da identifikuju bolest, već i da utvrde sposobnost tijela da se odupre infekcijama. Osim toga, neki nam omogućuju da odredimo stadij patologije. Primjer takve studije je ELISA, koja se često koristi u dijagnostici.

ELISA metoda - šta je to?

Enzimski imunosorbentni test (ELISA) je laboratorijski test koji ima za cilj identifikaciju specifičnih proteina proteinske prirode za određene antigene u uzorku krvi. Od velikog značaja među brojnim antitijelima su imunoglobulini, koji mogu postojati kao dio imunokompleksa. Sintetiziraju se u tijelu kao rezultat neurohumoralnih reakcija imunog sistema nakon unošenja patogena u organizam.

Svaka vrsta patogenih ćelija kao odgovor proizvodi vlastita antitijela. Njihova detaljna dijagnoza i analiza pomažu da se direktno odredi vrsta patologije koja može biti prisutna u ljudskom tijelu, a da se ne manifestira. Enzimski imunosorbentni test otkriva skrivene, trome patoloških procesa, određuje njihovu fazu.

Šta pokazuje ELISA test?

Shvativši što znači pojam ELISA analiza i šta je to, potrebno je napomenuti glavnu dijagnostičku vrijednost studije. Ova metoda se koristi za utvrđivanje prisustva antigena infektivnog agensa i antitela u uzorku krvi, koji su rezultat aktivacije imunog sistema. Među važnim klasama antitela potrebno je izdvojiti IgA, IgM, IgG.

Enzimski imunosorbentni test se propisuje ako je neophodna diferencijalna dijagnoza ili konačna dijagnoza. Pomaže doktorima da identifikuju skrivene patologije. Osim toga, ELISA se također može propisati za procjenu nivoa imunološka reakcija nakon vakcinacije dan ranije. U većini slučajeva, ELISA test (ono što je gore opisano) propisuje se ako se sumnja na sljedeće vrste patologija:

hepatitis;
vodene kozice;
helmintiaze;
rubeola;
dječja paraliza;
herpes;

Osim toga, ELISA za određene vrste imunoglobulina može se obaviti i kada:

reumatoidni artritis;
sepsa;
hronični gnojni otitis;
upala pluća;
meningitis;
sinusitis;

Kako se izvodi enzimski imunotest?

Enzimski imunosorbentni test, ELISA, provodi se ispitivanjem uzorka prikupljene krvi. Mala količina krvnog seruma i pročišćenog antigena stavlja se na površinu unaprijed pripremljene posebne tablete. Njihovim povezivanjem pod mikroskopom se posmatra poreklo reakcije. Antigen i antitijelo istog tipa čine kompleks. Da bi se dijagnosticirala njegovo formiranje, provodi se dodatno bojenje. Na osnovu intenziteta bojenja koje se javlja donose se zaključci o koncentraciji imunoglobulina u uzorku krvnog seruma pacijenta.

ELISA test (već znate šta je to) je osjetljiv čak i na malu količinu imunoglobulina i ima visoku specifičnost. Kao rezultat toga, liječnici ga mogu koristiti za precizno razlikovanje bolesti od sličnih kliničku sliku. Sama procedura analize ne traje dugo, pa se rezultat studije može saznati istog dana. Ako je potrebna hitna dijagnoza, odgovor možete dobiti 2-3 sata nakon uzimanja krvi.

Enzimski imunološki test krvi - priprema

Metoda enzimskog imunotestiranja zahtijeva određenu pripremu od pacijenta prije nego što se provede. Materijal koji se proučava je venska krv. Uzima se isključivo ujutro, na prazan želudac. Prije zahvata pacijent mora izbjegavati emocionalno preopterećenje, stresne situacije, isključiti fizičku aktivnost. Da biste dobili objektivne rezultate istraživanja, prije poduzimanja ELISA testa na klamidiju i druge infekcije, morate:

Dan prije analize iz prehrane se isključuju masna hrana, dimljena hrana i alkohol.
Nemojte pušiti prije testa.
Poslednji obrok treba da se desi uoči testa sa intervalom od najmanje 8 sati pre očekivanog vremena ispitivanja.

Enzimski imunotest - prikupljanje materijala

Analiza pomoću ELISA uključuje uzimanje venska krv kao biomaterijal za istraživanje. Postupak se izvodi u laboratorijskim uslovima. Uzorak krvi od 5-10 ml uzima se iz kubitalne vene pomoću šprica za jednokratnu upotrebu. Često se koriste posebne vakuumske cijevi, nakon spajanja igle na koju krv automatski puni posudu. Dobijeni uzorak se na odgovarajući način označava i šalje na dalje ispitivanje. Najčešće se rezultat studije zna sljedećeg dana.

ELISA test krvi - objašnjenje

Tumačenje ELISA analize vrši isključivo specijalista. Ovo uzima u obzir rezultate drugih studija sprovedenih dan ranije. Vrijedi napomenuti da ELISA ima dvije modifikacije - kvalitativnu i kvantitativnu procjenu. Pozitivan rezultat kvalitativne ELISA procjene ukazuje na prisutnost u tijelu antitijela na određenu vrstu patogena. Nakon toga se dodjeljuje kvantitativna procjena koja ima za cilj utvrđivanje obima bolesti i stadijuma. Negativan test ukazuje na odsustvo patogena u tijelu bebe.

ELISA test negativan

Negativan rezultat testa ne ukazuje uvijek na odsustvo patologije. Dakle, ELISA test na sifilis može biti negativan u fazi remisije, kada je patogen u tijelu u niskoj koncentraciji nakon terapije. Uzimajući u obzir ovu opciju, liječnici nakon nekog vremena sprovode dodatna istraživanja. Osim toga, negativan rezultat može se primijetiti i nakon nedavne infekcije, kada tijelo još nije proizvelo antitijela u dijagnostičkoj koncentraciji.

ELISA test krvi pozitivan

Ako je rezultat testa pozitivan, utvrđuje se titar antitijela i njihova klasa. U većini slučajeva, za dijagnosticiranje infektivnih procesa, određuje se koncentracija IgG i IgM. Nastaju u različito vrijeme.

Sadržaj

Procijeniti sposobnost tijela da se odupre zarazne bolesti ili se koristi test krvi za određivanje faze patologije. ELISA metoda zauzima važno mjesto među laboratorijskim studijama, pomaže u sveobuhvatnom proučavanju aktivnosti zaštitna funkcija krvi, određuju imunodeficijencije kod zaraznih bolesti, bolesti krvi, hormonalnih, autoimunih procesa.

Šta je enzimski imunološki test krvi?

Ova metoda se odnosi na laboratorijska istraživanja, određuje prisustvo zaštitnih faktora krvi proteinske prirode (antitijela) na određene patogene agense (antigene). Enzimski imunosorbentni test otkriva imunoglobuline koji se mogu naći u obliku imunokompleksa. Pojavljuju se kada se pojave složene neurohumoralne reakcije imunološku odbranu ljudi, koji postaju odgovor na uvođenje stranih antigena.

Tijelo proizvodi specifična antitijela protiv svake vrste patogena. Zatim se patološki mikroorganizam ili antigen vezuje i formira se kompleksno jedinjenje "antigen-antitijelo". Zatim se neutralizira, dolazi do enzimske lize, dolazi do reakcije fagocitoze, a proces se završava uklanjanjem iz tijela. Prisutnost specifičnih kompleksa, utvrđenih ELISA-om, ukazuje na vrstu patogena ili štetne tvari kod pacijenta.

Klase imunoglobulina

Naučnici su otkrili i proučavali 5 vrsta imunoglobulina: IgE, IgD, IgG, IgM, IgA. Postoje i druge klase, ali one su još u fazi istraživanja i njihova uloga nije u potpunosti shvaćena. U praktičnoj medicini važni su A, M, G. Sadržaj informacija i tačnost određivanja zasniva se na vremenskim intervalima tokom kojih se pojavljuju, dostižu maksimum i nestaju.

Indikacije za testiranje krvi pomoću ELISA

Pomoću ove analize možete procijeniti učinkovitost liječenja, provesti sveobuhvatnu studiju prije transplantacije, utvrditi stanje imunodeficijencije i antitijela na više od 600 vrsta alergena. Testiranje krvi pomoću ELISA-e koristi se kao dodatni način za otkrivanje ćelija raka. Analiza se propisuje ako je potrebno otkriti antitijela na mikrobe koji izazivaju spolno prenosive patologije:

trihomonijaza;
sifilis;
toksoplazmoza;
mikoplazmoza;
ureaplazmoza.

U slučaju helmintičke infestacije, ELISA analiza će ukazati na povećanje količine imunoglobulina. Studije se provode kako bi se potvrdilo da li pacijent ima:

Epstein-Barr virus;
herpetične infekcije;
citomegalovirus;
grupa virusnih hepatitisa.

Enzimski imunološki test krvi nije jedina opcija za određivanje imunoglobulina. Ponekad se za ovu studiju pravi ograda cerebrospinalnu tečnost, staklasto tkivo, amnionska tečnost. Kada se koristi krv, ona se uzima iz antekubitalne vene pomoću injekcijske igle. Test se mora uraditi na prazan želudac, ne preporučuje se uzimanje prije ELISA testa. medicinski materijal, što može uticati na rezultat. Trebali biste odustati od alkohola, pušenja i upotrebe droga prije doniranja biomaterijala. Opcije rezultata testa:

Sa negativnim pokazateljima IgG imunoglobulini, IgM, IgA, doktori kažu da nema patologije ili početna faza. Isti rezultat (negativan) bit će nakon potpunog oporavka nakon dužeg perioda.
Ako je IgG pozitivan, ali IgM i IgA nisu otkriveni, to ukazuje na formiranje imuniteta nakon vakcinacije ili zaraznu bolest.
Sa visokim titarima IgM i negativnim IgA, IgG, postavlja se dijagnoza akutne zarazne bolesti.
Ako su IgG, IgM, IgA pozitivni, doktori govore o akutnoj fazi relapsa postojeće hronične bolesti.
Za hroničnu infekciju koja je u fazi jenjavanja (remisije), ELISA test pokazuje negativne titre IgM, dok će IgA i IgG biti pozitivni.

Prednosti i nedostaci ELISA analize

Glavni negativan aspekt ove studije je mogućnost dobijanja lažno pozitivnih ili lažno negativnih rezultata. Razlog nepouzdanosti je upotreba lijekova i tehnički nedostaci u laboratoriji. Proces metaboličkih poremećaja u organizmu može pogrešiti analizu. Glavne prednosti ELISA analize su:

tačnost, dijagnostička specifičnost;
niska cijena analize;
brzina dobijanja rezultata;
mogućnost dinamičkog praćenja stadijuma patologije i efikasnosti lečenja;
lakoća istraživanja;
mogućnost obavljanja masovnih pregleda žarišta infekcije;
bezbolnost, sigurnost za pacijenta;
primjena u obradi informacionih tehnologija.

Video

Enzimski imunološki test krvi je dijagnostička metoda koja se koristi za identifikaciju helminta kod djece i odraslih.

Indikacije za upotrebu

Ljekari propisuju ELISA za invaziju u sljedećim slučajevima:

broj leukocita kod pacijenta značajno premašuje normu u nedostatku simptoma drugih patologija;
muče ih česta vrtoglavica ili glavobolja bez očiglednog razloga;
javljaju se alergijske reakcije;
savladani bolovi u mišićima, gubitak snage;
kašalj ne zacjeljuje dugo vremena;
povremeno se javlja febrilno stanje;
prisutnost crva je otkrivena kod domaćih životinja;
epidemiološka situacija u regiji prebivališta se pogoršava;
Profesija pacijenta povezana je s visokim rizikom od infekcije crvima (provodi se rutinska dijagnostika).

probavni poremećaji s promjenama u stolici i njenoj učestalosti;
bol u stomaku;
kolike u predjelu jetre;
mučnina koja se pretvara u povraćanje;
znaci oštećenja centralnog nervni sistem: nesanica, povećana nervoza, oštre promjene raspoloženja.

Vrste ELISA

Enzimska reakcija vam omogućava da proučavate vrste helminta koje su identificirali laboratorijski asistenti uz vizualno mjerenje podataka o njima.

U laboratorijama se praktikuju različite vrste ELISA:

Kako to uzeti

Da bi rezultati istraživanja bili što pouzdaniji, moraju se striktno poštovati svi laboratorijski zahtjevi. potrebno:

3 dana prije davanja krvi prestati uzimati sve lijekove osim vitalnih;
obustaviti fizioterapeutske procedure 2 dana unaprijed;
odustati od alkohola i kafe 1 dan ranije;
da ne bude izložen dan ranije fizička aktivnost i emocionalni stres;
večerajte najkasnije do 19-20 sati (ujutru možete popiti malo vode).

Dekodiranje

Opcija #1. IgM-, IgA+, IgG-: primarna bolest (2 sedmice od trenutka infekcije).

Opcija #2. IgM+, IgA+, IgG-: primarna bolest (2,5-3 sedmice od trenutka infekcije).

Opcija #3. IgM+, IgA+, IgG+: primarna infekcija (3-4 nedelje od trenutka infekcije).

Opcija broj 4. IgM-, IgA+, IgG+: egzacerbacija hronična bolest(2 sedmice od početka egzacerbacije).

Opcija #5. IgM-, IgA+/-, IgG+: hronična faza.

Opcija broj 6. IgM-, IgA-, IgG+: izliječena (prošla) infekcija, prisustvo imuniteta.

Opcija br. 7. IgM-, IgA, IgG se ne otkrivaju (ili se titar smanjuje za 2-4 puta na kraju tretmana, za 5-8 puta 1-1,5 mjeseci nakon tretmana): oporavak.

Opcija br. 8. IgM-, IgA-, IgG-: nedostatak imuniteta na infekcije.

Prednosti i nedostaci

Izuzetno je rijetko da test daje lažno pozitivne ili lažno negativne rezultate. Ovaj nedostatak može biti uzrokovan tehničkim greškama. Ovakvi rezultati mogući su kod reumatoidnog faktora, metaboličkih poremećaja i dr. hronične bolesti, zbog čega se stvaraju zaštitna antitijela, kao i prilikom uzimanja određenih lijekova, poput inzulina.

ELISA metoda određuje:

trakavice (svinjska trakavica);
okrugli crvi (okali crvi, pinworms, Toxocara, strongyloiditis);
pljosnati crvi (cestode, metilji, nematode);
trihinela;
za okrugle gliste - 935 rubalja;
za toksoplazmu - 715-1000 rubalja.